CN107991415A

CN107991415A - 用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18aa中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法

Info

Publication number: CN107991415A
Application number: CN201810042844.0A
Authority: CN
Inventors: 李莉; 张明; 马炳原; 秦雅茹; 乔萍; 张闯; 熊肖男
Original assignee: Kangda College Of Nanjing Medical University
Current assignee: Kangda College Of Nanjing Medical University
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2038-01-17
Also published as: CN107991415B

Abstract

本发明公开了一种用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法，所述方法是先将供试品溶液在高效液相色谱仪中测定，再按照标准曲线法以峰面积计算供试品中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的含量。本发明的检测方法简便可行，分析时间短，专属性强，重现性好，可以有效测定复方氨基酸注射液18AA中的焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质。

Description

用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法

技术领域

本发明涉及药物质量测定方法技术领域，尤其涉及一种用高效液相色谱仪同时分离检测复方氨基酸注射液18AA中谷氨酸降解杂质焦谷氨酸与甲硫氨酸降解杂质蛋氨酸亚砜的方法。

背景技术

复方氨基酸注射液18AA主要用于蛋白质摄入不足、吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要的患者，亦用于改善手术后病人的营养状况。复方氨基酸注射液18AA的飞速发展使得临床危重症患者得到良好的肠外营养支持，保证了机体的正氮平衡，促进了蛋白质的合成。随着公众和媒体对药品安全性的日益关注，药品中的杂质已成为药品质量控制中的重要指标。近年来，随着新的分析检测技术的问世和推广，药物中微量的有害物质正逐渐被阐明揭示其化学结构或物质基础，在杂质的安全性研究上也涌现了一些快速筛选平台，为今后产品的质量控制奠定了基础。将杂质水平与药物安全性的关联性研究透彻，这也是今后研究的方向之一。

由于缺乏发色团，氨基酸的纯度评估工作一直是个难题。在过去的欧洲药典中，氨基酸原料的杂质监控通常借助于茚三酮试剂显色的薄层色谱法，然而该方法的灵敏度和性能较差。在新版欧洲药典中氨基酸的杂质检验变更为离子交换柱后茚三酮衍生反应的分析方法(EDQM,European Pharmacopoeia 8th Edition,2015)。

焦谷氨酸(PGA)是谷氨酸在高温下脱水缩合而成的降解产物，具有一定的对谷氨酸等受体的阻断作用，也可能引起神经毒性和代谢异常。蛋氨酸亚砜(MSO)是甲硫氨酸的氧化杂质，对男性肝细胞具有一定的毒性损伤作用。

焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜两个杂质的存在对复方氨基酸注射液 18AA的临床用药安全构成了潜在的威胁。然而，通过文献检索，针对复方氨基酸药物制剂中的氨基酸降解杂质的研究却鲜有报道。仅有谢升谷等人报道了研究复方氨基酸注射液18AA中的降解杂质焦谷氨酸(药物分析杂志,2015,35(4),705-709)，但该方法并不能应用于同时分离检测焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜。同时分离检测复方氨基酸注射液18AA中的焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的检测方法并未见相关报道。

因此，需要一种科学、有效的同时分离测定复方氨基酸注射液 18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法，既可以降低检测成本、减轻劳动强度又节能环保。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下内容：

一种用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法，所述方法是先将供试品溶液在高效液相色谱仪中测定，再按照标准曲线法以峰面积计算供试品中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的含量；

色谱条件为：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A为0.01mol·L^-1磷酸氢二铵溶液，其中含0.015mol·L^-1庚烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节pH值至2.3±0.05；

流动相B为乙腈；

流动相洗脱程序：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0	100	0
13	100	0
			14	80	20
20	80	20
			21	100	0
30	100	0

流速为每分钟1.0ml；

检测波长为205nm；

柱温为4℃；

进样体积为100μl。

进一步地，所述色谱柱为Titank C18色谱柱；所述Titank C18色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

