KR101373120B1

KR101373120B1 - 엉겅퀴 추출물을 함유하는 간성상세포 활성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101373120B1
Application number: KR1020120029136A
Authority: KR
Inventors: 정승일; 김상준; 장선일; 심재석; 김선영
Original assignee: 임실생약영농조합법인
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2014-03-13
Also published as: KR20130107408A

Abstract

본 발명은 엉겅퀴 추출물을 함유함으로써 간성상세포의 활성화를 억제함으로써 만성 간질환을 예방 및 개선할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

엉겅퀴 추출물을 함유하는 간성상세포 활성 억제용 조성물{Composition for inhibiting hepatic stellate cells activation}

간경변이나 간암과 같은 만성 간질환은 중요한 성인병의 원인 중 하나이다. 대개 정맥류 출혈이나 간기능 부전과 같은 간경변증의 합병증으로 사망하게 되므로, 만성 간염에서 비가역적인 간경변으로 진행하는 것을 막는 것이 만성 간질환을 치료하는 데 가장 중요하다.

간섬유화 과정에서 핵심적인 역할을 하는 세포는 간성상세포(hepatic stellate cells)이다.^8,9)바이러스나 알콜 등과 같은 독성 물질에 의해 간세포가 손상을 받게 되면 쿠퍼세포가 손상된 간세포를 대식하고, 이 과정에서 쿠퍼세포는 여러 가지 종류의 사이토카인을 분비하여 휴지기의 간성상세포를 활성화시킨다. 활성화된 간성상세포는 세포 변형이 일어나 콜라젠과 같은 세포외 기질(extracellar matrix)을 생성하는데, 지속적인 간 손상이 유발되는 반성 간질환에서는 결국 세포외 기질이 지속적으로 생성되어 간의 많은 부분을 차지함으로서 비가역직인 간경변으로 진행하게 된다.^10,11)간 성상세포의 활성화를 유도하는 인자는 PDGF(platelet-derived growth factor, 혈소판유래 생장인자), TGF-β(Trnasforming growth factor-β) 등이 있다. 간 손상시 이러한 인자들에 의해 간 성상세포의 수는 급격하게 증가하게 된다.¹²⁾

본 발명자들은 간성상세포의 수가 증가하는 것을 억제함으로써 활성화를 방지할 수 있으면서, 신체에 안전한 천연 물질을 찾고자 천연 약용식물을 대상으로 연구한 결과, 엉겅퀴 추출물이 간성상세포의 활성화를 유도하는 인자에 의한 간성상세포의 수의 증가를 억제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 간성상세포의 활성화를 억제함으로써 만성 간질환을 예방 및 개선할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 엉겅퀴 추출물을 함유하는 간성상세포 활성화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 간성상세포의 활성화를 방지함으로써 간섬유화 과정의 진행을 억제하고 따라서 중요 성인병 중 하나인 간경변이나 간암과 같은 만성 간질환의 진행을 예방 또는 개선하는데 효과적이다.

도 1은 엉겅퀴 부위별 추출물에 포함된 실리마린 함량의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 엉겅퀴 추출물에 의한 간성상세포 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 엉겅퀴 추출물의 독성을 평가한 결과는 나타낸 것이다.

본 발명의 조성물은 엉겅퀴 추출물을 함유함으로써, 산화적 스트레스에 의한 세포의 손상으로부터 세포를 보호할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 엉겅퀴는 학명이 Cirsium japonicum var. ussuriense이며, 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 한방에서는 지상부 또는 지하부(뿌리)를 대계라하여 약용으로 활용해왔다. 즉, 잎, 줄기, 꽃과 씨 등 지상부는 개화시기에서 씨가 여무는 5~6월에 채취하고 뿌리는 가을에 채취하여 건조시킨 후 열수 또는 알코올 추출에 의한 약성분을 토혈, 혈뇨, 대하, 간염 및 고혈압 등 치료에 활용해왔다. 엉겅퀴 잎과 꽃은 생리활성이 우수한 아피제닌, 루테올린, 미리세틴, 캄페롤, 펙토리나린, 5,7-디하이드록시-6,4'-디메톡시플라본, 히스피둘린-7-네오-헤스페리오시드 등의 플라보노이드 계열의 화합물이 풍부하여 항염증, 항암, 항돌연변이, 항진균, 신경보호 및 면역 증진 활성을 가지고 있다.

