CN110151751A - 岩豆素在制备用于防治与5-脂氧合酶相关疾病的药物中的应用 - Google Patents

岩豆素在制备用于防治与5-脂氧合酶相关疾病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种岩豆素在制备用于防治与5‑脂氧合酶相关疾病的药物中的应用，其中岩豆素具有5‑脂氧合酶抑制活性。本发明人通过实验发现岩豆素具有优越的5‑脂氧合酶抑制活性，岩豆素也许将成为治疗与5‑脂氧合酶关的疾病的强效的化学实体。可用于制备5‑脂氧合酶抑制剂、5‑脂氧合酶抑制剂的实验模型工具药或制备用于治疗和预防白三烯相关疾病的药物。

Description

岩豆素在制备用于防治与5-脂氧合酶相关疾病的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及岩豆素在制备用于防治与5-脂氧合酶相关疾病的药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
当今社会，恶性肿瘤(癌症)已经成为威胁人类健康和导致人类死亡的重要原因之一，据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)发布的GLOBOCAN 2018年癌症发病率和死亡率，估算至2018年将有1810万新增癌症病例和960万例癌症死亡病例。如何有效治疗肿瘤己成为当今社会生命科学和医学的首要问题。从20世纪下半叶开始，随着恶性肿瘤内的细胞调亡、血管生成等基本机制的阐明，以一些癌症基因为靶点的靶向性治疗已成为当今肿瘤治疗的重要方向。相比传统抗肿瘤药物，分子靶向药物具有高效、低毒、选择性高等优点，在目前的临床治疗中取得了显著的疗效。
动物实验及人类癌症研究表明，炎症是癌症发生和发展的重要组成部分，人类的多种癌症都是由炎症直接或间接驱动的。流行病学和遗传学研究发现，慢性炎症能够促使癌症的发生以及恶化。在癌性肿瘤微环境中，炎性因子被认为是一类新增的肿瘤标志物。而使用抗炎药物可以通过抑制炎症和阻止血管生成等来阻碍肿瘤生长。
5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase,5-LOX,ALOX 5)是炎症机制中的重要部分，是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢到白三烯A4(leukotriene A4，LTA4)的关键酶。已有研究报道，5-LOX、5-LOX活化蛋白(FLAP)以及其他白三烯(LT)生物合成酶在多种恶性细胞中过表达，包括结肠、食道、胰腺等(Che X,Chen C,Ye X,et al.Dual inhibition of COX-2/5-LOX blocks colon cancer proliferation，migration and invasion in vitro[J].Oncol Rep,2016,35(03):1680-1688.；Zhou G,Ding X,Wu S,et al.Inhibition of 5-lipoxygenase triggers apoptosis in pancreatic cancer cells[J].Oncol Rep,2015,33(02):661-668.；Ringleb J,Strack E,Angioni C,et al.Apoptotic cancer cellssuppress 5-lipoxygenase in tμMor-associated macro-phages[J].J.Immunol,2018,200(02):857-868.；Moore GY,Pidgeon GP.Cross-talk between cancer cells and thetμMour microenvironment:the role of the 5-lipoxygenase pathway[J].Int.J.Mol.Sci.2017,18(02):236.；以及李月春,王东霞,李菜诗,等.结直肠组织5-LOX的表达与患者临床病理因素的关系[J].中华胃肠外科杂志,2013,16(09):895-897.等)。研究表明，活化的5-LOX易位至核质中，其中活化蛋白有助于磷脂衍生的AA重新定位至5-LOX，LTA4从5-羟基二十烷四烯酸(5-HETE)的高效转化启动了5-LOX的开发，这些氧化的5-HETE和LTs分子诱导肿瘤的传播和可持续性(Fischer AS,Metzner J,Steinbrink SD,et al.5-lipoxygenase inhibitors induce potent anti-pro-liferative and cytotoxiceffects in hμMan tμMour cells independently of suppression of 5-lipoxygenaseactivity[J].Br.J.Pharmacol,2010,161(04):936-949.