CN116626145A - 基于多反应监测的蛋氨酸亚氨基代砜的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了基于多反应监测的蛋氨酸亚氨基代砜的定量检测方法，其包括：确定蛋氨酸亚氨基代砜的目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)；采集所述样品的目标子离子的质谱响应信号。
Description
技术领域
本申请属于生物化学和分析化学领域，主要涉及基于质谱检测，特别是基于多反应监测的蛋氨酸亚氨基代砜的定量检测方法。
背景技术
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine，MSX)是重组技术药物生产过程中使用的筛选试剂，属于生产工艺相关的杂质。在产品生产过程中，应严格监测MSX杂质的工艺去除情况，并可在药品质量标准中严格规定该毒性杂质的含量。截至目前，针对可抑制谷氨酰胺合成酶(GS)基因表达的MSX，未见详细毒性数据报道，但来自化学物质毒性数据库(Chemical Toxicity Database)的数据表明，MSX具有生殖毒性，会影响胚胎和胎儿的生长发育，在重组技术药物生产过程中添加MSX会带来一定的安全风险。
由于MSX没有紫外吸收峰，导致目前MSX定量检测方法研究尚不完善，缺少通用性检测方法。有报道指出，柱前衍生高效液相色谱(HPLC)可对MSX残留进行检测，该方法虽然仪器成本较低，但样品前处理操作复杂，需要专门的衍生化试剂和衍生步骤，实验周期较长，灵敏度较低(定量限为约300 ng/mL)。此外，由于所用衍生化试剂(异硫氰酸苯酯)可以与氨基酸反应，导致专属性不强。
因此，建立一种高灵敏度、样品前处理简单、适用性强、专属性强的定量分析检测手段，用于生物技术药物生产过程MSX含量监测以及患者最终给药产品MSX残留的准确定量，显得尤为重要。
发明内容
本申请提供了基于质谱检测样品中蛋氨酸亚氨基代砜含量的方法，其包括：
确定蛋氨酸亚氨基代砜的目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)；
采集所述样品的目标子离子的质谱响应信号。
在一些实施方案中，所述方法还包括：基于测定不同浓度蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号所建立的标准曲线，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量；基于所测定的检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量是否低于检测限；或者基于所测定的单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量。
在一些实施方案中，所述质谱检测为多反应监测。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(179.564-182.564)/(100.598-103.598)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(179.564-182.564)/103.598、(179.564-182.564)/103.098、(179.564-182.564)/102.598、(179.564-182.564)/102.098、(179.564-182.564)/101.598、(179.564-182.564)/101.098、(179.564-182.564)/100.598、182.564/(100.598-103.598)、182.064/(100.598-103.598)、181.564/(100.598-103.598)、181.064/(100.598-103.598)、180.564/(100.598-103.598)、180.064/(100.598-103.598)、179.564/(100.598-103.598)、(180.564-182.064)/(101.598-102.098)、(180.564-182.064)/102.098、(180.564-182.064)/101.598、180.564/(101.598-102.098)、181.064/(101.598-102.098)、181.564/(101.598-102.098)、或182.064/(101.598-102.098)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为182.564/103.598、182.564/103.098、182.564/102.598、182.564/102.098、182.564/101.598、182.564/101.098、182.564/100.598、182.064/103.598、182.064/103.098、182.064/102.598、182.064/102.098、182.064/101.598、182.064/101.098、182.064/100.598、181.564/103.598、181.564/103.098、181.564/102.598、181.564/102.098、181.564/101.598、181.564/101.098、181.564/100.598、181.064/103.598、181.064/103.098、181.064/102.598、181.064/102.098、181.064/101.598、181.064/101.098、181.064/100.598、180.564/103.598、180.564/103.098、180.564/102.598、180.564/102.098、180.564/101.598、180.564/101.098、180.564/100.598、180.064/103.598、180.064/103.098、180.064/102.598、180.064/102.098、180.064/101.598、180.064/101.098、180.064/100.598、179.564/103.598、179.564/103.098、179.564/102.598、179.564/102.098、179.564/101.598、179.564/101.098、或179.564/100.598。