본 발명에서 사용하는 엉겅퀴 추출물은 엉겅퀴에서 침출, 전출하여 얻은 침출액 뿐만 아니라, 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물 또는 상기 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스 및 엉겅퀴 중에 함유되어 주 효과를 발휘하는 화학 물질은 물론 식물 그 자체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서는 줄기, 뿌리, 꽃, 잎 등 엉겅퀴의 모든 부분으로부터의 추출물을 사용할 수 있으며, 어느 특정 부분의 추출물로 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 엉겅퀴 추출물의 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 엉겅퀴를 세절하고 건조한 후 물 또는 유기용매를 넣고, 환류 추출하여 침적시킨 후 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 엉겅퀴 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매에서 선택될 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 열수 추출물 또는 알코올 추출물을 이용할 수 있다.

또한, 상기와 같이 얻은 추출물은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 건강식품의 형태로 제조될 수 있다. 조성물 내 엉겅퀴 추출물의 함량은 특히 제한되는 것은 아니지만, 건강식품의 형태에 따라 엉겅퀴 추출물을 조성물 1kg 당 1mg 내지 1000mg의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용하는 엉겅퀴 추출물은 간성상세포의 활성화를 유도하는 인자인 PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(Trnasforming growth factor-β) 등에 의한 간성상세포 수의 증가를 억제할 수 있어, 본 발명의 조성물은 간성상세포의 활성화에 따른 간섬유화 과정의 진행을 방지하여 만성 간질환의 예방 및 개선에 도움을 줄 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[참고예 1] 시약 및 기기

추출을 위해하여 사용한 용매인 MeOH는 1급 시약을 사용하였으며, 디메틸 술폭시드(DMSO)와 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(MO, USA)로부터 구입하였다. 실리마린(Silymarin)의 정량을 위해 사용한 HPLC는 Agilent 1200 Series를, 컬럼은 Synergi Hydro-RP C18(4.6 × 150mm, 4μm, Phenomenex)을 사용하였다.

[참고예 2] 엉겅퀴 추출물의 제조

실험에 사용한 엉겅퀴(C. japonicum var. ussuriense)는 전라북도 임실군 오수면 소재 임실생약영농조합법인에서 재배한 것으로 줄기와 꽃은 2011년 5월 30일에 채취하였으며, 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본 (JBMI-011)은 전주생물소재연구소 식의약품안전관리실에 보관하고 있다. 추출을 위해 꽃과, 뿌리를 음건한 후 적당한 크기로 분쇄하여 시료 100g에 대해 10배의 MeOH를 넣어 60℃에서 4시간 동안 2회 온침 추출하였다. 추출된 시료는 여과 후 수욕상에서 감압농축하여 완전 건고시킨 다음 건조물의 무게를 측정한 뒤 100mg/mL의 농도가 되도록 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용매에 녹인 뒤 -20℃에서 냉동보관하면서 실험에 사용하였다.

[시험예 1] 엉겅퀴 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량의 측정

엉겅퀴 꽃과 뿌리의 추출물의 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위하여, Folin-Denis법¹³ ⁾을 이용하였다. MeOH에 1mg/mL 농도로 용해시킨 시료액 300μL와 Folin-Denis 시약 300μL를 혼합하여 1분간 반응시킨 뒤 7% Na₂CO₃ 용액 300μL를 혼합하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 갈산을 0~500μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물이 함량을 mg/g 갈산으로 구하였고, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 엉겅퀴 꽃과 뿌리의 추출물의 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여, Moreno 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.¹⁴⁾ 시료는 페놀성 화합물과 같은 농도로 MeOH에 녹인 후 시료액 100μL와 10% 질산 알루미늄 20μL, 1M 아세트산칼륨 20μL, MeOH 860μL를 차례로 가한 뒤 40분간 상온에서 반응시킨 후 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 퀘르세틴 0~500μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 플라보노이드 함량을 mg/g 퀘르세틴으로 구하였고, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

엉겅퀴 꽃 또는 뿌리 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

	CJ-F	CJ-R
폴리페놀 (mg/g GAE¹ ⁾)	93.65 ± 1.51³⁾	27.31 ± 0.21
플라보노이드 (mg/g QE² ⁾)	37.95 ± 1.20	3.45 ± 0.21

¹⁾GAE: 갈산 당량

²⁾QE: 퀘르세틴 당량

³⁾값은 평균±SEM (n=6)

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 꽃의 경우 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 93.65mg/g과 37.95mg/g으로 측정되었으며, 뿌리 중에는 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 27.31mg/g과 3.34mg/g으로 나타났다. 꽃 추출물이 뿌리 추출물에 비해 폴리페놀의 경우 약 3배 이상, 플라보노이드는 10배 이상 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

