JP2017155012A

JP2017155012A - 小豆抽出物

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Publication number: JP2017155012A
Application number: JP2016040945A
Authority: JP
Inventors: 藤井　博; Hiroshi Fujii; 博藤井; 秀文真壁; Hidefumi Makabe; 誠一河原; Seiichi Kawahara
Original assignee: ST COUSAIR KK; Shinshu University NUC
Current assignee: ST COUSAIR KK; Shinshu University NUC
Priority date: 2016-03-03
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2017-09-07

Abstract

【課題】従来知られていない、より有用な新たな小豆の作用を見出すことを課題とする。さらに詳しくは、小豆の水抽出物について有用な作用を見出し、これを有効成分とする剤を提供することを課題とする。【解決手段】小豆の水抽出物や、これを吸着剤や担体に吸着させて、メタノール、エタノール等の溶媒で溶出して得たものを有効成分として、癌の転移抑制剤やＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤、癌の増殖抑制剤等の抗癌剤を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、小豆の水抽出物に関する。また、該抽出物を有効成分として含む抗癌剤に関する。さらに本発明は、該抽出物を有効成分として含む癌の転移抑制剤、ＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤および癌の増殖抑制剤等に関する。

小豆は高蛋白低脂質であり、無機質やビタミン、ミネラル、食物繊維等を多く含む栄養価の高い食品として幅広い世代に食されている。近年では、小豆に含まれるサポニン等の成分に抗菌作用、溶菌作用、抗炎症作用、抗癌作用などのさまざまな作用があることも報告されている。

例えば、特許文献１には、赤小豆（小豆およびしま蔓小豆）抽出物として特定の構造を有する化合物がＩＬ−６によって誘導されるＳＴＡＴ３の転写活性抑制効果を有することが開示されており、炎症性疾患、自己免疫疾患、がん疾患等のＴＬＲおよびＩＬ−６媒介性疾患の予防または治療に有用であると記載されている。
また、非特許文献１には、小豆の熱水抽出物がラットの好塩基球性白血病細胞における抗原刺激による脱顆粒を抑制し、マウスにおける受動皮膚アナフィラキシー反応も抑制したことが開示されている。

さらに、特許文献２には、ハッショウ豆、紫花豆、小豆等の豆科植物の抽出物が免疫機能増強活性や癌細胞に対するアポトーシス誘導能を有することが開示されており、非特許文献２においても、小豆熱水抽出物の逆相吸着剤を用いた分画の４０％エタノール溶出画分にヒト胃がん細胞のアポトーシス誘導能があることが記載されている。
そして、非特許文献３には、これと同様の小豆熱水抽出物の４０％エタノール溶出画分がマウスのメラノーマ細胞の付着、浸潤および転移を抑制したことが記載されている。
このように、小豆のさまざまな作用が開示されているが、本発明者らは本発明において、より有用な新たな小豆の作用を見出すことを試みた。

特表２０１４−５１６９３９号公報特開２００８−８１４７８号公報

ＴｏｍｏｈｉｒｏＩｔｏｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１００３−１０１１（２０１２）伊藤智広、伊藤裕子、樋廻博重、勝崎裕隆、今井邦雄、古市幸生、小宮孝志（２００５）．アズキ熱水抽出物（アズキ煮汁）中に含まれるヒト胃がん細胞に対するアポトーシス誘導物質の同定日本栄養・食糧学会誌第５８巻第５号２８１−２８７．ＴｏｍｏｈｉｒｏＩｔｏｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（３），４４８−４５４，２００５

本発明は、従来知られていない、より有用な新たな小豆の作用を見出すことを課題とする。さらに詳しくは、小豆の水抽出物について有用な作用を見出し、これを有効成分とする剤を提供することを課題とする。

本発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、小豆の水抽出物や、これを吸着剤や担体に吸着させて、メタノール、エタノール等の溶媒で溶出して得たものが、癌の転移抑制作用、ＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制作用や、癌の増殖抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によって得られる小豆の水抽出物は、癌の転移抑制剤や増殖抑制剤等の抗癌剤の有効成分として活用することができる。

