CN114689766A - 一种枇杷清肺饮对照提取物及制备方法和质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枇杷清肺饮对照提取物及制备方法和质量控制方法,属于中药检测技术领域,通过控制枇杷清肺饮方剂的药材前处理、煎煮、浓缩、冷冻干燥等工艺参数,得到质量稳定的枇杷清肺饮对照提取物冻干粉,此冻干粉用于枇杷清肺饮质量研究,质量均一、稳定,检测结果可靠,且本发明中的特征图谱以及鉴别方法适用于枇杷清肺饮的各种剂型的定性检测,其中涉及的特征图谱构建方法,公开了一种原料易得的枇杷清肺饮对照提取物检测方法,检测方法简便可靠的方法,为枇杷清肺饮及其制剂的定性鉴别提供有力的保障。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域,具体涉及一种枇杷清肺饮对照提取物及制备方法和质量 控制方法。
背景技术
“肺主皮毛”体现了中医的整体观念。“肺主皮毛”理论出自于《黄帝内经》。中医认为 人是有机的整体,内外相应,痤疮发于皮毛,故从“肺主皮毛”的理论出发,本病的病位涉及肺,肺卫热盛,发于肌表,则为本病。故临床治疗本病应以肺卫热为立论基础,处方以清肺卫热为出发点。
“枇杷清肺饮”出自清代祁坤的《外科大成·肺风粉刺》,实为“枇杷清肺散”,其记载: “肺风由肺经血热郁滞不行而生酒刺也”。并拟枇杷清肺散治疗本病。此后,清代吴谦继承该 书的理论,且于《医宗金鉴·外科心法要诀》进一步阐述:“肺风粉刺,此证由肺经血热而成, 每发于面鼻,起碎疙瘩,形如黍屑,色赤肿痛,破出白粉汁,日久皆成白屑,形如黍米白屑, 宜内服枇杷清肺饮,外敷颠倒散,缓缓自收功也。”
枇杷清肺饮在《医宗金鉴·外科心法要诀》记载的煎法为:“取人参三分,枇杷叶二钱(刷 去毛,蜜炙),甘草三分(生),黄连一钱,桑白皮二钱(鲜者佳),黄柏一钱。水一盅半,煎 七分,食远服”。方中枇杷叶入肺胃二经,清泄肺热;桑白皮泄肺中瘀热,宣发肺气;黄连、黄柏清泄中下焦火热,将上焦肺热从下焦导出;人参、甘草补气以托毒外出。现代临床主要用于治疗痤疮。
按照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)、《古代经典 名方关键信息表(7首方剂)》(征求意见稿)中苓桂术甘汤剂量、制法等考证,通过考证的 结果可知枇杷清肺饮现代的煎法为:“取人参1.12g,枇杷叶7.46g,甘草(甘草)1.12g,黄 连(黄连)3.73g,桑白皮7.46g,黄柏3.73g。以水300毫升,煎至210毫升,食远服。”
中药作为整个中医药产业的支柱,为人类的健康和中医药的发展提供了物质基础,多种 中药组成的中医经典名方更是功不可没。从中医理论来讲,中药及其方剂可靠的疗效是多种 (类)成分共同作用的结果,每一种(类)成分发挥不同的作用。且方剂煎汤后成分种类、 含量的变化趋势如何,都需要从整体而不是单一成分进行把控。然而,多指标的质量评价模 式却受到中药化学对照品分离难度大,单体不稳定或供应价格高等因素的制约,并且应用大 量单体化学品进行质量评价时,操作过程较为复杂,检测方法也受到限制。
对照提取物是一类非单体成分对照物,系指经特定提取工艺制备的含有多种主要有效成 分或指标性成分,其指标性成分含量已采用相应的对照品进行标定,是可用于中药材(含饮 片)、提取物、中成药等鉴别或含量测定用的国家药品标准物质。与单体对照品相比,其制备 难度较小,可减少天然植物资源的消耗,降低制备和使用成本。与对照药材相比,可避免由 批间差异引起分析误差。目前在欧、美药典中使用广泛,主用于药材色谱峰定位,也应用于 提取物、挥发油、流浸膏等色谱峰定位。在我国,有关于对照提取物用于中药质量评价的相 关文献资料,且《中国药典》自2005年版至今也陆续收载了多个对照提取物品种,具有广 泛的应用前景。但未见经典名方汤剂对照提取物用于定性鉴别的报道,中国食品药品检定研 究院也没有经典名方汤剂的对照提取物,急需对其对照提取物及制备工艺进行研究。
随着中医药的发展,对照提取物也逐渐应用起来,其中文献大多为研究枇杷清肺饮临床 治疗痤疮的功效,但目前还没有枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱检验的报道,因此不能对 枇杷清肺饮的成分进行全面的评价,也不能体现中药复方制剂的整体性特征。
发明内容
为解决前述问题,本发明提供一种枇杷清肺饮对照提取物及制备方法和质量控制方法, 目的在于提供建立枇杷清肺饮对照提取物及制备工艺研究,对照提取物后期用于对枇杷清肺 饮特征图谱的研究做对照参照,作为一种定性的作用,有效的控制中药材的质量,为枇杷清 肺饮复方制剂的质量控制提供技术支持;同时提供一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱、 特征图谱构建方法,可以解决现有技术中不能对枇杷清肺饮的成分进行全面的评价,也不能 体现中药复方制剂的整体性特征的问题;还提出了一种枇杷清肺饮对照提取物的鉴别方法, 是基于本技术方案中得到的枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱的进一步使用,具有检测全面、 操作简便的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,包括以下步骤:
A、药材前处理:取药用人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位,取药用枇杷叶,除去绒毛,去泥沙、杂质、非药用部位;再润制至手握 法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,再将枇杷叶炮制得蜜炙枇杷叶,得人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏和蜜炙枇杷叶饮片;