식물에 분포되어 있는 페놀성 물질은 페놀성 수산기에 의해 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합을 형성하며, 항산화, 항염, 항균 등 다양한 생리활성을 나타낸다. 폴리페놀이 간질환에 미치는 영향에 대한 연구는 현재까지 많이 보고되었다. 엉겅퀴의 경우 실리마린계 폴리페놀 화합물이 간염 및 간경화등 다양한 간질환에서 효과가 있다고 밝혀졌으며 이러한 효능은 실리마린의 항산화, 항염증, 면역조절 등의 기전과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.¹⁶⁾

[시험예 2] 실리마린 함량의 분석

엉겅퀴 부위별 추출물을 MeOH(꽃, 90.3mg/mL; 뿌리, 103.5mg/mL)에 녹인 후 원심분리(13,475×g, 5분)하여 상등액을 취하여 50% MeOH(aq. v/v)로 희석하였다. 분석은 Liu 등의 방법¹⁵ ⁾으로 실시하였다. 분석을 위해 Synergi Hydro-RP C18, 4.6×150mm, 4μm 컬럼(Phenomenex)과 MWD(Multi-wavelength detetror)를 장착한 HPLC(Agilent 1200 series)를 사용하였다. 분석용매는 아세토니트릴(A)과 0.1% 포름산(aq, B)을 사용하여 구배 조건(0분-20% A, 15분-30% A, 20분-40% A, 25분-45% A, 25분-45% A, 30분-45% A, 35분-20% A)으로 유속 0.8mL/분으로 사용하였다. 시료 주입량은 15μL이며, 288nm 흡광도에서 정량 분석하였다. 결과는 도 1 및 표 2 및 3에 나타내었다.

샘플 내 실리마린의 농도(μg/mg)

샘플 ID	분석물	희석인자	계산 결과 (μg/mL)	획득 결과 (μg/mg)
CJ-F	A	100	3401.76	37.67
CJ-R	B		2152.77	23.84
	C		N.C.	N.D.
	D		105.03	1.16
	E		244.47	2.71
	A		1081.05	10.44
	B		199.19	1.92
	C		N.C.	N.D.
	D		N.C.	N.D.
	E		99.98	0.97

CJ-F: 엉겅퀴 꽃

CJ-R: 엉겅퀴 뿌리

N.C.: 계산되지 않음.

N.D.: 검출되지 않음.

HPLC에 의한 보존 시간에 따른 실리마린의 주요 활성 화합물의 검출

분석물	T_R ¹ ⁾	예측 분석물
A	10.43	탁시폴린
B	13.16	실리크리스틴
C	13.53	실리디아닌 (이소실리크리스틴)
	(18.79)	(실리빈 A)
D	18.03	실리빈 B
E	18.98	이소실리빈 A(이소실리빈 B)

¹⁾ T _R: 보존 시간

엉겅퀴 꽃 및 뿌리에서 실리마린을 정량하기 위해 HPLC를 이용하여 분석하였으며, 실리마린 표준물질의 크로마토그램은 도 1A에 나타낸바와 같이 대표적으로 5개의 피크를 확인하였으며, 그 중 피크 A의 보존 시간은 10.43분, 피크 B는 13.16분, 피크 C는 13.53분, 피크 D는 18.03분, 피크 E는 18.98분으로 나타났다.

또한 표 2에서 나타낸 바와 같이 해당 피크 중 엉겅퀴 꽃 추출물(CJ-F)에서 피크 B가 엉겅퀴 뿌리 추출물(CJ-R)과 비교하여 상대적으로 많은 함량을 나타냈다. 엉겅퀴 꽃 추출물에서 피크 B의 함량은 2152.77μg/mL로 측정되었으며, 엉겅퀴 뿌리 추출물에서는 1081.05μg/mL로 측정되었다. 결과 약 2배 가량 높게 존재하는 결과를 보였다. 이외에도 엉겅퀴 꽃 추출물이 뿌리 추출물에 비해 피크 A, D, E 등에서도 비교적 높은 함량 분포를 보임을 알 수 있었다.

Liu¹⁵ ⁾ 등에 의해 보고된 결과를 참고하였을 때 해당 피크에 대한 정보는 표 3에 나타낸 바와 같이 예상할 수 있다. 실리마린의 함량 분석결과에서도 폴리페놀과 플라보노이드와 같이 엉겅퀴 꽃 추출물에서 높은 양으로 존재하는 것을 확인 할 수 있었다.

