CN108969548A - 白簕叶总多酚的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种白簕叶总多酚的用途，用于制备对神经细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物，并且能用于制备对PC12细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物。白簕叶总多酚在抗氧化和神经氧化损伤修复方面的多途径作用机制,进一步提高了中草药的临床价值,并且对于临床上开发出高效、低毒的AD治疗药物有很大帮助，有利于寻找出可能治疗抗神经细胞氧化损伤的抗衰老剂。

Description

白簕叶总多酚的用途

技术领域

本发明涉及的一种白簕叶的用途研究，具体涉及一种白簕叶总多酚的用途。

背景技术

白簕(Acanthopanx trifoliatus(L.)Merr.)，为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)的一种攀援状灌木，又被称为禾掌簕、三叶五加、三加皮等，广泛分布于我国的中部和南部，是一种民间常用的草药，其味苦、涩、微寒，具有祛风除湿、舒筋活血、消肿解毒的功效，用于治疗感冒、咳嗽、风湿、坐骨神经痛等症。另外，白簕香味独特，民间流行以簕菜作为保健蔬菜，白簕作为一种药食同源植物，现已开发出与其有关的保健药品，具有广阔的应用前景。白簕叶中含有多种化学成分，其富含皂苷、三萜羧酸、黄酮、糖苷等化学成分。据报道，白簕叶中含有多种三萜类成分，国内外学者从白簕叶中分离鉴定了四种成分，即石吊兰素，贝壳杉烯酸，蒲公英菇醇和蒲公英菇醇乙酸醋。经研究发现，这些成分具有很好的止咳和祛痰作用。

近年来大量研究表明，白簕提取物具有很好的抗氧化活性，其植物黄酮经研究证明具有良好的抗氧化、抗菌作用，分离纯化的多糖成分经实验证明，其抗氧化能力呈现出很好的量效关系。众多研究为开发利用白簕提取物提供了理论依据，为白簕资源的深入利用和高价值的产品开发提供了有价值的参考。

咖啡酰奎宁酸类总多酚是白簕的有效成分群之一，这类成分在灯盏细辛中广泛存在，而且金银花、咖啡豆、苍耳等植物中也被发现含有丰富的咖啡酰奎宁酸类总多酚。这类化合物具有多种不同的生物活性，国内外许多学者对于咖啡酰奎宁酸进行了植物化学和药理学方面的研究，发现了这类成分具有很好的药理活性，能够有效地抑制血小板聚集，在抗血栓、抗氧化和自由基损伤等方面发挥了很大作用。盛艳梅等通过建立大鼠脑缺血再灌注的损伤模型，探讨了3,5-二咖啡酰奎宁酸对于脑神经的保护作用。她们采用了大鼠线栓法证明了，咖啡酰奎宁酸类化合物在大鼠模型中，能够有效的改善其神经行为，进而能够使得脑梗死的比率显著下降。因此，对于开发出理想的抗脑缺血损伤药物具有很大的帮助。有研究发现，黑大豆种皮中多酚能够抑制活性氧(ROS)在细胞中的积累，从而抑制自由基引起的DNA氧化损伤。

白簕的嫩茎、嫩叶在民间通常可作为蔬菜食用，也常被制成茶叶饮用，受到大多数人的青睐。近年来有关白簕化学成分的研究屡见不鲜，这些研究发现，白簕中含有丰富的挥发油、酚类化合物、黄酮类、皂苷类、多糖等成分，还包括多种矿物质、维生素、氨基酸、蛋白质等。对于白簕的不同部位，多酚的含量有所不同，研究发现，相比白簕根、茎中的多酚含量，白簕叶中的多酚含量明显要高；对于白簕中丰富的黄酮类化合物，研究考察了各部位黄酮的含量差异情况，发现白簕叶中黄酮含量均高于其他部位。由此可见，白簕叶的生理活性有待进一步研究。