B、煎煮:按枇杷清肺饮的配方称取步骤A中的各饮片,加5-8倍量水,浸泡20-40min, 煎煮20-30min,煎煮2-3次,合并药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干 燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色 西林瓶,并封口,得枇杷清肺饮对照提取物冻干粉。
进一步地,所述步骤D中,升华干燥的条件是:
温度-40℃,维持1h;
温度-30℃,维持1h;
温度-20℃,维持2h;
温度-10℃,维持3h;
温度0℃,维持3h。
进一步地,所述步骤D中,解析干燥的条件是:
温度10℃,维持3h,压力0.0pa;
温度20℃,维持2h,压力0.0pa;
温度30℃,维持2h,压力0.0pa;
温度45℃,维持22h,压力0.0pa。
进一步地,所述步骤A中,干燥的条件是:所述黄连晾干或在干燥温度50℃的条件下, 干燥至符合水分要求;所述人参、枇杷叶、甘草、桑白皮、黄柏,干燥温度75±5℃,干燥至符合水分要求。
进一步地,所述步骤A中,所述蜜炙枇杷叶的方法为:按每100kg枇杷叶丝,用炼蜜20kg 准备枇杷叶丝和炼蜜,先将炼蜜加适量沸水稀释后,加入枇杷叶丝中拌匀,闷透,置炒制容 器内,用文火炒至不粘手时,取出,放凉。
进一步地,所述步骤B中,按枇杷清肺饮的配方称取步骤A中的各饮片,一煎,加入7倍量水,浸泡30min,煎煮30min;二煎加入7倍量水,煎煮20min,合并药液,过滤,收集 滤液。
进一步地,所述步骤B中,过滤的条件是采用200目过滤的过滤器进行过滤,再收集滤 液。
进一步地,所述枇杷清肺饮的配方为,按质量份数计:人参1.12份,枇杷叶7.46份,甘 草1.12份,黄连3.73份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份。
一种枇杷清肺饮对照提取物,根据前述方法所得到的枇杷清肺饮对照提取物的冻干粉, 其水分为4.6%-7.4%,黄棕色至黄褐色粉末,性味为:气微,味微苦、涩。
一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取前述枇杷清肺饮对照提取物制备方法所得到的枇杷清肺饮对照 提取物冻干粉,加溶剂,制备枇杷清肺饮对照提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对 照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建枇杷清肺饮 对照提取物的特征图谱。
进一步地,所述步骤a中,对照品溶液的制备方法包括:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照 品,分别加70%甲醇制成每1mL含50μg的混合对照品溶液。
进一步地,所述步骤b中,供试品溶液的制备方法包括:取枇杷清肺饮对照提取物冻干 粉0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50mL,密塞,称定重量,超声处理,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得枇杷清肺 饮对照提取物的供试品溶。
进一步地,在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:210nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。
进一步地,所述梯度洗脱过程为:
0~52min,流动相A为5~40%,流动相B为95~60%,
52~100min,流动相A为40~95%,流动相B为60~5%。
进一步地,枇杷清肺饮对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计,取饮片:人参1.12份,枇杷叶7.46份,甘草1.12份,黄连3.73 份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加7倍量水,浸泡30min,煎煮30min; 第二次加5倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,每次1小时,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
进一步地,在步骤b1中,所述冷冻干燥工艺包括预冻、升华干燥、解析干燥。
一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱,所述枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方 法得到的特征图谱包含11个特征峰,11个特征峰中包括:桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、 甘草苷、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的特征峰。
一种枇杷清肺饮提取物的鉴别方法,包括以下步骤:
a2.称取待鉴定的枇杷清肺饮提取物冻干粉适量,制得枇杷清肺饮对照提取物的供试品溶 液;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定 的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的待鉴定的特征色谱与前述方法构建得到的对应的特征图谱进行比 对,若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致,则鉴别为质量合格。
本技术方案的有益效果如下:
(1)、本发明中,以传统中药经典名方-枇杷清肺饮为基准,在传统煎药方法的基础上, 对提取溶媒、煎煮次数、煎煮时间、加水量进行考察后,制备出相应的枇杷清肺饮对照提取 物,并对其进行了特征图谱研究,可用于相应汤剂的定性鉴别。
(2)、本发明中,该对照提取物的制备具有重要意义:首先为中国食品药品检定研究 院申报对照提取物和复方制剂的质量控制提供技术支持,具有较强的创造性;其次在响应了 中药多指标整体质量控制的号召的同时,避免了前处理、处方、提取、成分指认等工序的重 复发生,使实验操作更为简便,并减少了资源的消耗。可为中药经典名方汤剂的质量控制提 供保障,为其国际推广奠定一定的基础。
(3)、本发明中,枇杷清肺饮对照提取物,以整体对照物质为对照进行质量控制,实现 了真正意义上的整体质量控制,使可检测的范围和数量无限大,几乎不增加检测成本,检测 方法的重复性显著提高。
(4)、本发明中,枇杷清肺饮对照提取物代表了制剂的整体内在质量,可以为后续经典 名方枇杷清肺饮的相关制剂提供参考依据。
(5)、枇杷清肺饮作为临床上常用的经典处方,是后世医家在辨证论治的基础,本发明 中,公开了一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱、特征图谱构建方法,采用高效液相色谱 法构建了枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱,并通过此特征图谱,可实现有关枇杷清肺饮及 其以枇杷清肺饮为基础方的复方制剂的快速鉴别,方法简单。本发明一方面弥补传统方剂- 枇杷清肺饮及其制剂质量控制中特征图谱的研究空白,为经典名方枇杷清肺饮的质量提升提 供有力保障;另一方面也为枇杷清肺饮的研究开发提供有效的研究基础。
(6)、本发明中,所采用的色谱柱能对枇杷清肺饮中的生物碱类、苷类同时进行分析, 所得指纹图谱信息量较大,能够快速、准确的鉴别样品质量优劣,有效控制枇杷清肺饮中饮 片的质量,保证枇杷清肺饮质量稳定性。本方法确定了11个共有特征峰,其中指认了桑皮苷 A、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、新绿原酸、盐酸巴马汀、木兰花碱、甘草苷、表小檗碱等8 个特征峰,为枇杷清肺饮及其制剂的定性鉴别提供有力的保障。
(7)、本发明中,以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定,具有操作简单、分离度好、 精密度高、重复性好以及稳定性好等优点。
(8)、本发明中,采用本技术方案中的参数,得到的图谱基线平稳、分离度好、峰形较 好、出峰较多、首次提供了对枇杷清肺饮处方药味的全面控制的特征图谱方法。
(9)、本发明中,利用得到的特征图谱,建立枇杷清肺饮对照提取物特征图谱检测方法, 对枇杷清肺饮中的有效成分进行科学的鉴别和整体表征,具有检测全面、操作简便的特点。
附图说明
图1为实施例4中的枇杷清肺饮的吸水率曲线。
图2为实施例9中枇杷清肺饮的对照特征图谱。
图3是实施例10中10批枇杷清肺饮对照提取物特征图谱。
图4为是实施例12中枇杷清肺饮对照提取物的对照特征图谱(其中:峰3:新绿原酸; 峰4(S1):桑皮苷A;峰5:盐酸黄柏碱;峰6:木兰花碱;峰7:甘草苷;峰8:表小檗碱; 峰9:盐酸巴马汀;峰10(S2):盐酸小檗碱)。
图5是实施例13中方案一的枇杷清肺饮对照提取物色谱条件考察图。
图6是实施例13中方案二的枇杷清肺饮对照提取物色谱条件考察图。
图7是实施例13中方案三的枇杷清肺饮对照提取物色谱条件考察图。
图8是实施例15中专属性考察的特征图谱。
图9是枇杷清肺饮对照提取物特征图谱。
图10是实施例22中10批枇杷清肺饮对照提取物特征图谱。
图11是实施例22中枇杷清肺饮对照提取物的合成特征图谱。
图12是实施例23中得到的枇杷清肺饮颗粒的图谱。
具体实施方式
本发明提供一种枇杷清肺饮对照提取物及其制备方法,为使本发明的目的、技术方案及 效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处描述的具体实施例仅 用以理解本发明,并不用于限定本发明。
实施例中所涉及的实验仪器及材料如下:
电子天平:上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平,ME204E/02、MS205DU、XP26 (梅特勒-托利多仪器有限公司);
煎药壶:美味世家全自动分体式陶瓷煎药壶4升;
筛网:九峰筛网200目;
真空冷冻干燥机:北京松源华兴科技发展有限公司LGJ-100F;
西林瓶压盖机:SZ20A;
2000mL不锈钢量杯若干;西林瓶:10mL,30mL,50mL若干;
高效液相色谱仪:Waters 2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱 仪、岛津20-AD型高效液相色谱仪;
超声波清洗器:KQ5200DB型(600W,40KHz;昆山市超声仪器有限公司);
电子天平:上海方瑞仪器有限公司JY系列百分之一天平、ME204E/02、MS205DU、
XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司);
超纯水机:细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司);
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、
Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm,Agilent 5TC C18 250×4.6mm、Kromasil
C18 5μm 4.6×250mm、YMC-Triart C18 4.6×250mm。