以及Nieves D,MorenoJJ.Hydroxyeicosatetraenoic acids released through the cytochrome P-450pathway regulate 3T6fibroblast growth[J].J.Lipid Res,2006,47(12):2681-2689.等)。由此可知，5-LOX可通过调节肿瘤细胞和/或通过调节肿瘤微环境间接促进肿瘤发生(Merchant N,Bhaskar LVKS,Momin S,et al.5-Lipoxygenase:Its involvement ingastrointestinal malignancies[J].Critical Reviews in Oncology/Hematology,2018,127:50-55.等)。已知5-LOX的下游激活与蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)有关，其可能在促进癌细胞中的血管生成中起重要作用(Payne SL,Hendrix MJ,Kirschmann DA.Paradoxicalroles for lysyl oxidases in cancer-A prospect[J].J.Cell Biochem,2007,101(06):1338-1354.)。扩增的5-LOX以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMps)活性与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)稳定性相关，并诱导癌细胞的侵袭和转移(Levental KR,Yu H,Kass L,et al.Matrix crosslinking forces tμMor progressionby enhancing integrin signaling[J].Cell,2009,139(05):891-906.以及Erler JT,Bennewith KL,Cox TR,et al.Hypoxia-induced lysyl oxidase is a criticalmediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche[J].Cancer Cell,2009,15(01):35-44.等)。所有的这些发现表明，5-LOX在诱导肿瘤细胞增殖和转移中起重要作用，包括迁移、侵袭、粘附和血管生成。
发明内容
本发明的目的之一是提供岩豆素(CAS号：152743-19-6)在制备用于预防和/或治疗与5-LOX相关的疾病或病症的药物中的应用。本发明的目的之二在于提供岩豆素在制备用于抑制5-LOX活性的制品中的应用。本发明的目的之三在于提供用于治疗与5-LOX相关的疾病的药物组合物或药物制剂，其包含岩豆素。
本发明以5-LOX为研究对象，通过分子互作深入进行构效关系的研究，以求发现靶向5-LOX的活性化合物，为开发针对5-LOX相关疾病比如肿瘤的治疗提供先导化合物。本发明经实验发现岩豆素与5-LOX具有较好的亲和力，本发明人进一步通过实验发现岩豆素具有优越的5-LOX抑制活性，本发明提供的化合物也许将成为治疗与5-LOX和/或白三烯相关的疾病的强效的化学实体。可用于制备5-LOX抑制剂、5-LOX抑制剂的实验模型工具药或制备用于治疗和预防白三烯相关疾病的药物。
具体地，本发明的发明目的是通过如下所述的技术方案实现的：
在本发明的第一方面，本发明提供了岩豆素在制备用于预防和/或治疗与5-LOX相关的疾病或病症的药物中的应用。在本发明的应用中，所述岩豆素具有5-LOX抑制活性。
在本发明的一些实施方式中，本发明经实验验证了岩豆素对5-LOX具有较强的抑制率，并且该抑制作用在一定浓度范围内呈现出剂量依赖性。比如，在对5-LOX的抑制试验中，0.625-10mg/mL的岩豆素对5-LOX均有不同程度的抑制效果，尤其当岩豆素的浓度在1.25mg/mL以上(含本数)时，对5-LOX的抑制率会有较明显的提升，尤其在2.5-10mg/mL时，已经体现出较好的抑制效果，并且在5-10mg/mL，抑制率可达80.0％以上，具有特别好的抑制效果。
以及，在本发明的另一些实施方式中，本发明经实验提供了岩豆素对5-LOX的半数有效抑制浓度，即IC50值，比如，对5-LOX，计算岩豆素的IC50，可以得到半数有效抑制浓度为3.3mg/ml，即9mM。体系为100ul的反应体系，即IC50为90μM。
在本发明的一些实施方式中，所述与5-LOX相关的疾病或病症为与5-LOX相关的肿瘤或癌症；比如，所述与5-LOX相关的肿瘤或癌症选自结肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、脑膜瘤和胶质瘤(比如神经胶质瘤)。