即ち、本発明は、次の（１）〜（１１）に示される抗癌剤、癌の転移抑制剤、癌の増殖抑制剤等に関する。
（１）小豆の水抽出物を有効成分として含む抗癌剤。
（２）次のＡの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分として含む上記（１）に記載の抗癌剤。
Ａ．小豆を常温水で抽出する工程
（３）さらに、次のＢおよびＣの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む上記（２）に記載の抗癌剤。
Ｂ．Ａの工程によって得られた小豆の常温水抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮する工程
Ｃ．Ｂの工程によって濃縮されたものをメタノールで溶出する工程
（４）さらに、次のＤおよびＥの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む上記（３）に記載の抗癌剤。
Ｄ．Ｃの工程によって溶出されたものをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着する工程
Ｅ．Ｄの工程によって吸着されたものを６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程
（５）さらに、次のＦおよびＧの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む上記（４）に記載の抗癌剤。
Ｆ．Ｅの工程によって溶出されたものをシリカゲルにオクタデシル基を化学結合した無極性の充填剤に吸着する工程
Ｇ．Ｆの工程によって吸着されたものを１０％以上のメタノールまたはアセトニトリルで溶出する工程
（６）次のＨ〜Ｊの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分として含む上記（１）に記載の抗癌剤。
Ｈ．小豆を熱水で抽出する工程
Ｉ．Ｈの工程によって得られた小豆の熱水抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮する工程
Ｊ．Ｉの工程によって濃縮されたものをメタノールで溶出する工程
（７）さらに、次のＫおよびＬの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む上記（６）に記載の抗癌剤。
Ｋ．Ｊの工程によって溶出されたものをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着する工程
Ｌ．Ｋの工程によって吸着されたものを６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程
（８）癌が前立腺癌である上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗癌剤。
（９）小豆の水抽出物を有効成分として含む癌の転移抑制剤。
（１０）小豆の水抽出物を有効成分として含むＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤。
（１１）小豆の水抽出物を有効成分として含む癌の増殖抑制剤。

本発明によって、小豆の水抽出物を有効成分として活用することにより、癌の転移抑制剤や増殖抑制剤等の抗癌剤を新たに提供することが可能となる。本発明の小豆の水抽出物は、前立腺癌に特に有用であることが確認されていることから、前立腺癌の予防や、前立腺肥大の改善等に幅広く利用することができる。

小豆抽出物Ｃ〜Ｆの調製手順（概要）を示した図である。小豆抽出物Ｇ〜Ｋの調製手順（概要）を示した図である。癌細胞の増殖抑制試験の結果を示した図である（試験例１）。癌細胞の増殖抑制試験の結果を示した図である（試験例１）。癌細胞の増殖抑制試験の結果を示した図である（試験例１）。ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験の結果を示した図である（試験例２）。ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験の結果を示した図である（試験例２）。ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験の結果を示した図である（試験例２）。ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験の結果を示した図である（試験例２）。ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験の結果を示した図である（試験例２）。癌の増殖抑制試験におけるＧＦＰで蛍光化した癌を示した写真である（試験例３）。癌の増殖抑制試験におけるＧＦＰで蛍光化した癌の面積を示した図である（試験例３）。癌の増殖抑制試験における癌の重量を示した図である（試験例３）。癌の増殖抑制試験におけるマウスの体重の変化を示した図である（試験例３）。

本発明の「抗癌剤」とは、癌細胞の転移抑制作用や、増殖抑制作用を有する、癌の治療や予防に有用な剤のことをいう。
本発明の「抗癌剤」は、小豆の水抽出物を有効成分として含む剤であれば良く、この有効成分のみからなる剤であっても良く、有効成分に加えて薬学的に許容される担体や薬剤の形成において必要となる成分等を含むものであっても良い。さらに、本発明の有効成分に対して相乗的な効果を示す、癌の転移抑制作用や増殖抑制作用などの抗癌作用を有する他の有効な成分を配合したものであっても良い。