因此，需要对现有技术进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效的白簕叶总多酚的用途。

为解决上述技术问题，本发明提供一种白簕叶总多酚的用途：

用于制备对神经细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物。

作为对本发明白簕叶总多酚的用途的改进，其特征在于：

用于制备对PC12细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物。

本发明白簕叶总多酚的用途的技术优势为：

白簕叶总多酚在抗氧化和神经氧化损伤修复方面的多途径作用机制,进一步提高了中草药的临床价值,并且对于临床上开发出高效、低毒的AD治疗药物有很大帮助，有利于寻找出可能治疗抗神经细胞氧化损伤的抗衰老剂。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为白簕叶总多酚的细胞毒性实验(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)；横坐标为细胞存活率；

图2为不同浓度Aβ25-35作用24h后对PC12细胞存活率的影响(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)；横坐标为细胞存活率；

图3为Aβ25-35的半数损伤浓度；横坐标为细胞存活率；

图4为白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化损伤模型的作用(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)；横坐标为细胞存活率；

图5为白簕叶总多酚作用后PC12细胞β-半乳糖苷酶染色结果；A-模型组(AAPH)；B-正常组；C-白簕叶总多酚15mg/L+AAPH；D-白簕叶总多酚30mg/L+AAPH；E-白簕叶总多酚60mg/L+AAPH。

*p<0.05代表显著差异，**p<0.01代表极显著差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明所使用的白簕采集于广东省凤凰山(干燥)；PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。

实施例1、白簕叶总多酚的制备方法，包括以下步骤：

1)、将白簕叶粉碎，过10目筛，取干燥的白簕叶粉末1kg，加入4L体积分数为70％的乙醇溶液进行超声提取4次，每次2h，将提取液合并，于60℃加热减压浓缩至浸膏状，加1L的45℃蒸馏水混悬，用石油醚萃取4次去脂，取水相于60℃加热减压浓缩至浸膏状，然后进行真空冷冻干燥至无水分，得到粗多酚粉末；

2)、称取100g的树脂(树脂为HPD100型大孔树脂)，向其中加入3～4倍于树脂体积的无水乙醇浸泡24h(树脂充分溶胀)，将浸泡后的树脂装于层析柱(Φ1.7cm×50cm的玻璃层析柱)中，控制使树脂层无气泡产生，取无水乙醇上柱洗脱液，在洗脱液加等体积蒸馏水至洗脱液不变浑后停止，然后再用蒸馏水洗脱至其中乙醇含量小于10％；待蒸馏水流尽后，加入树脂3倍量的质量分数5％NaOH浸泡，3h后用蒸馏水洗脱树脂至洗脱液经pH计测定呈中性，再加入树脂3倍量质量分数5％HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性，得到用于纯化的大孔树脂柱；

3)采用步骤2中的用于纯化的大孔树脂柱，以浓度为1.0mg/mL白簕叶粗多酚作为上样液，通过1mol/L的盐酸溶液调节上样液pH为3.0，调节上样速率，以2mL/min的速度上柱，上柱量为30mL；然后先用2BV的蒸馏水以2BV/min冲洗大孔树脂上的杂质，再用40mL体积浓度为50％乙醇溶液进行洗脱，洗脱速度为2mL/min，可得白簕叶总多酚化合物。

实验：

选取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC12细胞株作为靶细胞，以白簕叶提取物总多酚为研究对象，分别对于Aβ_25-35诱导的细胞氧化损伤及AAPH诱导的细胞氧化应激体外模型进行干预，旨在研究白簕叶总多酚对神经细胞衰老的影响。涉及的主要研究内容有：

1)细胞毒效学研究：为验证白簕叶总多酚本身是否对PC12细胞存在毒性作用，本实验采用MTT法检测白簕叶总多酚对PC12细胞的毒性，对给药后的细胞存活率进行测定，计算给药的安全浓度。