进一步地，所述方法中，供试品溶液是：取焦谷氨酸对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含焦谷氨酸1mg的对照品溶液，作为焦谷氨酸对照品贮备液；取蛋氨酸亚砜对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含蛋氨酸亚砜1mg的对照品溶液，作为蛋氨酸亚砜对照品贮备液；分别精密量取复方氨基酸注射液18AA、焦谷氨酸对照品贮备液、蛋氨酸亚砜对照品贮备液各 1ml，混合置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

进一步地，所述方法中，制备对照溶液，利用高效液相色谱仪对对照溶液进行检测，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线并得到回归方程；所述制备对照溶液是：精密量取焦谷氨酸对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每1ml中约含焦谷氨酸0.19、1、5、10、100和200μg的溶液，作为焦谷氨酸对照溶液；精密量取蛋氨酸亚砜对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每1ml中约含蛋氨酸亚砜0.08、1、5、10、100和200μg的溶液，作为蛋氨酸亚砜对照溶液。

本发明具有以下优点：

本发明的检测方法简便可行，分析时间短，专属性强，重现性好，可以有效测定复方氨基酸注射液18AA中的焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质，提供了现有技术未能解决的分离测定问题，能确保了复方氨基酸注射液18AA的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1是复方氨基酸注射液18AA的色谱图。

图2是供试品溶液的色谱图。

图3是蛋氨酸亚砜线性对照溶液(5)的色谱图。

图4是焦谷氨酸线性对照溶液(5)的色谱图。

图5是焦谷氨酸线性曲线图。

图6是蛋氨酸亚砜线性曲线图。

图7是正常条件下供试品溶液的色谱图。

图8是流速+10％条件下供试品溶液的色谱图。

图9是流速-10％条件下供试品溶液的色谱图。

图10是有机相比例+1％条件下供试品溶液的色谱图。

图11是有机相比例-1％条件下供试品溶液的色谱图。

图12是流动相pH值+0.05条件下供试品溶液的色谱图。

图13是流动相pH值-0.05条件下供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明具体实施方式中使用的试剂、药品、仪器设备均为已知产品，均可以通过购买市售产品获得。具体如下：

试剂与药品：

焦谷氨酸对照品(北京百灵威科技有限公司，批号：LE20R47)；

蛋氨酸亚砜对照品(arkpharminc，批号：WG0002486-160825001)；

复方氨基酸注射液18AA(辰欣药业股份有限公司，批号： 1611052143)；

乙腈(TEDIA，批号：AS1122-801)为色谱纯；

磷酸氢二胺(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170301)为分析纯；

庚烷磺酸钠(萨恩化学技术上海有限公司，批号：FC150216)为分析纯。

仪器设备：

Waters1525高效液相色谱仪；

上海雷磁台式精密数显PHS-3G酸度计；

十万分之一精密电子天平型号：AUW220D；

循环水真空泵型号：SHB-Ⅲ。

实施例1

一种用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法，包括以下步骤：

1)制备对照品贮备液：

取焦谷氨酸对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml 中约含焦谷氨酸1mg的对照品溶液，作为焦谷氨酸对照品贮备液。

取蛋氨酸亚砜对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml 中约含蛋氨酸亚砜1mg的对照品溶液，作为蛋氨酸亚砜对照品贮备液。

2)制备对照溶液

精密量取焦谷氨酸对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每1ml 中约含焦谷氨酸0.19、1、5、10、100和200μg的溶液，作为焦谷氨酸对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)。

精密量取蛋氨酸亚砜对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每 1ml中约含蛋氨酸亚砜0.08、1、5、10、100和200μg的溶液，作为蛋氨酸亚砜对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)。

3)制备供试品溶液

由于复方氨基酸注射液18AA样品中本身焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜两个杂质的含量非常小，不便于色谱条件的探索，为了便于考察色谱条件，供试品溶液按照如下方式配制：