本発明の「小豆の水抽出物」とは、小豆を由来として水で抽出される抽出物のことをいう。小豆はいずれの品種の小豆であってもよく、例えば、大納言小豆、中納言小豆、白小豆、えりも小豆または黒小豆等が挙げられる。
このような「小豆の水抽出物」には、小豆を冷水、常温水、熱水等で抽出して得られる小豆の水抽出物等が挙げられる。また、このように水によって抽出された「小豆の水抽出物」を吸着剤や担体などに吸着させ、他の溶媒で溶出したものや、分離精製したものであってもよい。

この「吸着剤」としては、逆相シリカ、ポリスチレン系合成樹脂、アクリル系合成樹脂等を用いた吸着剤が挙げられ、特にスチレン系多孔性合成吸着剤を用いることが好ましい。これらの吸着剤は市販の合成吸着剤であってもよく、例えば、逆相シリカとしてシリカゲルにオクタデシル基を化学結合した無極性のシリカゲル等が挙げられる。また、アンバーライト（商標）ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（オルガノ社製）（以下、ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎと示す場合がある）、アンバーライト（商標）ＸＡＤ（商標）−７ＨＰ（オルガノ社製）（以下、ＸＡＤ（商標）−７ＨＰと示す場合がある）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社）、またはＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）Ｃ１８（Ｂ▲Ｕ▼ＣＨＩ株式会社）等が挙げられる。

本発明の「抗癌剤」は、例えば、小豆の水抽出物を「吸着剤」で吸着したものを集め濃縮する工程を経た後、濃縮されたものをメタノール、含水メタノール、エタノール、含水エタノール、イソプロピルアルコールまたはアセトニトリル等の溶媒で溶出することで製造することができる。この溶出には特に１００％メタノールを溶媒として用いることが好ましい。

また、「担体」としては、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体が挙げられる。この担体は市販の担体であっても良く、例えば、デキストランをベースとするＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）、ポリビニル系のＴＯＳＯＨＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社）等が挙げられる。

本発明の「抗癌剤」は、また、例えば、上記のように「吸着剤」で吸着した後、メタノール等の溶媒で溶出したものを「担体」に吸着する工程を経た後、吸着されたものをエタノール、アセトン、アセトリニトリル等の溶媒で溶出することで製造することができる。この溶出には特に６０％以上のエタノール、６０％以上のアセトンや４０％以上のアセトニトリルを溶媒として用いることが好ましい。

このように製造された「小豆の水抽出物」として、例えば、次の１）〜６）に示されるものが挙げられる。
１）小豆を常温水で抽出する工程を経て得られる抽出物。
２）上記１）の抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮した後、濃縮されたものをメタノールで溶出する工程を経て得られる抽出物。
３）上記２）の工程によって溶出されたものをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着した後、６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程経て得られる抽出物。
４）上記３）の工程によって溶出されたものをシリカゲルにオクタデシル基を化学結合した無極性の充填剤に吸着した後、１０％以上のメタノールまたはアセトニトリルで溶出する工程を経て得られる抽出物。
５）小豆を熱水で抽出し、得られた小豆の熱水抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮した後、濃縮されたものをメタノールで溶出する工程を経て得られる抽出物。
６）上記５）の抽出物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着した後、吸着されたものを６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程を経て得られる抽出物。