2)细胞衰老模型构建：建立Aβ_25-35诱导的PC12细胞氧化损伤模型；建立以AAPH诱导的氧化应激引起的细胞衰老为基础的抗衰老活性测定体系。

3)细胞药效学研究：以白簕叶总多酚对PC12细胞氧化损伤模型进行干预，采用MTT法检测细胞存活率，从而研究白簕叶总多酚对该损伤机制的影响；以纯化后的白簕叶总多酚为研究对象对AAPH诱导的氧化应激模型进行干预，采用β-半乳糖苷酶染色法观察药物组对该氧化损伤机制的抑制作用。

主要试剂

RPMI-1640完全培养基的配制：

在超净工作台中，保证无菌操作的条件下，首先用吸管吸取10％的胎牛血清到RPMI-1640培养液中，充分混匀后再加入1％的双抗，摇匀，即配制成完全培养基，于4℃冰箱保存备用。以下对于细胞进行的实验操作均在超净工作台中进行，操作过程中注意保持无菌。

PBS缓冲液的配制：

实验中所用的磷酸缓冲液为pH7.2。配制pH为7.2的PBS缓冲液，分别称取0.24g的磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，1.44g的磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，以及8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)至大烧杯中，然后向其中加入大约800mL的蒸馏水，用玻璃棒充分搅拌使之溶解后，测量其pH值，加入浓盐酸调至pH为7.2，最后在容量瓶中加水定容至1L。将配制好的PBS置于高温高压灭菌锅中灭菌后备用(121℃，20min)。本实验中所使用的PBS均采取该方法配制，灭菌后置于4℃冰箱保存。

Aβ_25-35母液配制：

Aβ_25-35分子量为1060.27，将1mg的Aβ_25-35用471.5μL的ddH₂O溶解，配制成2mmol/L的母液，用小管进行分装，避免反复冻融，可长期在-20℃冰箱保存，备用。在使用前将小管的Aβ_25-35母液放在37℃的恒温培养箱中，孵育大约7d，从而增加Aβ_25-35的神经毒性，孵育完成后用来建立细胞损伤模型。

白簕叶总多酚母液配制：

称取适量白簕叶总多酚，加入少量的DMSO使其溶解，然后用无血清1640培养基将其稀释到白簕叶总多酚浓度为10mg/mL，经0.22μm的滤膜过滤除菌，于4℃冰箱保存备用。

白簕叶总多酚母液的配制

MTT溶液的配制：

通常所用的MTT浓度为5mg/mL。精确称取MTT粉末500mg到烧杯中，向烧杯中加入100mL的磷酸盐缓冲液(PBS)，等到MTT粉末完全溶解后，在超净工作台中用0.22μm的滤膜加以过滤，使该MTT溶液保持无菌的状态，即配制成5mg/mL的MTT。MTT最好现配现用，过滤除菌后将其放在4℃冰箱避光保存，尽量在两周内使用。为了防止反复冻融影响实验顺利进行，将配好的MTT进行小剂量分装，用避光袋或锡箔纸避光以免分解，放到-20℃冰箱可以长期保存。

细胞冻存液的配制：

在超净工作台中，分别量取适量的胎牛血清和DMSO(9:1的质量比例)，将其充分混匀来配制冻存液，于4℃冰箱预冷备用。

具体实验步骤为：

细胞培养与传代：

细胞为PC12细胞，PC12细胞采用RPMI-1640完全培养基来培养，其中含有10％的FBS，为防止污染，还加入了1％的双抗。将细胞放在含有5％CO2的37℃培养箱中进行培养。倒置显微镜下观察到细胞的生长密度达到培养皿的80％～90％时，在超净工作台中用吸管吸去原先的培养液，用PBS轻轻洗两次后，加入1mL的胰酶使贴壁细胞分散。观察倒置显微镜下细胞的状态，当细胞逐渐变圆时，立刻在超净台中吸去胰酶，然后加入2mL的含FBS的RPMI-1640培养液使细胞停止消化。接着用吸管反复轻轻地吹打细胞，使细胞脱离培养皿，充分悬浮，按照实验所需的比例将适量的细胞悬液加至新的细胞培养皿中，并加入适量新鲜的完全培养液，放到含5％CO₂的37℃培养箱中继续培养。