试剂:乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯;
试药:桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品;
人参、枇杷叶、甘草、黄连、桑白皮、黄柏(四川新绿色药业科技发展有限公司提供);
枇杷清肺饮对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200901、 PPQFY200902、PPQFY200903、PPQFY200904、PPQFY200905、PPQFY200906、PPQFY200907、 PPQFY200908、PPQFY200909、PPQFY200910);
盐酸巴马汀(中国食品药品检定研究院,批号:110732-201812,含量以97.6%计)
新绿原酸(北京世纪奥科生物技术有限公司,批号:190124-015,含量以98%计);
桑皮苷A(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq18011503,含量以98%计);
甘草苷(中国食品药品检定研究院,批号:111610-201106,含量以93.7%计);
盐酸黄柏碱(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq1912810,含量以98%计);
盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院,批号:110713-201613,含量以86.8%计);
表小檗碱(Stanford Analytical Chemicals Inc批号:EBR-866042)
木兰花碱(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:17063003,含量以98%计)
缺阴性样品信息:缺人参对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号: PPQFY200911);
缺蜜枇杷叶对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200912);
缺甘草对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200913);
缺黄连对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200914);
缺桑白皮对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200915);
缺黄柏对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200916);
枇杷清肺饮对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备,批号:PPQFY200901、 PPQFY200902、PPQFY200903、PPQFY200904、PPQFY200905、PPQFY200906、PPQFY200907、 PPQFY200908、PPQFY200909、PPQFY200910)。
实施例1
本实施例涉及枇杷清肺饮对照提取物的具体制备方法,包括以下步骤:
A、药材前处理:取药用人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位,取药用枇杷叶,除去绒毛,去泥沙、杂质、非药用部位;再润制至手握 法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,再将枇杷叶炮制得蜜炙枇杷叶,得人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏和蜜炙枇杷叶饮片;
B、煎煮:按枇杷清肺饮的配方称取步骤A中的各饮片,加7倍量水,浸泡30min,一煎煎煮30min,二煎微沸20min,合并两次的药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干 燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色 西林瓶,并封口,得枇杷清肺饮对照提取物冻干粉。
实施例2
本实施例是在实施例1上的进一步优化,所述步骤A中,取药用人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏和枇杷叶后,具体的前处理方法为:
人参:洗净,润透,切1-2mm薄片,干燥;甘草:除去杂质,洗净,润透,切2-4mm 厚片,干燥;黄连:除去杂质,润透后切1-2mm薄片,晾干;桑白皮:洗净,稍润,切5-10mm 宽丝,干燥;黄柏:除去杂质,喷淋清水,润透,切5-10mm宽丝,干燥;枇杷叶:除去绒 毛,用水喷润,切5-10mm宽丝,干燥。应先将炼蜜加适量沸水稀释后,加入待炮炙品中拌 匀,闷透,置炒制容器内,用文火炒至不粘手时,取出,放凉。(每100kg枇杷叶丝,用炼 蜜20kg。)
再将上述合格饮片,送入煎药壶中,进行下一步煎煮步骤。
实施例3
本实施例是对枇杷清肺饮对照提取物性状的考察。
枇杷清肺饮对照提取物经工艺制备得到一种固体粉末。10批次枇杷清肺饮对照提取物性 状、水分分别见表1和表2。
表1:10批次枇杷清肺饮对照提取物性状
表2:10批次枇杷清肺饮对照提取物的水分检查
从多批次的枇杷清肺饮对照提取物的检测结果看,枇杷清肺饮对照提取物为黄棕色至黄 褐色粉末;气微,味微苦、涩;枇杷清肺饮对照提取物水分在4.6%-7.4%范围之内,平均值 为6.0%。
实施例4
在中药制药技术领域中,不同饮片吸水率有差异,因此需考察枇杷清肺饮的吸水率,进 而为加水量做参考。本实施例主要考察枇杷清肺饮对照提取物制备时,吸水率的变化情况。