在本发明的又一些实施方式中，所述疾病或病症包括所有与5-LOX相关的疾病或病症，包括但不限于脑缺血性损伤、PD炎症、神经退行性疾病、神经元损伤、脑脊髓损伤、帕金森病、阿尔兹海默病、溃疡性结肠炎和急性胰腺炎等疾病。
在本发明的一些实施方式中，本发明经实验提供了岩豆素对胶质瘤细胞(体外)的抑制情况，细胞实验的结果表明，岩豆素对胶质瘤细胞的半数最大效应浓度即EC50值为1.484mg/ml，折合体系浓度为16.576μM，表明岩豆素能够很好的抑制胶质瘤细胞。
在本发明的第二方面，本发明提供了岩豆素在制备用于抑制5-LOX活性的制品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述制品为5-LOX抑制剂药物。
在本发明的又一些实施方式中，所述制品为5-LOX抑制剂实验模型工具药。
在本发明的第三方面，本发明提供了用于治疗与5-LOX相关的疾病的药物组合物或药物制剂，其包含岩豆素。
岩豆素作为活性成分占该组合物或药物制剂总重量的1-99％。
本发明人通过实验发现岩豆素具有优越的5-LOX抑制活性，本发明提供的化合物也许将成为治疗与5-LOX和/或白三烯相关的疾病的强效的化学实体。可用于制备5-LOX抑制剂、5-LOX抑制剂的实验模型工具药或制备用于预防和/或治疗白三烯相关疾病的药物。
在本发明的一些实施方式中，本发明的药物组合物含有治疗有效量的岩豆素，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。该药用组合物还可以进一步包含气味剂、香味剂等常规辅料。
在本发明的一些实施方式中，本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为1-99％的活性成份，其理想的比例是，岩豆素作为活性成分占总重量比65-99％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液；本发明不排除一种或多种与岩豆素具有相同或近似活性的成分间的联用，而这种联用很大可能上会降低岩豆素在组合物中的用量，比如该用量占总重量的1-65％，也有可能在联用效果极好时，极大地降低岩豆素的使用量，比如该用量会低至占总重量的不足1％，本领域技术人员视具体情形通过常规实验可以获得所需的用量。
本发明所岩豆素和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。
这些药物组合物通常安全、无毒且为生物学上所需要的，因此，本发明中所述药学上可接受的载体或赋形剂是无毒且安全的，而且其与岩豆素的组合也是无毒且安全的。本发明所述的药学上可接受的载体和赋形剂通常为本领域人员所熟知的，或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的。
所述药学上可接受的辅料包括但不限于赋形剂、载体等等。本领域技术人员可根据赋形剂所具有的不同的目的，选择适宜的赋形剂。比如根据药物性质或者给药模式，常用的赋形剂比如溶剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、填充剂、乳化剂、粘结剂、崩解剂、稳定剂、矫味剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、pH调节剂、压力调节剂等，或者这些种类中的二种或多种的组合等等。
岩豆素或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是常规剂型，比如液体剂型例如乳剂剂型、胶体类、真溶液类、微粒剂型、混旋剂型；比如其他常规机型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、口服液、粉剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包合物、填埋剂等。这些剂型可按照药学领域的常规制备方法制备，比如混合、制粒、压片、填充、溶解或混悬分散等等。其制剂配方的单位计量中包含0.05-200mg岩豆素，优选地，制剂配方的单位计量中包含0.1mg-100mg岩豆素。
本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最佳优选日剂量为0.01-200mg/kg体重，一次性服用，或0.01-100mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为岩豆素与5-LOX的亲和情况。
图2为5-LOX抑制剂药效团模型。
图3为岩豆素与5-LOX的分子对接及药效团模型图。
图4为岩豆素对ALOX-5的浓度-抑制率结果曲线。
图5为岩豆素对ALOX-5的酶抑制曲线。