细胞复苏与冻存：

复苏：打开液氮罐，小心地取出冻存好的PC12细胞，将冻存管放到37℃水浴中，注意速度要快，防止融化过程中形成的小冰晶对细胞造成损伤，轻轻地摇晃冻存管，使冻存液在最短时间快速融化。800rmp离心3min。离心后保留细胞沉淀，吸取1mL完全培养液加入培养皿，用吸管或枪头轻轻吸吹几次使细胞飘浮，将细胞悬液转入新的培养皿中，加适量新鲜的完全培养液后，放到含5％CO₂的37℃培养箱中进行培养。等到第二天细胞贴壁后，对细胞进行换液处理，以充分去除培养液中残留的DMSO，防止其对细胞造成损伤，影响细胞的生长。

冻存：细胞长至约90％愈合度后，倒掉培养液，用配制好的PBS洗两次，弃去PBS，向其中加入1mL的胰酶使贴壁细胞分散，观察倒置显微镜下的细胞状态，当细胞逐渐变圆时，立刻在超净台中吸去胰酶。然后向其中加入2mL的完全培养液使细胞停止分散，用1mL枪头反复轻轻吹打细胞，使其充分飘浮起来，在800rmp下离心3min。离心后倒掉培养液，加入适量预先配制好的冻存液轻轻吸吹几次，使细胞充分悬浮，将细胞悬液分别加入各冻存管中，进行梯度降温：在4摄氏度条件下保留30min，接着转移到-20摄氏度冰箱保存大约50min，然后可在超低温冰箱短期放置或放置过夜，最后可长期保存于液氮罐中。

白簕叶总多酚对PC12细胞的细胞毒性：

当细胞处于对数生长期时，倒掉培养液，用配制好的PBS洗两次。接着加入1mL的胰酶使贴壁细胞分散，消化完全后，加入培养液使贴壁细胞悬浮起来，800rmp离心3min以充分去除胰酶。离心后保留细胞沉淀，加入1mL培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞飘浮起来，制成悬液。用血球计数板进行细胞计数，最终向96孔板每孔中加入100μL的细胞悬液(大约5000个细胞)，其中一些孔加100μL完全培养基作为空白孔，放在含5％CO2的37℃培养箱中培养过夜，使之贴壁。

将白簕叶总多酚母液进行稀释，使得最终浓度分别为240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.875mg/L等8个浓度梯度的白簕叶总多酚药物组(母液用DMSO溶解，稀释用1640培养基)；向设置的药物组中分别加入10μL不同浓度的白簕叶总多酚，空白对照组和阴性对照组加入10μL无血清RPIM-1640培养液，保持与药物组相同的总体积110μL，每组分别设4个复孔。96孔板横向依次为：空白对照、阴性对照、8个不同浓度的药物组。加药后将96孔板置于5％CO2，37℃培养箱继续培养24h。

Aβ25-35诱导PC12细胞氧化损伤模型的建立：

细胞铺板过程同之前的白簕叶总多酚对PC12细胞的细胞毒性中的步骤相同，将悬浮的PC12细胞用血球计数板进行计数，最终向96孔板每孔中加入100μL的细胞悬液(大约5000个细胞)，其中一些孔加100μL完全培养基作为空白孔，放在含有5％CO2的37℃培养箱中培养过夜，使之贴壁。

将孵育7d后的Aβ25-35用1640稀释。将10μmol/L的Aβ25-35作为最高终浓度，分别稀释为10、8、7、6、5、4、2、1μmol/L共8个浓度，对细胞进行不同程度的损伤；同时保留阴性对照组(不加Aβ25-35)。