本発明の「抗癌剤」のひとつである「癌の転移抑制剤」とは、血行性転移、リンパ行性転移または播種性転移により、他の組織へ原発巣や既に腫瘍が転移した組織から他の組織に腫瘍が転移することを抑制する剤のことをいう。このような本発明の「癌の転移抑制剤」は、癌の転移誘導遺伝子であるＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を有する「ＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤」として作用する剤であることが好ましい。
また、本発明の「癌の増殖抑制剤」とは、腫瘍が生じた組織（原発巣）や腫瘍が転移した組織における腫瘍細胞の増殖を抑制し得る剤のことをいう。
これらの「癌の転移抑制剤」、「ＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤」や「癌の増殖抑制剤」は、小豆の水抽出物を有効成分として含む剤であれば良く、この有効成分のみからなる剤であっても良く、有効成分に加えて薬学的に許容される担体や薬剤の形成において必要となる成分等を含むものであっても良い。さらに、本発明の有効成分に対して相乗的な効果を示す、ＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制作用、癌の転移抑制作用や増殖抑制作用などの抗癌作用を有する他の有効な成分を配合したものであっても良い。

これらの本発明の「癌の転移抑制剤」や「癌の増殖抑制剤」等が予防、治療等の対象とする「癌」は、本発明の「腫瘍の転移抑制剤」や「癌の増殖抑制剤」が有効に作用する「癌」であれば従来知られているいずれのものであってもよい。特に前立腺癌、乳癌または大腸癌等を対象とすることが好ましい。

以下に実施例および試験例を示し、さらに本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。

〔実施例１〕
小豆抽出物の調製
１．小豆抽出物Ａ
小豆５００ｇを常温下、精製水（常温）２Ｌに一昼夜浸した後、濾過により小豆を除き小豆抽出液を得た。この小豆抽出液の一部をエバポレーターにて減圧下、バス温度４５℃で濃縮して濃縮物（小豆抽出物Ａ）を得た。
比較として、濾過により得られた小豆の残渣に４０％エタノールを加え、室温で３６時間静置した後、綿濾過し、得られた濾過液をエバポレーターにて減圧下、バス温度４５℃で濃縮して濃縮物（比較抽出物ａ）を得た。

２．小豆抽出物Ｂ
上記１の小豆抽出液の一部を綿濾過し、ガラスカラム（φ６ｃｍ×１ｍ）に充填したアンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）に吸着させた。アンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）は、充填前に、あらかじめ洗浄し、精製水に置換したものである。
この非吸着物を精製水４．５Ｌで洗浄し、次いで吸着物を酢酸エチル４．５Ｌ、メタノール４．５Ｌで順次溶出した。得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温度４５℃で濃縮して濃縮物を得た。このうちメタノールで溶出して得た濃縮物を小豆抽出物Ｂとした。また、酢酸エチルで溶出したものとメタノールで溶出したものを濃縮してあわせたものを混合小豆抽出物とした。

３．小豆抽出物Ｃ〜Ｆ
１）小豆１ｋｇを常温下、精製水（常温）４Ｌに一昼夜浸した後、濾過により小豆を除き小豆抽出液を得た。この小豆抽出液を綿濾過し、ガラスカラム（φ６ｃｍ×１ｍ）に充填したアンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）に吸着させた。アンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）は、充填前に、あらかじめ洗浄し、精製水に置換したものである。
この非吸着物を精製水４．５Ｌで洗浄し、次いで吸着物を酢酸エチル４．５Ｌ、メタノール４．５Ｌで順次溶出した。得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温４５℃で濃縮して酢酸エチル画分またはメタノール画分の濃縮物を得た。
２）上記１）にて得た濃縮物をあらかじめ２０％エタノールに置換したＴｏｙｏｐｅｒａｌＨＷ４０Ｆ（２００ｍｌ）に供し、８００ｍＬの２０％エタノール、６０％エタノールおよび６０％アセトンで順次溶出した。得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温４５℃で濃縮して、酢酸エチル画分から２０％エタノール溶出画分の濃縮物（比較抽出物ｂ）、６０％エタノール溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｃ）および６０％アセトン溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｄ）を得た。また、メタノール画分から２０％エタノールの溶出画分の濃縮物（比較抽出物ｃ）、６０％エタノールの濃縮物（小豆抽出物Ｅ）および６０％アセトンの溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｆ）を得た。図１に抽出物Ｃ〜Ｆの調製手順（概要）を示した。