称取处方量的饮片100g(按人参1.12份,蜜制枇杷叶7.46份,甘草1.12份,黄连3.73 份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份的比例计),两份,分别加入7倍量(水体积:处方量饮片的重量)的水,分别在浸泡10min,20min,30min,50min,1h,1.5h,2h,4h,6h,8h,16h, 24h测定,计算吸水率,结果见表3,吸水率曲线见图1。
表3:枇杷清肺饮吸水率数据
从表3与图1可知,枇杷清肺饮饮片其在前1.5h急剧吸水,2h后逐渐减小,12h吸水接 近饱和,平均吸水率为242.9%。吸水率约为2.5倍。
再参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(征求意见稿)的“加水量”部 分的意见:由于中药饮片的质地和吸水率相差较大,应根据不同的饮片确定加水量。加水量 一般以浸过药面2~5厘米为宜,花、草类饮片或煎煮时间较长的饮片可酌量加水,再结合之 前的试验,确定枇杷清肺饮制备步骤中首次加水量为饮片的7倍量,二煎加水量为5倍量。
实施例5
在实施例4的基础上,对枇杷清肺饮的加水量及提取次数进行考察,参考其吸水率,可 将一煎加水倍数调整为8倍,二煎加水量定为5倍,提取2次;或将一煎加水倍数调整为7 倍,二煎加水量定为6倍,提取2次,发现每次加水量控制在5-8倍量水最终的结果差距不 大,但是加水量调整至8倍时,后面的浓缩工艺时长明显增长,所以定为,一煎加水倍数调 整为7倍,二煎加水量定为5倍,提取2次,效率较高。
实施例6
本实施例是对枇杷清肺饮对照提取物制备工艺中,浸泡时间的考察。
取枇杷清肺饮处方量的饮片100g,两份,均加7倍水,每隔10min观察饮片的浸泡情况, 直至饮片泡至内芯湿润。
结果表明:取枇杷清肺饮处方量的饮片,加7倍水,每隔10min观察饮片的浸泡情况, 直至饮片泡至内芯湿润。浸泡至10min时,大部分饮片未浸泡透;浸泡至20min时大部分内 芯湿润,少量较长饮片内芯未湿润;浸泡至30min时所有饮片内芯湿润,确定浸泡时间为30min。
实施例7
本实施例是对枇杷清肺饮对照提取物制备工艺中冷冻工艺的考察。
根据《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)中要求, 对其中提取物干燥过程推荐采用冷冻干燥方法制备为宜,可保证其质量的稳定、易于保存。 对冷冻干燥工艺参数考察,列举了两种冻干工艺的控制条件,见表4-1、4-2所示。
表4-1:枇杷清肺饮对照提取物冻干工艺(一)
表4-2:枇杷清肺饮对照提取物冻干工艺(二)
通过上述冻干工艺,配合上述表中的控制参数,得到的两种冻干粉。两种冻干粉通过检 测发现,表4-1工艺参数得到的冻干粉更疏松、干燥,更利于存放。所以最后选择表4-1的 控制参数对应的工艺条件。
再将经上述工艺后得到的冻干粉,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下,快速收粉、 称重、分装于棕色西林瓶,并封口、贴标签。
实施例8
本实施例是对枇杷清肺饮对照提取物煎煮验证,根据前述实施中,对枇杷清肺饮对照提 取物制备工艺的考察,最后确定的较优工艺为:取枇杷清肺饮处方量的饮片,加水煎煮两次, 一煎加7倍水,浸泡30分钟,煮沸,保持微沸煎煮30分钟,200目筛网过滤,立即冷却至 室温;二煎加5倍水,煮沸,保持微沸煎煮20分钟,200目筛网过滤,立即冷却至室温;合并水煎液,冷冻干燥,分装,即得。
采用本制备工艺,进行了10批枇杷清肺饮对照提取物煎煮,结果见表5。
表5:10批枇杷清肺饮对照提取物数据汇总
由表5可得,10批枇杷清肺饮对照提取物收粉率,平均值为20.79%。SD为0.94。平均 值的70%-130%的范围为14.55%-27.03%。平均值加减3倍SD范围为17.97%-23.61%。本数 据在正常范围内,可作为生产工艺的参考。
实施例9
本实施例是将本技术方案中得到的枇杷清肺饮对照提取物的冻干粉用于枇杷清肺饮对照 提取物的一种特征图谱构建方法,再将得到的图谱用于枇杷清肺饮复方制剂定性检测。
a.对照品溶液的制备:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品分别加70%甲醇制成每1mL含50μg 对照品的混合溶液,即得。
b.供试品溶液的制备:取本品粉末0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲 醇50mL,密塞,称定重量,超声处理(功率300W,频率25kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
c.检测:将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测, 以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建枇杷清 肺饮对照提取物的特征图谱。
所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm);
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:210nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。
所述梯度洗脱过程为:
0~52min,流动相A为5~40%,流动相B为95~60%,
52~100min,流动相A为40~95%,流动相B为60~5%,
d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有 峰,构建枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱。