分别精密量取复方氨基酸注射液18AA、焦谷氨酸对照品贮备液、蛋氨酸亚砜对照品贮备液各1ml，混合置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

4)测定

分别取焦谷氨酸线性对照溶液(1)～(6)、蛋氨酸亚砜线性对照溶液(1)～(6)和供试品溶液各100μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。典型图谱如图1～4所示。

色谱条件为：

色谱柱：Titank C18，4.6mm×250mm，5μm；

流动相A：0.01mol·L^-1磷酸氢二铵溶液(含0.015mol·L^-1庚烷磺酸钠缓冲溶液，用磷酸调节pH值至2.3±0.05)；

流动相B：乙腈；

按表1进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；

检测波长：205nm；

柱温：4℃；

进样体积：100μl。

表1梯度洗脱程序

图2中，保留时间为8.631分钟的为蛋氨酸亚砜，保留时间为 10.025分钟的为焦谷氨酸。蛋氨酸亚砜与焦谷氨酸之间的分离度为 2.3，且蛋氨酸亚砜与相邻峰、焦谷氨酸与相邻峰均分离良好。从图2 可以看出，在此条件下可以实现本发明的发明目的。

实施例2(线性范围)

按照标准曲线法以峰面积计算供试品中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的含量。

精密量取焦谷氨酸对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6) 以及蛋氨酸亚砜对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)和(6)各100μl，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，量取峰面积。以峰面积A 为纵坐标，进样浓度C为横坐标，进行线性回归，并计算相关系数 (r)。

表2焦谷氨酸线性与范围试验结果

表3蛋氨酸亚砜线性与范围试验结果

结果表明，焦谷氨酸在0.19～201.20μg·ml^-1的浓度范围内，线性曲线为A＝79315C-6236，r＝1(详见表2、图5)。蛋氨酸亚砜在 0.08～200.20μg·ml^-1的浓度范围内，线性曲线为A＝41954C+9010， r＝0.9995(详见表3、图6)。焦谷氨酸、蛋氨酸亚砜进样浓度与各自对应的峰面积响应值成显著的线性关系。

实施例3(精密度)

1、进样精密度：

精密量取焦谷氨酸对照品贮备液适量，用水稀释，制成每1ml中约含焦谷氨酸10μg的溶液，在实施例1的色谱条件下，连续进样6 次，焦谷氨酸峰面积的RSD为1.85％(表4)。

精密量取蛋氨酸亚砜对照品贮备液适量，用水稀释，制成每1ml 中约含蛋氨酸亚砜10μg的溶液，在实施例1的色谱条件下，连续进样6次，蛋氨酸亚砜峰面积的RSD为1.82％(表5)。由表4和表 5可知，重复性良好。

表4焦谷氨酸线性与范围试验结果

进样次序	峰面积
		1	623609.0
2	628198.0
		3	604374.0
4	625242.0
		5	632829.0
6	608092.0
		平均值	620390.7
RSD(％)	1.85

表5蛋氨酸亚砜线性与范围试验结果

进样次序	峰面积
		1	414488.0
2	400123.0
		3	404243.0
4	396034.0
		5	396617.0
6	395643.0
		平均值	401191.3
RSD(％)	1.82

2、重复性试验：

精密量取6份供试品溶液、焦谷氨酸对照溶液(1)、(2)、(3)、 (4)、(5)和(6)以及蛋氨酸亚砜对照溶液(1)、(2)、(3)、(4)、 (5)和(6)，并分别进行进样分析，测得焦谷氨酸平均含量为977.6μg·ml^-1，RSD为0.60％；蛋氨酸亚砜平均含量为968.0μg·ml^-1， RSD为1.06％(详见表6)。由表6可知，重复性良好。

表6重复性实验结果

实施例4(溶液稳定性实验)