[시험예 3] 간성상세포 성장 억제 효과

Fridemann(Columbia University, New York) 교수로부터 얻은 인간 간 성상세포(LX-2 세포)와 HEK-293 세포(Human embryonic kidney cell, ATCC, Rockville, MD, USA)의 배양은 37℃에서 대기와 5% CO₂ 조건에서 시행하였다. 간 성상세포와 HEK-293를 100mm 배양접시(Falcon, Becton Dickinson, Fanklin Lakes, NJ, USA)에서 배양하였으며, 10% 열불활성화 소태아혈청(heat inactivated fetal bovine serum(FBS), Invitrogen, USA)과 항생제가 포함된 배지를 이용하였다. 세포배양시 배지는 LX-2 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's, Invitrogen), HEK-293 세포는 RPMI 1640(Invitrogen)을 사용하였다.

LX-2 세포 및 HEK-293 세포를 96-웰 플레이트(20,000/웰, Falcon)에서 24시간동안 10% FBS가 포함된 DMEM으로 배양한 후 LX-2 세포는 무혈청 DMEM으로 교환하여 24시간 후에 엉겅퀴 꽃과 뿌리 추출물을 녹인 DMSO용액을 1~100μg/mL의 농도로 전 처리한 뒤 TGF-β1(10ng/mL)과 PDGF-BB(25ng/mL)를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 대조군에 대한 세포의 성장도를 백분율로 구하여, 결과는 도 2에 나타내었다. 이 때, 각 실험 결과를 종합하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계적 분석은 Student's t-test를 사용하였고 P < 0.05일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

도 2를 보면, LX-2 세포에 PDGF-BB를 처리하면 대조군에 비해 1.5배 이상 성장이 촉진되었고, 엉겅퀴 꽃과 뿌리 추출물을 전처리하였을 때 PDGF-BB로 유도된 성장을 유의하게 억제하였음을 알 수 있다. PDGF-BB에 의한 활성 억제는 뿌리 추출물에 비해 꽃 추출물이 50배 정도 낮은 농도에서 보다 더 효과적이었다(도 2A). 또한 TGF-β1으로 유도된 활성도 꽃 추출물이 뿌리 추출물에 비해 우수한 억제 효과를 보였고, 이는 PDGF-BB와 유사한 경향을 보였다(도 2B).

[시험예 4] 엉겅퀴 추출물의 독성 평가

정상세포에서의 엉겅퀴 추출물의 독성을 확인하기 위해 HEK-293 세포에 대한 독성을 평가하였다.

Fridemann(Columbia University, New York) 교수로부터 얻은 HEK-293 세포(Human embryonic kidney cell, ATCC, Rockville, MD, USA)의 배양은 37℃에서 대기와 5% CO₂ 조건에서 시행하였다. HEK-293를 100mm 배양접시(Falcon, Becton Dickinson, Fanklin Lakes, NJ, USA)에서 배양하였으며, 10% 열불활성화 소태아혈청(heat inactivated fetal bovine serum(FBS), Invitrogen, USA)과 항생제가 포함된 배지를 이용하였다. 세포배양시 배지는 RPMI 1640(Invitrogen)을 사용하였다.

HEK-293 세포를 96-웰 플레이트(20,000/웰, Falcon)에서 24시간동안 10% FBS가 포함된 DMEM으로 배양한 후, HEK-293 세포에 엉겅퀴 꽃과 뿌리 추출물을 녹인 DMSO 용액을 1~100μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포의 성장은 5-(3-카르복시메톡시페닐)-2H-테트라졸리움 염(MTS, Promega, Heidelberg, Germany) 분석법에 따라 측정하였다. 이는 마이토콘드리아 탈수소효소에 의하여 MTS가 포르마잔으로 전환되는 것을 측정한 것이다. MTS 시약을 웰 당 20μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 2시간 이상 반응시킨 뒤에 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 세포의 성장도를 백분율로 백분율로 구하여, 결과는 도 3에 나타내었다. 이 때, 각 실험 결과를 종합하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계적 분석은 Student's t-test를 사용하였고 P < 0.05일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

엉겅퀴 꽃 및 뿌리 추출물의 HEK-293 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과 도 3에서와 같이 1~100μg/ml의 농도에서 생존률을 나타내었다. 이와 같은 세포생존율은 엉겅퀴 꽃이나 뿌리가 간 성상세포에서 나타내는 효능이 세포독성에 의한 것이 아닌 PDGF-BB나 TGF-β1으로 인한 세포 증식을 억제시켜 감소시키는 것을 보여주는 결과이다.

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Claims

엉겅퀴의 꽃 및 뿌리의 메탄올 추출물을 함유하는 간경변, 간암 및 만성 간염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 만성 간질환의 예방 및 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 엉겅퀴 추출물을 조성물 1kg 당 1mg 내지 1000mg의 양으로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 건강식품임을 특징으로 하는 조성물.