供试品特征图谱中应呈现11个特征峰,其中峰4、峰10应分别与桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品参照物峰保留时间相对应。与桑皮苷A参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰1~峰7与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.371(峰 1)、0.555(峰2)、0.812(峰3)、1.224(峰5)、1.351(峰6)、1.711(峰7)。与盐酸 小檗碱参照物峰相应的峰作为S2峰,计算峰9~峰11与S2峰的相对保留时间,其相对保留 时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.854(峰8)、0.976(峰9)、1.587(峰11)。 如图2所示。其中,峰3:新绿原酸;峰4(S1):桑皮苷A;峰5:盐酸黄柏碱;峰6:木 兰花碱;峰7:甘草苷;峰8:表小檗碱;峰9:盐酸巴马汀;峰10(S2):盐酸小檗碱。
实施例10
枇杷清肺饮对照提取物特征图谱验证
根据上述枇杷清肺饮对照提取物特征图谱检测方法对10批(PPQFY200901、PPQFY200902、PPQFY200903、PPQFY200904、PPQFY200905、PPQFY200906、PPQFY200907、PPQFY200908、PPQFY200909、PPQFY200910)清肺饮对照提取物进行特征图谱验证,结果 见图3所示。
采用特征图谱,可以从整体上对对照提取物进行质量控制,以保证质量均一性和稳定性; 结果表明10批枇杷清肺饮对照提取物的质量均一、稳定。
实施例11
一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,涉及中成药生产技术领域,包括以下 步骤:
a.对照品溶液的制备:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取枇杷清肺饮对照提取物冻干粉,加溶剂,制备枇杷清肺饮对照 提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对 照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建枇杷清肺饮 对照提取物的特征图谱。
实施例12
本实施例是实施例11基础上的更具体的制备方法,一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图 谱构建方法,涉及中成药生产技术领域,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品分别加70%甲醇制成每1mL含50μg 的混合溶液,即得;
b.供试品溶液的制备:取枇杷清肺饮对照提取物冻干粉约0.1g,精密称定,置具塞锥形 瓶中,精密加入70%甲醇50mL,密塞,称定重量,超声处理(功率300W,频率25kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
c.测定:将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪中 进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰, 构建枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱。
进一步地,在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;进样量: 10μL;检测波长:210nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于3000。
所述梯度洗脱过程为:
0~52min,流动相A为5~40%,流动相B为95~60%,
52~100min,流动相A为40~95%,流动相B为60~5%。
d.以步骤c中对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有 峰,构建枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱。构建的枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱共有 11个特征峰,其中峰4、峰10应分别与桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品参照物峰保留时间相对 应。与桑皮苷A参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰1~峰7与S1峰的相对保留时间,其 相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.371(峰1)、0.555(峰2)、0.812(峰 3)、1.224(峰5)、1.351(峰6)、1.711(峰7)。与盐酸小檗碱参照物峰相应的峰作为S2峰, 计算峰9~峰11与S2峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规 定值为0.854(峰8)、0.976(峰9)、1.587(峰11),如图4所示。