将供试品溶液室温放置，分别于0、1、7、8、10、11、12、13、 14、22、23、24小时后测定，进样体积为100μl，用供试品溶液的主峰面积和含量考察供试品溶液的稳定性。实验结果见表7：

表7供试品溶液稳定性实验结果

由表7可知，供试品溶液在室温放置24小时内是稳定的。

实施例5(准确度：加样回收率实验)

分别精密量取复方氨基酸注射液18AA 1ml，置10ml量瓶中(配制9个)，再分别精密量取焦谷氨酸对照品贮备液、蛋氨酸亚砜对照品贮备液0.05ml、0.1ml、1.0ml各3份，加水稀释至刻度，摇匀，作为加样供试品溶液。精密量取焦谷氨酸线性对照溶液、蛋氨酸亚砜线性对照溶液和各加样供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以相应浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，按标准曲线法进行线性回归，计算。回收率结果见表8。

表8加样回收率试验结果(n＝9)

由表8可知，本方法中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜的回收率分别在 98.10～102.00％、92.73～100.83％之间，测定准确性良好。

实施例6(耐用性试验)

适当调节流动相的流速、流动相pH值以及有机相比例，将实施例1中的色谱条件进行较小幅度的变动，对比不同条件下同一样品中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜的测定结果，对该色谱条件的耐用性进行考察，结果见表9，色谱图见图7～图13。图2和图7本身是同一张图，只是图中的标示不同。图7是正常条件下供试品溶液的色谱图。图8 是流速+10％条件下供试品溶液的色谱图。图9是流速-10％条件下供试品溶液的色谱图。图10是有机相比例+1％条件下供试品溶液的色谱图。图11是有机相比例-1％条件下供试品溶液的色谱图。图12是流动相pH值+0.05条件下供试品溶液的色谱图。图13是流动相pH 值-0.05条件下供试品溶液的色谱图。

表9耐用性实验结果

从表9中可知，以流动相的流速、流动相pH值、以及有机相比例作微小改变后，焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜保留时间虽有微小变动，但测定结果基本一致，有关物质测定耐用性良好。

本发明的检测方法使用酸性离子对试剂及有机溶剂为流动相，并采用高效液相色谱法分离测定复方氨基酸注射液18AA中的焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质，可以在30分钟内同时分离焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质并进行检测，对于复方氨基酸注射液18AA药物的质量控制及氨基酸降解途径的研究十分有意义。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18AA中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法，其特征在于，所述方法是先将供试品溶液在高效液相色谱仪中测定，再按照标准曲线法以峰面积计算供试品中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的含量；

色谱条件为：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相B为乙腈；

流动相洗脱程序：

时间/min 流动相A/％流动相B/％ 0 100 0 13 100 0 14 80 20 20 80 20 21 100 0 30 100 0

流速为每分钟1.0ml；

检测波长为205nm；

柱温为4℃；

进样体积为100μl。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为TitankC18色谱柱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Titank C18色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，供试品溶液是：取焦谷氨酸对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含焦谷氨酸1mg的对照品溶液，作为焦谷氨酸对照品贮备液；取蛋氨酸亚砜对照品，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含蛋氨酸亚砜1mg的对照品溶液，作为蛋氨酸亚砜对照品贮备液；分别精密量取复方氨基酸注射液18AA、焦谷氨酸对照品贮备液、蛋氨酸亚砜对照品贮备液各1ml，混合置于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，制备对照溶液，利用高效液相色谱仪对对照溶液进行检测，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线并得到回归方程；所述制备对照溶液是：精密量取焦谷氨酸对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每1ml中约含焦谷氨酸0.19、1、5、10、100和200μg的溶液，作为焦谷氨酸对照溶液；精密量取蛋氨酸亚砜对照品贮备液适量，用水稀释，分别制成每1ml中约含蛋氨酸亚砜0.08、1、5、10、100和200μg的溶液，作为蛋氨酸亚砜对照溶液。