CN106872592A - 一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于茶叶真伪判别技术领域,具体涉及一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法。其包括以下几个步骤:1)手性挥发性成分的对映异构体分离;2)待鉴定茶叶挥发性成分的提取;3)茶叶的真伪鉴别。采用本发明所述方法,可在绿色环保无污染的条件下快速鉴别出茶样的真伪,操作简便,无需精确定量,数据量化,在茶叶的真伪鉴别领域有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于茶叶质量真伪鉴别技术领域,具体涉及一种基于手性指纹数据库的茶叶快速鉴别方法。
背景技术
茶叶是世界上三大无酒精饮料之一,具有芬芳馥郁的香气,丰富甘醇的滋味,含有茶多酚、氨基酸等多种营养物质,并具有抗氧化、防辐射、抗菌及防癌等多种保健功能,得到了世界人民的广泛喜爱。由于各地的茶树品种以及加工工艺等因素的巨大差异,目前市面上流通的茶叶种类十分丰富,受欢迎程度也因人而异。近年来,随着消费水平的提高,茶产业得到了繁荣发展,各地对本土品牌的保护意识也日益加强,创建了不少以地名为商标的茶叶品牌,如福鼎白茶、云南滇红、英德红茶、西湖龙井、凤凰单枞及君山银针等。然而,由于采用类似加工工艺的茶叶往往在外观上都无明显差别,给了黑心商家可乘之机,低价收购次等茶叶并贴上品牌茗茶标签的现象屡见不鲜,给茶产业的发展造成了较大的阻碍,亟需一种可靠有效的鉴别手段来区分知名茶叶品牌的真伪。目前,主流的鉴别手段是感官审评技术,茶叶感官审评是审评员在规定的审评室内、利用规定的审评器具,通过自身的触觉、视觉、闻觉、味觉来审评茶叶的外形、汤色、香气、滋味、叶底,然后综合得分,判定茶叶的品质。然而,感官审评技术结果的可靠性除了受评茶人员本身素质水平和敏锐的审辨能力影响外,还受诸多外界客观因素的影响,很难在短时间内完成大批量茶样的检验工作,也难以提供一个统一的标准来判定茶叶的真伪。因此,在日益重视消费者权利及品牌保护意识的当前,急需一种简便、环境可适性强且结果客观准确的分析方法来实现茶叶的快速鉴别。
手性色谱分析技术是目前药物、生命科学与环境科学领域中的重要课题,是当前分离分析的热点,其原理是通过用手性固定相或在流动相中加入手性添加剂,来分离、分析样本中含有的对映异构体。近年来,来自食品或生命科学领域的大量研究表明,植物体或食品的重要手性化学成分的对映异构体比例与其品种、产地及加工方式等有密切的关系,目前已有国外的研究小组将手性分析技术运用于蜂蜜及精油等产品的溯源或真伪鉴别上。受此启发,可以采用手性色谱分析技术测定目标茶叶中某些重要化学组分的对映异构体组成比例,从而获得其特定的手性分布信息,组成手性指纹数据库,以实现快速鉴定茶叶真伪的目的。然而,由于手性分析技术在茶叶领域仍处于初步发展阶段,目前还未有采用该技术的茶叶真伪鉴别的相关的文献或专利报道。此外,虽然目前已有使用其它分析方法的茶叶真伪鉴别方法,但往往需要建立统计分析模型,模型需建立在大量的样本分析基础上,且需要多类别茶叶进行比较,通过大数据的差异性分析来判别茶叶的特征属性。相比之下,本发明所采用的手性分析方法,仅需知道茶叶中部分关键化合物的对映异构体比例值,即可快速判断出茶叶的真伪归属。
茶叶的宜人香气由成千上万种挥发性成分组成,大部分挥发性化合物在茶叶中的绝对含量很少,其总量一般只占干物质的0.01%~0.05%。萜烯醇类化合物如芳樟醇、芳樟醇氧化物、柠檬烯及松油醇等在大部分茶叶中具有较高的含量,在1克成茶样中可达到0.1-10μg,对成品茶香气品质的形成起着至关重要的作用。它们均含有手性结构,其对映异构体组成与茶叶的产地、品种及类别有着密切联系。因此,以上化合物是建立特征性手性指纹数据库的适宜研究对象。目前,在茶叶真伪鉴别领域还未有相关的研究或专利报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明旨在提供一种快速、直观的茶叶真伪鉴别方法。本发明采用手性色谱分析技术,无需精确定量,仅需查明茶叶中若干种挥发性成分的对映异构体比例关系,建立相应的手性指纹数据库,即可用于鉴别某些特定类别茶叶的真伪。目前经发明者验证,可用于福鼎大白茶、印尼白茶、英红九号、云南滇红及伯爵红茶等国内外著名茶叶的真伪鉴别。
本发明采用的技术方案如下:
所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征包括以下步骤:
1)手性挥发性成分的对映异构体分离