本实施例中,枇杷清肺饮对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计:人参1.12份,枇杷叶7.46份,甘草1.12份,黄连3.73份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份,取饮片100g;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加7倍量水,浸泡30min,煎煮30min; 第二次加5倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
实施例13
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对色谱条件与系统适 用性试验-梯度洗脱条件的考察。
结合传统的枇杷清肺饮的高效液相色谱检测条件,以及枇杷清肺饮中有效成分的特性, 设计有三种色谱条件。方案一:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为 4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表6中的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;流速为每分钟1.0mL;检测波长:210nm。见图5。
表6:
在该色谱条件下,从图5中可看出,出峰时间早,色谱峰分离度与对称性较差,故根据 现有梯度,对色谱条件再进行考察。
方案二:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm), 以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表7中的规定进行梯度洗脱;柱温 为30℃;流速为每分钟1.0mL;检测波长:210nm。见图6。
表7:
在该色谱条件下,从图6中可看出,该色谱条件峰分离度、对称因子有所改善,还需继 续梯度的优化。
方案三:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm), 以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按下表8中的规定进行梯度洗脱;柱温 为30℃;流速为每分钟1.0mL;检测波长:210nm。见图7。
表8:
在该色谱条件下,从图7中可看出,色谱峰理论板数、分离度、对称性均更好,故选择 该色谱条件对枇杷清肺饮对照提取物进行后续研究。
实施例14
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对色谱条件-波长的 考察。
根据实施例12、13拟定的实验条件基础上,利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全 波长扫描,并在不同波长下获取数据,经比较,210nm波长下色谱图最好,故检测波长定为 210nm。
实施例15
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-专属性的 考察。
供试品溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备枇杷清肺饮对照提取物供试品溶液。
对照品参照物溶液的制备:取新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、甘草苷、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱分别加70%甲醇制成每1mL含50μg的混合溶液,即得。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺枇杷清肺饮对照提取物阴性对照 溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺人参对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺蜜枇杷叶对照提取物阴性对照溶 液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺甘草对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺黄连对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺桑白皮对照提取物阴性对照溶液。
阴性对照溶液的制备:按以上拟定的实验条件,制备缺黄柏对照提取物阴性对照溶液。
对枇杷清肺饮对照提取物特征图谱峰进行定位。见图8、图9。图8中,A为缺枇杷清肺 饮对照提取物阴性对照;B为枇杷清肺饮对照提取物;C为缺人参阴性对照;D为缺蜜枇杷叶阴性对照;E为缺甘草阴性对照;F为缺黄连阴性对照;G为缺桑白皮阴性对照;H为缺黄 柏阴性对照;I为对照品混标。
结果表明,阴性对照溶液对待测峰的测定无干扰,表明该方法专属性好。
图9中,峰3:新绿原酸;峰4(S1):桑皮苷A;峰5:盐酸黄柏碱;峰6:木兰花碱; 峰7:甘草苷;峰8:表小檗碱;峰9:盐酸巴马汀;峰10(S2):盐酸小檗碱。
实施例16
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-精密度的 考察。
取枇杷清肺饮对照提取物(批号PPQFY200901)供试品溶液,按拟定实验方法连续进样 6次,每次10μL,计算保留时间及峰面积。表9、表10-1、10-2。
表9:精密度考察—特征峰保留时间
表10-1:精密度考察—特征峰峰面积
表10-2:精密度考察—特征峰峰面积(续)
结果表明,该仪器精密度良好。
实施例17
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-重复性的 考察。
精密称取枇杷清肺饮对照提取物(批号PPQFY200901)6份,按拟定实验方法进行制备 及测定。见表11、表12。