图6为岩豆素对胶质瘤细胞的浓度-存活率结果曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。如无特殊说明，本发明所述实验试剂、细胞、化合物或材料均为本领域常规使用的，均可通过正常购买渠道获得。其中，如无特殊说明，本发明所涉及的实验试剂、细胞、化合物或材料均按照常规使用方式应用，或者至少依照相应的使用说明使用。以及，本发明实施例中涉及的生物实验，如无特殊说明，方法均为本领域常规的，本领域技术人员结合本领域的操作技能可依照本发明的记载实现相应的实验操作。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1分子互作实验
实验仪器及耗材
实验仪器：Biacore T200。
实验耗材：靶点蛋白5-LOX(货号：L6632)；DMSO(VWR，ACS，货号：0457C072)；吐温20(VWR，货号：0777-1L)；CM5芯片(货号：BR-1005-30)；标准品单体均购于上海源叶生物科技有限公司。
实验步骤
将5-LOX进行氨基偶联到CM5芯片上，将岩豆素单体溶于DMSO中至10mM，用PBS-P+稀释至500μM，用缓冲溶液PBS-P+(含5％DMSO)稀释为250μM作为最高进样浓度，设置浓度剃度为250、125、62.5、31.25、15.6μM依次进样，若出现亲和力或者动力学信号，进一步减小浓度剃度进样。
5-LOX抑制剂药效团模型的构建
由drug bank(https://www.drugbank.ca/drugs)中选取已经实验验证的作用于5-LOX的有效抑制剂，建药效团模型。运用Discovery Studio 2017 R2(DS 2017 R2)中的Pharmacophores模块进行药效团分析。参数设置：Conformation Generation为None；MaximμM Omitted Features为-1。
分子对接
PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载岩豆素的3D结构，在PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)蛋白质数据库下载5-LOX(PDB_ID：1F8N)的晶体结构。借助软件Discovery Studio 2017 R2中的Receptor-Ligand International模块将此类小分子化合物分别与5-LOX进行CDOCKER分子对接。参数设置：Pose Cluster Radius设置为0.5，Random Conformations设置为10，Orientations to Refine设置为10，其余维持默认参数不变。
研究结果
1、分子相互作用的实验结果
岩豆素与5-LOX的亲和结果如表1、图1所示，结果表明岩豆素与5-LOX具有较好的亲和力。
表1、岩豆素与5-LOX的亲和力
2、药效团及分子对接结果
由drug bank中选取已经实验验证的作用于5-LOX的有效抑制剂6个，建药效团模型，见表2、图2。
表2、5-LOX抑制剂分子集
注：表2中左肩标分别表示如下，下列文献其通过引用以其整体结合于本文中。
[1]Zouboulis CC,Seltmann H,Alestas T.Zileuton prevents the activationof the leukotriene pathway and reduces sebaceous lipogenesis[J].Exp Dermatol,2010,19(02):148-150.
[2]Yu XY,Hubbard W,Spannhake EW.Inhibition of canine tracheal smoothmuscle by mediators from cultured bronchial epithelial cells[J].Am J Physiol,1992,262(2 Pt 1):L229-234.
[3]Jeon SB,Ji KA,You HJ,et al.Nordihydroguaiaretic acid inhibits IFN-gamma-induced STAT tyrosine phosphorylation in rat brain astrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,328(02):595-600.
[4]Wiggins JB,Rajapakse R.Balsalazide.a novel 5-aminosalicylateprodrug for the treatment of active ulcerative colitis[J].Expert Opin DrugMetab Toxicol,2009,5(10):1279-1284.
[5]Sircar JC,Schwender CF,Carethers ME.Inhibition of soybeanlipoxygenase by sulfasalazine and 5-aminosalicylic acid:a possible mode ofaction in ulcerative colitis[J].Biochem Pharmacol,1983,32(01):170-172.