在一些实施方案中，所述质谱检测使用的质谱仪为串联质谱仪或可实现串联功能的质谱仪。
在一些实施方案中，所述串联质谱仪为三重四级杆串联质谱仪、四级杆-飞行时间串联质谱仪、四级杆-线性离子阱串联质谱仪、四级杆-Orbitrap质谱仪、离子阱-Orbitrap质谱仪、四级杆-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、或具有多反应监测功能的其他质谱仪。
在一些实施方案中，所述方法还包括在进行质谱检测前，使用液相色谱对所述样品中的蛋氨酸亚氨基代砜进行分离。
在一些实施方案中，所述液相色谱为亲水相互作用色谱、反相色谱、正相色谱、离子色谱、体积排阻色谱或亲和色谱。
在一些实施方案中，所述液相色谱为亲水相互作用色谱。
在一些实施方案中，所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，其中所述流动相A为0.1%甲酸/水，和/或所述流动相B为乙腈。
在一些实施方案中，所述液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱，并且梯度洗脱的程序如下：
0.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
0.5 min 流动相A 30% 流动相B 70%
8.0 min 流动相A 35% 流动相B 65%
8.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
10 min 流动相A 30% 流动相B 70%。
附图说明
图1显示了MSX专属性LC-MS图谱；
图2显示了MSX检测限样品LC-MS图谱；
图3显示了MSX标准曲线图；
图4显示了MSX加标回收率样品LC-MS图谱。
具体实施方式
本申请的发明人针对MSX分子的特性，通过优化质谱(例如母离子/子离子对的质荷比(m/z))和液相色谱参数建立了基于质谱检测(例如多反应监测)的MSX分子的定量检测方法，可以用于生物药中MSX极低残留的检测和重组技术药物生产过程中MSX含量监控和患者最终给药产品的残留定量检测。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的生物化学和分析化学技术。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
如本文所用的“亲水相互作用色谱(HILIC)”的固定相具有强亲水性，由未键合硅胶、极性键合相、极性聚合物填料、两性离子和离子交换剂组成，它们都容易将水层吸附到颗粒表面以促进分配。该分配随后在表面的固定水与驱动保留的本体流动相之间进行。在本申请的一些实施方案中，本发明在液相分离模式选择上，综合考虑了MSX的化合物性质、可与质谱联用(HILIC流动相不会干扰质谱信号)、分离时间长短以及操作过程是否方便等特点，最终选择了HILIC分离模式。
本申请提供了基于质谱检测样品中蛋氨酸亚氨基代砜含量的方法，其包括：
确定蛋氨酸亚氨基代砜的目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)；
采集所述样品的目标子离子的质谱响应信号。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于测定不同浓度蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号所建立的标准曲线，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量。在一些实施方案中，当待测样品中蛋氨酸亚氨基代砜含量无法预估或者多个样品的含量跨度很大时，需要通过建立标准曲线进行含量确定。
在一些具体实施方案中，用于建立标准曲线的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的浓度范围为1.75-21 ng/mL。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于所测定的检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量是否低于检测限。在一些实施方案中，若待测样品中存在痕量的蛋氨酸亚氨基代砜，则仅需测定检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，而无需建立标准曲线；若待测样品中的蛋氨酸亚氨基代砜的所述目标子离子的质谱响应信号低于检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，则确定待测样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量低于检测限。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于所测定的单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量。在一些实施方案中，通过测定单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，然后根据获得的单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品与待测样品的质谱响应信号，以及单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的已知含量，则可以确定待测样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量，而无需建立标准曲线。在一些实施方案中，当可以预估待测样品中的蛋氨酸亚氨基代砜的含量时，可以通过测定预期的单个或多个目标浓度(例如接近预估的待测样品中的蛋氨酸亚氨基代砜的浓度)的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值来确定待测样品中的蛋氨酸亚氨基代砜的含量。
在一些实施方案中，采用与确定所述样品的目标子离子的质谱响应信号相同的方法测定不同浓度蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号以建立标准曲线。