向Aβ25-35损伤组中加入10μL不同浓度的药物(Aβ25-35)，其余不加药物的对照组加入10μL无血清RPMI-1640培养液，保持与药物组相同的总体积110μL。每组分别设置4-6个复孔，实验需要重复3次以保证可靠性。96孔板横向依次为：空白对照、阴性对照、8个浓度依次递增的Aβ25-35加药孔。在含5％CO2的37℃培养箱继续培养24h。

MTT法检测细胞存活率：

药物处理24h后，向每个孔中加入20μL的MTT溶液，放在含5％CO2的37℃培养箱中培养4h。之后取出96孔板，沿着培养液上部用移液枪小心吸取上清液，充分弃去MTT。接着加DMSO来溶解结晶，每孔150μL，轻轻振摇15min。使用酶标仪，在490nm波长处检测各孔的吸光度，计算各种浓度下药物的抑制率：细胞存活率＝(OD加药孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100％

白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化损伤模型的作用：

细胞铺板过程同之前的白簕叶总多酚对PC12细胞的细胞毒性中的步骤相同，将消化后的PC12细胞制成细胞悬液进行计数，最终向每孔加入90μL的细胞悬液(5000个细胞)，设置空白组加90μL完全培养基，放在含5％CO2的37℃培养箱中培养过夜，使之贴壁。

根据上述白簕叶总多酚细胞毒性实验结果，选取药物的最大安全浓度，在此基础上用1640稀释6个浓度。设置不同浓度的药物干预组(加入了白簕叶总多酚6个浓度和Aβ25-35)，Aβ25-35损伤组(只加入了Aβ25-35)，阴性对照组(不加任何药物)和空白对照组(只含完全培养基)。96孔板横向从左至右依次为：空白对照、阴性对照、Aβ25-35模型组、6个不同浓度药物依次递增干预组。

将不同浓度10μL药物分别加入不同孔中，Aβ25-35模型组、阴性对照组加入10μL无血清1640培养基，预处理30min，以Aβ25-35损伤模型确定的接近IC50Aβ25-35浓度10μL加入药物干预组和Aβ25-35模型组，空白对照组和阴性对照组加入10μL无血清RPMI-1640培养液，使之总体积110μL，每组分别设4个复孔，实验重复3次。在5％CO2，37℃条件下继续培养24h。

AAPH诱导的衰老模型的建立以及给药：

当细胞处于对数生长期时，在超净工作台中吸去培养液，用PBS洗两次。接着加入1mL的胰酶使贴壁细胞分散，消化完全后，加入培养液使贴壁细胞悬浮起来，800rmp离心3min以充分去除胰酶。离心后保留细胞沉淀，加入1mL培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞飘浮起来，制成悬液。然后用血球计数板进行细胞计数，最终向每孔加入2mL细胞悬液(2x105个细胞)到六孔板中，培养过夜使之贴壁。对照组继续培养，PC12细胞加药组和AAPH组均加入终浓度为1mM的AAPH，加药组分别另外加入对应浓度的白簕叶总多酚，培养48h后进行染色并检测。

β-半乳糖苷酶染色：

实验原理：细胞衰老时，衰老相关β-半乳糖苷酶会表现出活性。β-半乳糖苷酶染色试剂盒是基于衰老细胞的这种生物学特性，以X-Gal为底物，对衰老的细胞或组织进行染色，会产生深蓝色产物。这种现象可以在倒置显微镜下观察到，因此，可以依据变成蓝色(表达β-半乳糖苷酶)的细胞或组织所占比例来判断细胞衰老情况。

在pH6.0的条件下，衰老β-半乳糖苷酶才会表达活性，该染色反应才能顺利进行。而二氧化碳培养箱中充足的CO2会导致pH发生改变，从而影响该染色反应的条件。因此，在染色时，不能在用于细胞培养的二氧化碳培养箱中进行染色反应。