４．小豆抽出物Ｇ〜Ｋ
上記３において得た小豆抽出物Ｆ（１．１ｇ）を３倍量の１０％メタノールに溶かした溶液をＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）Ｃ１８（８０ｇ）に吸着させた。
吸着物を１０％メタノール６００ｍＬ、２０％メタノール５００ｍＬ、３０％メタノール５００ｍＬ、４０％メタノール５００ｍＬおよび１００％アセトニトリル５００ｍＬで順次溶出した。得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温４５℃で濃縮して、１０％メタノール溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｇ）、２０％メタノール溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｈ）、３０％メタノール溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｉ）、４０％メタノール溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｊ）および１００％アセトン溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｋ）を得た。図２に抽出物Ｇ〜Ｋの調製手順（概要）を示した。

５．小豆抽出物Ｌ小豆１．５ｋｇを精製水４Ｌに一昼夜浸した後、加熱し沸騰させ、これを３０分間加熱した後、熱時濾過した。得られた濾過液を冷却した後、綿濾過し、ガラスカラム（φ６ｃｍ×１ｍ）に充填したアンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）に吸着させた。アンバーライト（商標）−ＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎ（１．５Ｌ）は、充填前に、あらかじめ洗浄し、精製水に置換したものである。
この吸着物を酢酸エチル４．５Ｌ、メタノール４．５Ｌで順次溶出し、得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温４５℃で濃縮し濃縮物を得た。このうち酢酸エチルで溶出して得た濃縮物を比較抽出物ｄ、メタノールで溶出して得た濃縮物を小豆抽出物Ｌとした。

６．小豆抽出物Ｍ、Ｎ上記３にて得た小豆抽出物Ｃを、あらかじめ２０％エタノールに置換したＴｏｙｏｐｅｒａｌＨＷ４０Ｆ２００ｍｌに供し、次ぎの溶液で順次溶出し、得られた溶出液をそれぞれエバポレーターにて減圧下、バス温４５℃で濃縮し濃縮物を得た。
まず、８００ｍｌの２０％エタノールを流し、その溶出画分の濃縮物（比較抽出物ｅ）を得た。次に６０％エタノール８００ｍｌを流し、その溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｍ）を得て、さらに６０％アセトン８００ｍｌを流し、その溶出画分の濃縮物（小豆抽出物Ｎ）を得た。

［試験例］
本発明の試験例には、特に断りがない限り、次のように調製した試料を用いた。
１．小豆抽出物
実施例１で調製した小豆抽出物Ａ〜Ｎをそれぞれ用いた。
２．比較抽出物
実施例１で調製した比較抽出物ａ〜ｅをそれぞれ用いた。
また、本願発明者らの先出願（国際公開第２０１３／０８１０４６号パンフレット）において、ＰＣ−３細胞の増殖抑制が確認されたブドウ梗由来抽出物（以下、単にＧＳＥと示す場合がある）をポジティブコントロールとして用いた。ＧＳＥは次の手順により調製した。

ブドウ梗由来抽出物（ＧＳＥ）
１）除梗破砕機（Ａ−８）（ＢＡＵＣＨ社製）で分離されたブドウ（シャルドネＶｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ（Ｂｅａｕｎｏｉｓ，Ｍｏｒｉｌｌｏｎ））の梗を水で洗浄し、水切りした後、はさみで３センチ程度にカットした。カットした梗１ｋｇをステンレスの縦長バットに入れ、精製水を４Ｌ加え、上部をアルミホイルで覆い、水分が蒸発しないようにした。これをガスコンロで加熱し、９０℃以上に達した後、１時間沸騰を保ち熱水抽出を行った。
２）前記１）の熱水抽出終了後、大型ブフナーロートにて熱時ろ過（アドバンテックＮ０．２）した。得られた濾過液を熱水抽出物（粗抽出物Ａ）とし、室温まで冷却した。
３）前期２）のブドウ梗由来抽出物（粗抽出物Ａ）をそのまま１．５ＬのＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎに吸着させた。このＸＡＤ（商標）−１１８０Ｎは、あらかじめ、洗浄し、オープンガラスカラム（φ６ｃｍ×５５ｃｍ）に入れ、精製水で十分置換した物であった。
（１）精製水、（２）１００％酢酸エチルまたは（３）１００％メタノール（各３Ｌ）を溶出溶媒として順次溶出させ、それぞれの溶出液をエバポレーターで、４２℃で減圧下濃縮し、（１）精製水溶出物、（２）１００％酢酸エチル溶出物および（３）１００％メタノール溶出物を得た。このうちの（３）１００％メタノール溶出物を、ポジティブコントロールのブドウ梗由来抽出物（ＧＳＥ）とした。