在一些实施方案中，采用与确定所述样品的目标子离子的质谱响应信号相同的方法测定检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值。
在一些实施方案中，采用与确定所述样品的目标子离子的质谱响应信号相同的方法测定单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值。
在一些实施方案中，所述目标子离子的质谱响应信号为MSX特征子离子峰的峰面积。
在一些实施方案中，所述质谱检测为多反应监测。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(179.564-182.564)/(100.598-103.598)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(179.564-182.564)/103.598、(179.564-182.564)/103.098、(179.564-182.564)/102.598、(179.564-182.564)/102.098、(179.564-182.564)/101.598、(179.564-182.564)/101.098、(179.564-182.564)/100.598、182.564/(100.598-103.598)、182.064/(100.598-103.598)、181.564/(100.598-103.598)、181.064/(100.598-103.598)、180.564/(100.598-103.598)、180.064/(100.598-103.598)、或179.564/(100.598-103.598)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为182.564/103.598、182.564/103.098、182.564/102.598、182.564/102.098、182.564/101.598、182.564/101.098、182.564/100.598、182.064/103.598、182.064/103.098、182.064/102.598、182.064/102.098、182.064/101.598、182.064/101.098、182.064/100.598、181.564/103.598、181.564/103.098、181.564/102.598、181.564/102.098、181.564/101.598、181.564/101.098、181.564/100.598、181.064/103.598、181.064/103.098、181.064/102.598、181.064/102.098、181.064/101.598、181.064/101.098、181.064/100.598、180.564/103.598、180.564/103.098、180.564/102.598、180.564/102.098、180.564/101.598、180.564/101.098、180.564/100.598、180.064/103.598、180.064/103.098、180.064/102.598、180.064/102.098、180.064/101.598、180.064/101.098、180.064/100.598、179.564/103.598、179.564/103.098、179.564/102.598、179.564/102.098、179.564/101.598、179.564/101.098、或179.564/100.598。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(180.564-182.064)/(101.598-102.098)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为(180.564-182.064)/102.098、(180.564-182.064)/101.598、180.564/(101.598-102.098)、181.064/(101.598-102.098)、181.564/(101.598-102.098)、或182.064/(101.598-102.098)。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为182.064/102.098、182.064/101.598、181.564/102.098、181.564/101.598、181.064/102.098、181.064/101.598、180.564/102.098、或180.564/101.598。
在一些实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为182.064/102.098、181.564/102.098、181.064/102.098、181.064/101.598、或180.564/102.098。
在一些具体实施方案中，所述目标母离子/子离子对的质荷比(m/z)为181.064/102.098。
在一些实施方案中，所述质谱检测使用的质谱仪为串联质谱仪或可实现串联功能的质谱仪。
在一些实施方案中，所述串联质谱仪为三重四级杆串联质谱仪、四级杆-飞行时间串联质谱仪、四级杆-线性离子阱串联质谱仪、四级杆-Orbitrap质谱仪、离子阱-Orbitrap质谱仪、四级杆-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、或具有多反应监测功能的其他质谱仪。
在一些实施方案中，所述质谱仪的去簇电压为80V。
在一些实施方案中，所述质谱仪的碰撞电压为15V。
在一些具体实施方案中，所述质谱仪的参数设置如下表所示：
。
在一些实施方案中，所述方法还包括在进行质谱检测前，使用液相色谱对所述样品中的蛋氨酸亚氨基代砜进行分离。
在一些实施方案中，所述液相色谱为亲水相互作用色谱、反相色谱、正相色谱、离子色谱、体积排阻色谱或亲和色谱。