取芳樟醇、芳樟醇氧化物A、芳樟醇氧化物B、芳樟醇氧化物C、芳樟醇氧化物D、柠檬烯及α-松油醇各对映异构体或其混合物的标准品,用色谱级乙醚稀释,配制成100 ng/g的混合标准品溶液,建立混合标准品溶液的手性气相色谱法分析方法,并记录已分离化合物的保留时间及特征离子;
2)待鉴定茶叶挥发性成分的提取
采用顶空固相微萃取法提取茶叶的香气成分,并采用已建立的手性气相色谱法分析香气成分,对目标化合物进行定性,并计算相应的对映异构体过量值,即Ee值;
3)茶叶的真伪鉴别
将步骤2)获得的Ee值数据与已建立的手性指纹谱库比对,若数据超出数据库参考值范围则可鉴定为假冒产品。
所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤1)中手性气相色谱法分析方法具体包括:
仪器型号:Agilent 7890A-5975C气质联用仪;气相条件:CP7500CP-Cyclodextrin手性色谱柱;进样口温度为220 ºC,传输线温度为250 ºC;进样量为1.0 μL,分流进样,分流比为10:1;载气为纯度≥99.99%氦气,流速为1.2 mL/min;柱温箱采用程序升温:50 ºC保持2min,然后以2 ºC/min升到120 ºC保持10 min,再以4 ºC/min升到180 ºC保持5 min;质谱条件:电子轰击离子源;电子能量-70 eV;离子源温度220 ºC;质量扫描范围m/z 33-600 u。
所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤2)顶空固相微萃取法具体包括:
准确称取样品1.00 g至250 mL顶空萃取瓶中,加入5.0 mL沸水冲泡,放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min,然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取,萃取时间为30 min,取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min,同时启动仪器收集数据;
采用的对Ee值计算方法如下:
Ee % = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%;
式中:A1为目标化合物某一种特定的对映异构体的特征离子色谱峰面积,A2为另一对映异构体的特征离子色谱峰面积,所选特征离子为相应标准品质谱中丰度最高的离子;正负ee值代表了相反立体构型的目标化合物,ee值绝对值越高,代表A1对应的该立体构型的目标化合物在茶样中的比例也越高;当ee = 0% 时,代表两种异构体在茶样中的比例相同,为消旋体;反之,当ee =±100% 时,代表在茶样中仅存在单一立体构型的目标化合物。
所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤3)中建立的茶叶的手性指纹数据库包含福鼎大白茶、印尼白茶、英红9号、云南滇红和伯爵红茶,如下表所示:
注:当Ee>0%时,芳樟醇的主要构型为S构型;芳樟醇氧化物A的主要构型为(2S, 5S);芳樟醇氧化物B的主要构型为(2S, 5R);芳樟醇氧化物C的主要构型为(2S, 5R);芳樟醇氧化物D的主要构型为(2S, 5S);柠檬烯的主要构型为S构型;α-松油醇的主要构型为S构型。数据表中“-”表示该数据在相应茶类中与其它茶类无显著差异,或在该茶类中未被检出,可不做要求。
本发明的上述技术方案有以下几方面优点:1)在分析方法上首次将手性气相色谱技术运用于茶叶的真伪鉴别领域,无需全组分分析,仅需测定茶叶中7种标志性手性挥发性成分的对映异构体过量值,比对手性指纹数据库,即可有效鉴别出茶叶的真伪;2)排除了人为主观因素,提供统一量化数据,无需专业高端人才即可完成检验,大大降低鉴定成本;3)数据分析迅速便捷,无需繁琐统计分析软件,无需频繁校正数据。
附图说明
图1为混合茶样中挥发性成分的定性色谱图,其中A为混合茶样香气成分的总离子流图,B为柠檬烯对映异构体的特征离子提取色谱图,C为芳樟醇对映异构体的特征离子提取色谱图,D为芳樟醇氧化物A-B的特征离子提取色谱图,E为α-松油醇的特征离子提取色谱图,F为芳樟醇氧化物C-D的特征离子提取色谱图;
图2为福鼎白茶及对照茶样中柠檬烯的对映异构体过量值分布图;
图3为福鼎白茶及对照茶样中芳樟醇的对映异构体过量值分布图;
图4为福鼎白茶及对照茶样中芳樟醇氧化物A的对映异构体过量值分布图;
图5为福鼎白茶及对照茶样中芳樟醇氧化物B的对映异构体过量值分布图;