３．ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）
ヒト前立腺癌細胞として財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より入手したＰＣ−３細胞を、ＦＢＳ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１０％添加したＲＰＭＩ培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。

〔試験例１〕
癌細胞の増殖抑制試験
ＰＣ−３細胞を９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）で各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。目視により細胞がだいたい１．５倍に増殖した段階で、各ウェルに６０％エタノールに溶解した小豆抽出物Ａ〜Ｉ、ＧＳＥおよび比較抽出物ａ〜ｅをそれぞれ０ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％、１．５ｗ／ｖ％または３．０ｗ／ｖ％となるように添加した。４８時間経過した段階で、ＭＴＴ溶液を１０μｌずつ添加し、４時間呈色反応（３７．０℃、ＣＯ_２５％）を行った。その後、培地を除去し、細胞可溶化溶液を１００μｌ添加してピペッティングした後、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの吸光度値を測定した。

その結果、小豆抽出物Ａ〜Ｎを添加した場合、ＧＳＥを添加した場合と同様に、濃度依存的にＰＣ−３細胞の増殖が抑制されることが確認できた。一方、比較抽出物ａ〜ｅを添加した場合には、ＰＣ−３細胞の増殖抑制は確認できなかった。
結果の一例として、小豆抽出物Ｃ〜Ｆ、比較抽出物ｂ、ｃを用いた場合の結果を図３に示し、小豆抽出物Ｇ〜Ｋを用いた結果を図４に示した。また、小豆抽出物Ｍ、Ｎおよび比較抽出物ｅを用いた結果を図５に示した。

［試験例２］
ＦＡＢＰ５遺伝子発現抑制試験
１）試料の調製
ＰＣ−３細胞を１２ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ（登録商標）ＭＵＬＴＩＤＩＳＨ）に播種し、各ｗｅｌｌが８割になるまで培養した。この各ウェルに６０％エタノールに溶解した小豆抽出物Ａ〜Ｎ、比較抽出物ａ〜ｅまたはＧＳＥをそれぞれ１．０ｗ／ｖ％の濃度になるように添加して培養した。
培養後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌを５００ｍｌ添加してピペッティングし、ＲＮＡを回収した。
回収したＲＮＡに１００ｍｌクロロホルムを添加し混合して室温で２〜３分置いた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ１５分４℃）し、上清を回収した。この上清に同量のイソプロパノールを添加し転倒混和して室温で１０分置いた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ１０分４℃）し、上清をデカンテーションした。
これに７０％エタノールを添加してペレットを洗浄した後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ５分４℃）し、上清をデカンテーションし、室温でペレットを乾燥した後、ＤＥＰＣ水を２０μｌ添加して溶解したものを試料とした。

２）ＲＴ−ＰＣＲ
ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（登録商標）キット（ＴＯＹＯＢＯ社製）および２×ＧｏＴａｑ（登録商標）ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
まず、上記１）で調製した試料をＤＥＰＣ水で２５０ｎｇ／μｌに希釈した。これを用いて表１の組成としたものを、サーマルサイクラーで工程１〜３で処理し（工程１．３０℃、１０分間、工程２．４２℃、６０分間、工程３．９５℃、５分間）、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ）を合成した。