在一些具体实施方案中，所述液相色谱为亲水相互作用色谱，例如ACQUITY UPLCGlycan BEH Amide Column, 130Å, 1.7 µm, 2.1 mm × 150 mm (美国Waters公司，货号：186004742)。
在一些实施方案中，所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，其中所述流动相A为0.1%甲酸/水，和/或所述流动相B为乙腈。
在一些实施方案中，所述液相色谱的色谱柱温度为30-35℃，例如30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35℃，或上述任意两个数值之间的范围或数值。
在一些实施方案中，所述液相色谱的色谱柱温度为35℃。
在一些实施方案中，所述液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱，并且梯度洗脱的程序如下：
0.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
0.5 min 流动相A 30% 流动相B 70%
8.0 min 流动相A 35% 流动相B 65%
8.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
10 min 流动相A 30% 流动相B 70%。
在一些实施方案中，在所述液相色谱的洗脱中，0.5 min之前为柱子平衡时间(延长或缩短，不会影响MSX检测)，8.0 min之后为柱子冲洗干净的时间。
在一些实施方案中，所述液相色谱的参数设置如下表所示：
。
在一些实施方案中，向待检测样品中加入乙腈，混匀离心，取上清液进行液相色谱分离。
在一些实施方案中，MSX经过HILIC分离后直接进入质谱进行检测。在一些实施方案中，MSX的出峰时间为3.5min。
在一些实施方案中，所述方法的检测灵敏度为1.75 ng/mL。
在一些实施方案中，本申请的方法具有以下优点中的至少一种：
选择了具有MSX特征性、高响应性的母离子/子离子对；
通过母离子和子离子的两次选择，去除了干扰离子，专属性强；
提高了检测灵敏度，可达1.75ng/mL；
与目前报道的定量分析方法相比，灵敏度提高了100倍以上；
简化了上机前的样品处理步骤(例如不超过15min)，无需专门衍生化试剂和衍生步骤；
仪器分析时间短(例如10min)。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1. MSX目标母离子/子离子对质荷比(m/z)的确定
MSX的分子式为C5H12O3N2S，平均分子量为180.23 Da，分子结构如下所示：
。
根据MSX分子结构式，可推测母离子单同位素峰理论质荷比(m/z)是181.064，通过实验探索，可获得MSX相应的碎片离子，推测该碎片离子(子离子)单同位素峰理论质荷比(m/z)为102.098。对不同母离子/子离子对的质荷比组合形式进行了质谱响应值实验，结果如下表1所示。结果表明，母离子/子离子对的质荷比(m/z)设定为181.064/102.098时，质谱响应值最高，即该分析方法的灵敏度最高。
表1
。
实施例2. 待测样品中MSX含量的测定
亲水相互作用色谱流动相A的配制：量取500 mL超纯水，向其中加入500 μL甲酸，摇匀后室温放置备用；流动相B的配制：量取500 mL乙腈，室温放置备用。
MSX储存液配制：称取18.0 mg MSX，溶于1 mL水中。
MSX工作液配制：取100 µL的100 mM MSX储存液至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，取400 µL至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得到浓度为72 ng/mL的MSX工作液。
灵敏度(检测限)样品溶液配制：取72 ng/mL MSX工作液，按下表2进行梯度稀释，获得一系列梯度稀释样品，其中1.75 ng/mL作为灵敏度样品。
表2
。
标准曲线配制：取上述表格中的1.75、3.5、7、14和21 ng/mL的MSX进行质谱检测以建立标准曲线，用于待测物样品中MSX含量的计算。
加标回收率样品溶液配制：取50 µL某待测样品(MSX未检出)，加入50 µL MSX工作液，混匀，MSX加标理论浓度为36 ng/mL。
MSX回收率计算公式为：MSX回收率=(加标回收率样品MSX响应值-待测样品MSX响应值)/理论MSX响应值(36 ng/mL)。
样品处理：取待测样品溶液、检测限样品溶液和加标回收率样品溶液，加入乙腈，混匀离心，取上清液，上机检测。
亲水相互作用色谱仪参数设置如下表3所示：
表3
。
质谱仪参数设置如下表4所示：
表4
。
由于MSX没有紫外吸收，所以图谱都是LC-MS图谱，即质谱信号图。对72 ng/mL的MSX工作液进行检测，工作液经过HILIC分离后直接进入质谱进行检测，出现了MSX特征子离子峰，出峰时间为3.5 min(图1)。
MSX工作液在不同稀释倍数条件下，可获得不同的响应值和信噪比。其中，灵敏度样品(1.75 ng/mL) MSX响应值(即MSX特征子离子峰的峰面积)为2500，s/n值为13.30 (图2和表5)。
将上述MSX工作液不同稀释倍数样品进行标准曲线拟合，以响应值为纵坐标，MSX浓度为横坐标，建立标准曲线(y=1225.7x-828.87，R2=0.99029；其中y为响应值，x为MSX浓度，单位ng/mL)(图3)。当进行待测物样品含量检测时，在获得待测物MSX响应值后，代入公式回算，即可根据此标准曲线计算出待测物中MSX的含量。
表5
。
图4的结果显示，对于加标回收率样品，回收率为103%，证明了采用质谱检测MSX含量的方法具有很高的准确性。待测样品中未检测到明显的MSX特征子离子峰，说明待测样品的MSX含量低于检测限1.75 ng/mL。
在本申请中提及和/或列出的所有专利、专利申请公开和非专利文献均通过引用整体并入本文中。上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述，但是，在不脱离本申请的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进，由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。
Claims (10)