β-半乳糖苷酶染色的步骤：

严格按照试剂盒要求配制染色液。加药处理后，在超净工作台中用吸管吸取旧的细胞培养液。每孔加入2mL的1x PBS洗涤1次；接着向每孔加入1mL预先配制好的固定液(1xFixative Solution)，将6孔板在室温条件下固定10-15分钟。固定后，用吸管吸去固定液，每孔加入2mL的1x PBS洗涤2次以充分去除残留的固定液。每孔加入1mL的染色液(β-Galactosidase Staining Solution)进行染色；将6孔板放入干燥的无CO₂的37摄氏度培养箱过夜(或室温培养过夜)。在倒置显微镜下观察细胞染色情况，并拍照记录。

实验结果：

得到细胞存活率数据后，以白簕叶总多酚终浓度-细胞存活率为依据，作出白簕叶总多酚细胞毒性实验图表。如图所示，当白簕叶总多酚浓度为60mg/L以下时，PC12细胞的存活率均大于95％，说明此时白簕叶总多酚并无明显毒性，而在浓度高于60mg/L时，细胞存活率明显下降，因此，可以认为其最大安全浓度为60mg/L，图1为白簕叶总多酚的细胞毒性实验(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)。

Aβ25-35对PC12细胞损伤模型的建立：

在本报告中，我们发现在1-10μmol/L范围内，用Aβ25-35处理PC12细胞后,细胞损伤率和Aβ25-35浓度呈趋势关系，如图所示，Aβ25-35氧化损伤后PC12细胞的存活率明显降低,与正常组存在极显著差异。图2为不同浓度Aβ25-35作用24h后对PC12细胞存活率的影响(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)。

Aβ25-35损伤浓度的确定：

使用Graphpad Prism 5软件计算Aβ25-35损伤的IC50,为4.141μmol/L，最终确定使用Aβ25-35建立细胞氧化损伤模型的浓度为4.141μmol/L。图3为Aβ25-35的半数损伤浓度

白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化损伤模型的作用：

以白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的损伤模型处理，MTT检测细胞存活率结果如图，药物处理组细胞存活率明显高于Aβ25-35模型组(白簕叶总多酚浓度为0)。图4为白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化损伤模型的作用(与对照组比较:*p<0.05，**p<0.01)

β-半乳糖苷酶染色结果：

在倒置显微镜下观察染色结果，选取适当的角度拍照记录。如图5白簕叶总多酚作用后PC12细胞β-半乳糖苷酶染色结果所示，PC12细胞的染色结果显示，AAPH模型组的大多数细胞被染为蓝色，对照组几乎未见染色阳性细胞，而各浓度白簕叶总多酚作用后的细胞染色阳性率均明显小于模型组。

结论：

HPD100型大孔树脂对白簕叶中多酚化合物的最佳纯化工艺：以pH为3.0，浓度为1.0mg/mL白簕叶粗多酚作为上样液，调节上样速率，以2mL/min的速度上柱，上柱量为30mL。然后先用适量蒸馏水冲洗，再用40mLpH为6.0的50％乙醇溶液对大孔树脂进行洗脱，而洗脱速度亦为2mL/min，可得纯度(紫外测定)为53.1％的白簕叶总多酚化合物。对各工艺参数进行均扩大30倍再实验，获得纯度(紫外测定)为54.5％的白簕叶总多酚化合物。

白簕叶总多酚对PC12细胞的毒性：

MTT实验方法用来测定药物的安全浓度范围，进而选择对细胞生长没有影响或者影响较小的浓度进行抗衰老研究。MTT法检测白簕叶总多酚对PC12细胞的毒性作用结果如图1所示。结果表明，白簕叶总多酚在0-60mg/L浓度范围内，PC12细胞存活率均大于90％，对细胞没有明显的毒性；而浓度大于60mg/L时，可以明显看出细胞存活率呈现下降的趋势。以10％细胞致死率作为最高作用浓度，可以认为浓度为60mg/L以下时，白簕叶总多酚对PC12细胞没有明显毒性，即可采用白簕叶总多酚最高浓度为60mg/L进行更深一步的研究。