合成したｃＤＮＡを鋳型とし、表２に示したＦＡＢＰ５遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号１、２）および、内因性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を増幅するプライマー（配列表配列番号３、４）、ｒＲＮＡ１８ｓを増幅するプライマー（配列表配列番号５、６）を用いて表３の組成としたものを、サーマルサイクラーで工程１〜３で処理し（工程１．９５℃、５分間、工程２．１）９５℃、３０秒間、２）５９℃、４０秒間、３）７２℃、１分間の１）〜３）を２５サイクル、工程３．７２℃、５分間）、ＤＮＡを増幅した。
増幅したＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色してＵＶ照射することにより、ＦＡＢＰ５遺伝子の発現の有無および程度を調べた。

３）結果
図６に示されるように、小豆抽出物ＡはポジティブコントロールであるＧＳＥと同等のＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示したが、比較抽出物ａにはこのような活性は確認できなかった。また、図７、８に示されるように、小豆抽出物Ｂ、Ｃ〜ＦもＧＳＥと同等のＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示した。従って、これらの結果より、小豆抽出物Ａ〜Ｆはいずれも癌細胞の転移抑制効果を有することが示唆された。
図９に小豆抽出物Ｇ〜Ｋを用いた場合の結果を示した。小豆抽出物Ｉ〜ＫはいずれもＧＳＥと同等のＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示したが、小豆抽出物Ｇ、ＨはＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示さなかった。この結果および試験例１の結果より、小豆抽出物Ｉ〜Ｋは癌細胞の増殖抑制効果も転移抑制効果も有するが、小豆抽出物Ｇ、Ｈは癌細胞の転移抑制効果は有さず、増殖抑制効果を有するものであると示唆された。
図１０に示されるように、小豆抽出物Ｍ、ＮはいずれもＧＳＥと同等のＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示し、癌細胞の転移抑制効果を有することが示唆された。
また、小豆抽出物Ｌおよび比較抽出物ｄを用いた場合においても、小豆抽出物ＬがＦＡＢＰ５遺伝子の発現抑制活性を示し、転移抑制効果も有することが示唆された。

［試験例３］癌の増殖抑制試験
実施例１で調製した混合小豆抽出物を用い、マウスにおける癌の増殖抑制効果を調べた。
なお、全ての動物試験はＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）−ｐｒｏｔｏｃｏｌに準拠し、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＡｎｉｍａｌｕｎｄｅｒＡｓｓｕｒａｎｃｅＮｕｍｂｅｒＡ３８７１−１に従って行った。

１．ヒト前立腺癌皮下移植マウスモデルの作製
１）マウスの飼育
４−６週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕ）雄１０匹を１グループとして２群用意した。
まず、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）した床敷きを敷いたケージ（イノケージ）にマウスを３匹／ケージまたは２匹／ケージで飼育した。ＨＥＰＡフィルターろ過空気の下で、オートクレーブした固形飼料とオートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）したＭｉｌｌｉ−Ｑ水に１００ｐｐｍａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを添加した飲料水を与え、週２回の床敷交換を行った。マウスの個体識別はｅａｒ−ｍａｒｋで行った。

２）ヒト前立腺がん皮下移植マウスモデルの作製
ヒト前立腺がん細胞ＰＣ３−ＧＦＰを、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で７５ｃｍ²Ｆｌａｓｋを使用して培養した。サブコンフルエントに達したＰＣ３−ＧＦＰを回収し、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、混合細胞懸濁液を調製した。
イソフルランで麻酔したマウスに対して、背部皮下に２９Ｇ針でこの混合細胞懸濁液を背部左側にＰＣ３−ＧＦＰが５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓとなるよう移植し、また、背部右側にＰＣ３−ＧＦＰが５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓとなるよう移植した。

２．癌の増殖抑制試験
１）試薬の調製
混合小豆抽出物を２０ｍｇ／ｍｌになるように飲料水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に溶解し、試薬とした。