将岩豆素与5-LOX经行分子对接。根据对接结果分析岩豆素与5-LOX的相互作用模式以及作用活性位点，岩豆素与5-LOX的分子对接及药效团模型图如图3所示。
由图3可知，岩豆素由B环(即吡喃环2位的苯环部位)与5-LOX在活性位点ASP243形成静电中心，以便与5-LOX相互作用。
此外，本发明以相同的方法测试了表3中所列的与岩豆素相似结构的物质，并以与本实施例相同的方式进行了与5-LOX的亲和力测试，结果遗憾的是这些物质并未显示出对5-LOX具有亲和力。
表3
实施例2 5-LOX,活性抑制试验
试剂浓度及配制：
PBS(即磷酸盐缓冲液)：0.2μM,pH＝8.0。
HRP(即辣根过氧化物酶)溶液：2mg HRP(即辣根过氧化物酶)与1ml PBS(磷酸盐缓冲液，0.2μM,pH＝8.0)配制成浓度为2mg/ml。
AA(即花生四烯酸)：浓度为10mM。
TMPD(即N,N,N’,N’-四甲基对苯二胺二盐酸盐)溶液：8mg TMPD与2mlPBS(0.2μM,pH＝8.0)配制4g/L的母液，临用前稀释5倍为0.5g/L。
5-LOX溶液：30ul 5-LOX与1970uL PBS(0.2μM,pH＝8.0)配制成浓度为0.1ug/ml。
步骤：将岩豆素溶于DMSO，配置溶液浓度为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml，设置三个平行组，如表4所示进行分组以及加样，加样至PBS后线性振摇60s，37℃孵育10min，后加入AA与TMPD，最终于酶标611nM下进行吸光度检测，检测抑制率。
表4实验分组及加样情况
样品浓度确定：
预实验：10mM约3mg/ml的最高浓度加样(2ul+28uL PBS)，2倍稀释5个浓度加样抑制率大约20％。
正式实验：将实验浓度升高到10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml，加样1uL。
抑制率计算公式＝1-(A样-A空)/(A标-A空)；其中，A样表示样品组吸光度，A空表示空白组吸光度，A标表示对照组吸光度。
抑制结果如表5、图4-5所示。
表5、抑制率结果
使用GraphPad Prism 5.0进行IC50计算，可以得到半数有效抑制浓度为3.3mg/ml，即9mM，体系为100ul的反应体系，即IC50为90μM。
结果表明岩豆素具有很好的5-LOX抑制活性。
实施例3胶质瘤细胞体外抑制试验
胶质瘤细胞U87
细胞实验浓度：
预实验浓度最高浓度为20ug/ml
正式实验：岩豆素，母液10mg/ml＝28mM，将溶液用培养基稀释至112μM、56μM、28μM、14μM、7μM进行细胞培养，(DMSO控制在0.4％)，培养48小时，测MTT，观察岩豆素对细胞的抑制情况，结果如表6、图6所示。
表6、岩豆素对胶质瘤母细胞的存活结果
注：SEM表示标准误，可理解为±SEM。
细胞实验研究结果表明：岩豆素对细胞的半数最大效应浓度EC50为1.484mg/ml，折合体系浓度为：16.576μM，表明岩豆素能够很好的抑制胶质瘤细胞。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.岩豆素在制备用于预防和/或治疗与5-LOX相关的疾病或病症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述岩豆素抑制5-LOX活性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与5-LOX相关的疾病或病症为与5-LOX相关的肿瘤或癌症。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述与5-LOX相关的肿瘤或癌症选自结肠癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、脑膜瘤和胶质瘤。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述5-LOX相关的疾病或病症包括但不限于脑缺血性损伤、PD炎症、神经退行性疾病、神经元损伤、脑脊髓损伤、帕金森病、阿尔兹海默病、溃疡性结肠炎和急性胰腺炎等疾病。
6.岩豆素在制备用于抑制5-LOX活性的制品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制品为5-LOX抑制剂药物。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制品为5-LOX抑制剂实验模型工具药。
9.用于治疗与5-LOX相关的疾病的药物组合物或药物制剂，其包含岩豆素。
10.根据权利要求9所述的组合物或药物制剂，其特征在于，岩豆素作为活性成分占该组合物或药物制剂总重量的1-99％。
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