1.基于质谱检测样品中蛋氨酸亚氨基代砜含量的方法，其包括：
确定蛋氨酸亚氨基代砜的目标母离子/子离子对的质荷比；
采集所述样品的目标子离子的质谱响应信号。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括：
基于测定不同浓度蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号所建立的标准曲线，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量；
基于所测定的检测限浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量是否低于检测限；或者
基于所测定的单个或多个目标浓度的蛋氨酸亚氨基代砜标准品的所述目标子离子的质谱响应信号值，确定所述样品中蛋氨酸亚氨基代砜的含量。
3. 如权利要求1所述的方法，其中
所述质谱检测为多反应监测；和/或
所述目标母离子/子离子对的质荷比为(179.564-182.564)/(100.598-103.598)。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述目标母离子/子离子对的质荷比为(179.564-182.564)/103.598、(179.564-182.564)/103.098、(179.564-182.564)/102.598、(179.564-182.564)/102.098、(179.564-182.564)/101.598、(179.564-182.564)/101.098、(179.564-182.564)/100.598、182.564/(100.598-103.598)、182.064/(100.598-103.598)、181.564/(100.598-103.598)、181.064/(100.598-103.598)、180.564/(100.598-103.598)、180.064/(100.598-103.598)、179.564/(100.598-103.598)、(180.564-182.064)/(101.598-102.098)、(180.564-182.064)/102.098、(180.564-182.064)/101.598、180.564/(101.598-102.098)、181.064/(101.598-102.098)、181.564/(101.598-102.098)、或182.064/(101.598-102.098)。
5. 如权利要求3所述的方法，其中所述目标母离子/子离子对的质荷比为182.564/103.598、182.564/103.098、182.564/102.598、182.564/102.098、182.564/101.598、182.564/101.098、182.564/100.598、182.064/103.598、182.064/103.098、182.064/102.598、182.064/102.098、182.064/101.598、182.064/101.098、182.064/100.598、181.564/103.598、181.564/103.098、181.564/102.598、181.564/102.098、181.564/101.598、181.564/101.098、181.564/100.598、181.064/103.598、181.064/103.098、181.064/102.598、181.064/102.098、181.064/101.598、181.064/101.098、181.064/100.598、180.564/103.598、180.564/103.098、180.564/102.598、180.564/102.098、180.564/101.598、180.564/101.098、180.564/100.598、180.064/103.598、180.064/103.098、180.064/102.598、180.064/102.098、180.064/101.598、180.064/101.098、180.064/100.598、179.564/103.598、179.564/103.098、179.564/102.598、179.564/102.098、179.564/101.598、179.564/101.098、或179.564/100.598。
6. 如权利要求1所述的方法，其中
所述质谱检测使用的质谱仪为串联质谱仪或可实现串联功能的质谱仪；和/或
所述串联质谱仪为三重四级杆串联质谱仪、四级杆-飞行时间串联质谱仪、四级杆-线性离子阱串联质谱仪、四级杆-Orbitrap质谱仪、离子阱-Orbitrap质谱仪、四级杆-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪、或具有多反应监测功能的其他质谱仪。
7.如权利要求1所述的方法，其还包括在进行质谱检测前，使用液相色谱对所述样品中的蛋氨酸亚氨基代砜进行分离。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述液相色谱为亲水相互作用色谱、反相色谱、正相色谱、离子色谱、体积排阻色谱或亲和色谱。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述液相色谱为亲水相互作用色谱。
10. 如权利要求7所述的方法，其中
所述液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，其中所述流动相A为0.1%甲酸/水，和/或所述流动相B为乙腈；和/或
所述液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱，并且梯度洗脱的程序如下：
0.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
0.5 min 流动相A 30% 流动相B 70%
8.0 min 流动相A 35% 流动相B 65%
8.1 min 流动相A 30% 流动相B 70%
10 min 流动相A 30% 流动相B 70%。
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