２）試験方法
（１）上記１）にて調製した試薬１０ｍｌを飲料水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に添加し、１０匹のマウス（試験群）に毎日投与した。比較として試薬を添加せず、飲料水のみを１０匹のマウス（コントロール群）に投与した。
（２）各群のマウスについて、皮下移植日より次のｉ）〜ｉｉｉ）の項目についてモニタリングを行い、癌の増殖抑制に対する効果を調べた。
ｉ）一般状態
目視による観察を毎週５日間連続して行った。
ｉｉ）体重測定
各マウスの体重を毎週５日間連続して電子天秤で測定し、記録した。
ｉｉｉ）Ｉｎｖｉｖｏ蛍光イメージング
皮下移植実施日より試験終了まで、蛍光イメージャーＦｌｏｕｒＶｉｖｏ１００（ｉｎｄｅｃＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、週一回の頻度でＧＦＰ蛍光シグナルを撮影した。

３）結果
投与開始日の翌日を１日目として２８日経過後、ＧＦＰで蛍光化した癌の面積を測定した。その結果、図１１および図１２に示すように、コントロール群（図１１、Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）は癌細胞の移植後、ＧＦＰで検出される癌の面積が増加するのに対して、試験群（図１１、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）では癌の面積が減少しており、最終的に試験群のマウスではコントロール群のマウスに比べて３５．５％の癌の面積の減少が確認できた。また、図１３に示したように、がんの重量が５０％阻害された。これらのマウスの体重には優位な差は見られなかった（図１４）。
したがって、この結果より、小豆の水抽出物が癌の増殖抑制に有効であることが確認できた。

本発明により、小豆の水抽出物を有効成分として含む癌の転移抑制剤や増殖抑制剤を新たに提供することが可能となる。これらの剤は、例えば、前立腺癌の予防や、前立腺肥大の改善等に幅広く利用することができる。

Claims

小豆の水抽出物を有効成分として含む抗癌剤。
次のＡの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分として含む請求項１に記載の抗癌剤。
Ａ．小豆を常温水で抽出する工程
さらに、次のＢおよびＣの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む請求項２に記載の抗癌剤。
Ｂ．Ａの工程によって得られた小豆の常温水抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮する工程
Ｃ．Ｂの工程によって濃縮されたものをメタノールで溶出する工程
さらに、次のＤおよびＥの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む請求項３に記載の抗癌剤。
Ｄ．Ｃの工程によって溶出されたものをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着する工程
Ｅ．Ｄの工程によって吸着されたものを６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程
さらに、次のＦおよびＧの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む請求項４に記載の抗癌剤。
Ｆ．Ｅの工程によって溶出されたものをシリカゲルにオクタデシル基を化学結合した無極性の充填剤に吸着する工程
Ｇ．Ｆの工程によって吸着されたものを１０％以上のメタノールまたはアセトニトリルで溶出する工程
次のＨ〜Ｊの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分として含む請求項１に記載の抗癌剤。
Ｈ．小豆を熱水で抽出する工程
Ｉ．Ｈの工程によって得られた小豆の熱水抽出物をスチレン系多孔性合成吸着剤で吸着し、該吸着物を集めて濃縮する工程
Ｊ．Ｉの工程によって濃縮されたものをメタノールで溶出する工程
さらに、次のＫおよびＬの工程を含む方法によって得られる小豆の水抽出物を有効成分して含む請求項６に記載の抗癌剤。
Ｋ．Ｊの工程によって溶出されたものをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ法）の原理を利用した担体に吸着する工程
Ｌ．Ｋの工程によって吸着されたものを６０％以上のエタノールまたは６０％以上のアセトンで溶出する工程
癌が前立腺癌である請求項１〜７のいずれかに記載の抗癌剤。
小豆の水抽出物を有効成分として含む癌の転移抑制剤。
小豆の水抽出物を有効成分として含むＦＡＢＰ５遺伝子活性抑制剤。
小豆の水抽出物を有効成分として含む癌の増殖抑制剤。