图6为福鼎白茶及对照茶样中芳樟醇氧化物C的对映异构体过量值分布图;
图7为福鼎白茶及对照茶样中芳樟醇氧化物D的对映异构体过量值分布图;
图8为福鼎白茶及对照茶样中α-松油醇的对映异构体过量值分布图。
具体实施方式
以下结合实例及附图来对本发明做进一步的解释说明。本实例仅用于具体说明该方法,而并非对本发明的范围进行限制,任何依照本发明的教导所做出的改动或改进,均属于本发明的保护范围。
实施例1:福鼎大白茶的手性指纹数据库建立
具体操作步骤:1)收集代表性福鼎大白茶20个,其它茶叶对照样本20个,且参照样本分别来自不同的品种、类别,种类丰富。
2)挥发性成分标准品的对映异构体分离
购买市售的R-芳樟醇、芳樟醇消旋体、呋喃型芳樟醇氧化物(A、B混合物)、吡喃型芳樟醇氧化物(C、D混合物)、R-α-松油醇、S-α-松油醇、R-柠檬烯及S-柠檬烯,以乙醚为溶剂,配成100 ng/g的混合标准品溶液,对上述标准品进行手性GC-MS分析,记录保留时间及相应特征离子峰。
分析方法如下:仪器型号:Agilent 7890A-5975C气质联用仪(美国Agilent公司)。气相条件:CP7500CP-Cyclodextrin手性色谱柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司);进样口温度为220 ºC,传输线温度为250 ºC;进样量为1.0 μL,分流进样,分流比为10:1;载气为高纯度氦气(纯度≥99.99%),流速为1.2 mL/min;柱温箱采用程序升温:50 ºC保持2 min,然后以2 ºC/min升到120 ºC保持10 min,再以4 ºC/min升到180 ºC保持5 min。质谱条件:电子轰击离子源;电子能量-70 eV;离子源温度220 ºC;质量扫描范围m/z 33-600u。
表1:挥发性化合物标准品的对映异构体分离
注:括号里的特征离子为相应化合物中丰度最高的离子,其提取离子峰面积用于测算Ee值。
3)茶叶中挥发性成分的手性GC-MS分析
采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)提取茶叶的香气组分,采用与标准品相同的GC-MS条件分析该香气组分。
顶空固相微萃取法条件:准确称取样品1.00 g至自制的250 mL顶空萃取瓶中,加入5.0 mL沸水冲泡,放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min,然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取,萃取时间为30 min,取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min,同时启动仪器收集数据。
4)福鼎大白茶的手性指纹数据库建立
选定目标化合物的两个对映异构体保留时间前后2分钟范围内的色谱峰段,提取表2中的特征离子,若所有的特征离子集中在某个波峰,则该峰可被鉴定为目标化合物,每个化合物在茶样里的定性色谱图如图1所示。20个福鼎大白茶样中柠檬烯、芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D及α-松油醇的Ee值通过下列公式计算获得:Ee (%) = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%;式中:A1为目标化合物某一种特定的对映异构体的特征离子色谱峰面积,A2为另一对映异构体的特征离子色谱峰面积(所选特征离子为相应标准品质谱中丰度最高的离子)。将获得的目标化合物的对映异构体过量值数据导入EXCEL表内,建立福鼎大白茶的手性指纹数据库,标准数据取自20个茶样的平均值,由于各台仪器的性能响应不一,在数值上会有一定偏差,因此选取的正负偏差应适当放宽(一般为±5-20%)。为了验证福鼎大白茶手性指纹数据库的准确性,也将对照茶样的数据导入EXCEL表内,并绘制柱状图,如图2-8所示,福鼎大白茶的柠檬烯、芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D以及α-松油醇的Ee值具有高度的一致性,且与其它对照茶样的相应数据有显著性差异,有力地证明了该手性指纹数据库的准确性高,特异性强。
实施例2-6:印尼白茶、英红9号、云南滇红以及伯爵红茶的手性指纹数据库建立
与实施例1类似,在此不再赘述。印尼白茶、英红9号、云南滇红以及伯爵红茶所建立的手性指纹数据如表2所示。