白簕叶总多酚对Aβ25-35诱导的PC12细胞氧化损伤的作用：

Aβ25-35为一种β淀粉样蛋白，它的聚集是AD发生和发展的重要因素。研究发现，Aβ会导致细胞内的抗凋亡因素逐渐减少，而以各种途径使细胞内的促凋亡因素增加。因此，Aβ的存在会使细胞凋亡，使神经元坏死。通过将不同浓度的β淀粉样蛋白Aβ25-35采用侧脑注射，发现Aβ25-35会减退大鼠的记忆能力，损伤大鼠的突出超微结构，使大鼠的海马神经元丢失，即使用Aβ25-35能够成功制备大鼠AD模型。因此，建立Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型可以探究并开发出治疗AD的药物。

在建立Aβ25-35损伤模型实验的过程中，得出Aβ25-35的IC50为4.141μmol/L，选取该浓度对PC12细胞进行氧化损伤。通过白簕叶总多酚对该损伤模型的处理，可以明显看出药物处理组细胞的存活率明显高于Aβ25-35模型组(**p<0.01)，即可以得出白簕叶总多酚对该损伤模型具有一定的保护作用。然而，在同样的条件下，IC50浓度的Aβ25-35处理下，细胞存活率远远低于50％，且白簕叶总多酚药物组的浓度越高，细胞存活率呈现降低趋势。重复实验中，Aβ25-35模型组存活率均小于50％，重复性不高。因此，得出由于Aβ25-35是一种β淀粉样蛋白，其活性受温度及孵育时间的影响，较不稳定，导致实验过程中，相同的处理条件下，得到的结果有所不同，实验重复性较低。即该氧化损伤模型有待进一步验证。

白簕叶总多酚对AAPH诱导的细胞氧化应激的作用：

本实验针对PC12细胞采用AAPH作为氧化应激诱导剂来诱导细胞产生衰老模型。AAPH作为一种自由基诱导剂，是一种含氮的水溶性小分子，在生理温度(37℃，pH7.0)下，能够分解产生自由基。氧气能够快速地和其中含碳的自由基发生反应，生成过氧自由基，且以稳定的速率释放，为建立稳定的氧化应激模型提供了有利的条件。

衰老的细胞在各方面表现出与正常细胞所不同的特性，细胞进入衰老状态后，其蛋白和基因表达谱在很大程度上发生了改变，但是细胞仍然是存活的。衰老细胞内，在pH6.0的条件下，β-半乳糖苷酶表现出很高的酶活性，我们可以根据β-半乳糖苷酶染色阳性细胞的多少来判断体外培养细胞的衰老程度。如图5，可以看出AAPH组染色阳性细胞的比例明显较多，对照组由于未进行氧化应激诱导，几乎未见衰老细胞的发生。经过白簕叶总多酚处理的实验组，可看出其染色阳性细胞的比例明显低于AAPH模型组，且随着白簕叶总多酚浓度的增加，染色阳性细胞的数目明显减少，在处理浓度为60mg/L时，其抗衰老效果甚至和空白对照组相当。这表明，不同浓度的白簕叶总多酚对于PC12细胞具有一定程度的抗衰老作用，可以缓解AAPH诱导氧化应激所引起的细胞衰老，且在安全浓度范围内，随着白簕叶总多酚浓度的增加，其抗衰老作用显著提高。证明本实验所采取的方法与得出的结论具有一定的实际意义。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.白簕叶总多酚的用途，其特征在于：

用于制备对神经细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物。

2.根据权利要求1所述的白簕叶总多酚的用途，其特征在于：

用于制备对PC12细胞具有抗衰老作用的食品和/或药物。