表2印尼白茶、英红9号、云南滇红以及伯爵红茶手性指纹数据
实施例7:实际样本(英红9号样本及伯爵红茶)的真伪鉴定
1)采用顶空固相微萃取法提取英红9号及伯爵红茶的香气成分,为保证数据稳定性,做技术重复3次。
2)根据芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D、柠檬烯及α-松油醇的特征离子峰,确定其出峰位置,并提取相表2中的选择离子测算两个对映异构体的峰面积,根据Ee (%) = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%计算出相应化合物的Ee值。实验结果如下表所示:
表3:待鉴定英红9号和伯爵红茶中手性挥发性成分的Ee值
3)英红9号及伯爵红茶的真伪鉴定
将获得的手性挥发性成分的Ee值与英红9号及伯爵红茶的手性指纹数据库里的参考值比对,发现待鉴定英红9号里的芳樟醇Ee值不在参考值范围之内,甚至主导的构型也相反,说明该英红9号为假冒或掺假产品;而伯爵红茶的各个指标均在库中参考值范围内,说明该伯爵红茶应该不属于假冒产品。
综上所述,采用手性气相色谱分析技术,无需精确定量,仅需与本发明建立的手性指纹数据库参考值比对,即可快速鉴别福鼎大白、印尼白茶、英红9号及伯爵红茶的真伪。若需鉴别更多其它类别茶叶,可以依照本发明的指导建立手性指纹数据库,均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征包括以下步骤:
1)手性挥发性成分的对映异构体分离
取芳樟醇、芳樟醇氧化物A、芳樟醇氧化物B、芳樟醇氧化物C、芳樟醇氧化物D、柠檬烯及α-松油醇各对映异构体或其混合物的标准品,用色谱级乙醚稀释,配制成100 ng/g的混合标准品溶液,建立混合标准品溶液的手性气相色谱法分析方法,并记录已分离化合物的保留时间及特征离子;
2)待鉴定茶叶挥发性成分的提取
采用顶空固相微萃取法提取茶叶的香气成分,并采用已建立的手性气相色谱法分析香气成分,对目标化合物进行定性,并计算相应的对映异构体过量值,即Ee值;
3)茶叶的真伪鉴别
将步骤2)获得的Ee值数据与已建立的手性指纹谱库比对,若数据超出数据库参考值范围则可鉴定为假冒产品。
2.根据权利要求1所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤1)中手性气相色谱法分析方法具体包括:
仪器型号:Agilent 7890A-5975C气质联用仪;气相条件:CP7500CP-Cyclodextrin手性色谱柱;进样口温度为220 ºC,传输线温度为250 ºC;进样量为1.0 μL,分流进样,分流比为10:1;载气为纯度≥99.99%氦气,流速为1.2 mL/min;柱温箱采用程序升温:50 ºC保持2min,然后以2 ºC/min升到120 ºC保持10 min,再以4 ºC/min升到180 ºC保持5 min;质谱条件:电子轰击离子源;电子能量-70 eV;离子源温度220 ºC;质量扫描范围m/z 33-600 u。
3.根据权利要求1所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤2)顶空固相微萃取法具体包括:
准确称取样品1.00 g至250 mL顶空萃取瓶中,加入5.0 mL沸水冲泡,放入50 ºC水浴锅平衡5.0 min,然后插入装有DVB/CAR/PDMS萃取头的手动SPME手柄在50 ºC水浴条件下顶空萃取,萃取时间为30 min,取出后立即插入GC-MS进样口中解吸附3.0 min,同时启动仪器收集数据;
采用的对Ee值计算方法如下:
Ee % = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%;
式中:A1为目标化合物某一种特定的对映异构体的特征离子色谱峰面积,A2为另一对映异构体的特征离子色谱峰面积,所选特征离子为相应标准品质谱中丰度最高的离子;正负ee值代表了相反立体构型的目标化合物,ee值绝对值越高,代表A1对应的该立体构型的目标化合物在茶样中的比例也越高;当ee = 0% 时,代表两种异构体在茶样中的比例相同,为消旋体;反之,当ee =±100% 时,代表在茶样中仅存在单一立体构型的目标化合物。
4.根据权利要求1所述的一种基于手性指纹数据的茶叶真伪快速鉴别方法,其特征在于:所述步骤3)中建立的茶叶的手性指纹数据库包含福鼎大白茶、印尼白茶、英红9号、云南滇红和伯爵红茶,如下表所示:
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