表11:重复性考察—特征峰相对保留时间比值
表12:重复性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明,该方法重复性良好。
实施例18
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-中间精密 度-不同制备人员和不同制备时间考察。
在以上拟定的实验条件基础上,分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下精密称取枇杷清肺饮对照提取物(批号PPQFY200901)各两份,制备供试品,进行测定。见 表13、表14。
表13:不同人员和时间考察—特征峰相对保留时间
表14:不同人员和时间考察—特征峰相对峰面积
结果表明,由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定,方法稳定性较好。
实施例19
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-中间精密 度-不同仪器考察。
在以上拟定的实验条件基础上,分别精密称取枇杷清肺饮对照提取物(批号PPQFY200901)一份,制备供试品溶液,分别在岛津LC-20AD型高效液相色谱仪、安捷伦 1260型高效液相色谱仪、Waters 2695-2996型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为 YMC-Triart C18 250×4.6mm)。见表15、表16。
表15:不同仪器考察—特征峰相对保留时间
表16:不同仪器考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明,不同仪器条件下,各特征峰相对保留时间的RSD在0.02%~0.24%;各特征 峰相对峰面积的RSD在0.40%~13.65%。
实施例20
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-耐用性-色 谱柱耐用性考察。
在以上拟定的实验条件基础上,分别对色谱柱为Agilent TC C18 250×4.6mm、YMC-Triart 5um C18 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 5μm 250×4.6mm时进行考察。见表17、表18。
表17:色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
表18:色谱柱耐用性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明,用上述3种色谱柱对样品进行检测,特征峰相对保留时间的RSD在0.06%~ 0.84%,特征峰相对峰面积的RSD在1.36%~11.33%。结果表明该方法的耐用性良好。
实施例21
本实施例是对实施例12中枇杷清肺饮对照提取物特征图谱构建中,对方法学-稳定性考 察。
在以上拟定的实验条件基础上,取同一供试品溶液,分别于0h,4h、8h,12h,18h,24h 时测定。见表19、表20-1、表20-2。
表19:24小时稳定性考察—特征峰保留时间
表20-1:24小时稳定性考察—特征峰峰面积比值
表20-2:24小时稳定性考察—特征峰峰面积比值(续)
结果表明,其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.01%~0.33%,样品溶液在24小时内 较稳定。
综上所述,各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求,该方法良好。 将上述11个特征峰纳入后续考察。
实施例22
本实施例是在实施例12-21的基础上,特征峰的进一步确定及对照图谱的建立。
采用拟定的方法对本品10批样品进行特征图谱的测定,计算相对保留时间、相对峰面积。 见图10,表21、表22。
表21:10批枇杷清肺饮对照提取物相对保留时间
表22:10批枇杷清肺饮对照提取物相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出原则,共选择了11个重复性较好的峰作 为特征峰。
供试品特征图谱中应呈现11个特征峰,其中峰4、峰10应分别与桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品参照物峰保留时间相对应。与桑皮苷A参照物峰相应的峰作为S1峰,计算峰1~峰7与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.371(峰 1)、0.555(峰2)、0.812(峰3)、1.224(峰5)、1.351(峰6)、1.711(峰7)。与盐酸 小檗碱参照物峰相应的峰作为S2峰,计算峰9~峰11与S2峰的相对保留时间,其相对保留 时间应在规定值的±8%范围之内。规定值为0.854(峰8)、0.976(峰9)、1.587(峰11)。 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对10批枇杷清肺饮对照提取物进行合成, 建立了枇杷清肺饮对照提取物特征图谱的对照图谱。见图11。图11中,峰3:新绿原酸;峰4(S1):桑皮苷A;峰5:盐酸黄柏碱;峰6:木兰花碱;峰7:甘草苷;峰8:表小檗碱; 峰9:盐酸巴马汀;峰10(S2):盐酸小檗碱。得到的图示8与实施例2中的得到的图示1, 一致,证明图谱的建立方法可行。
实施例23
本实施例是在实施例12得到枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱的基础上,用于鉴别枇杷 清肺饮提取物的具体检测方法,包括以下步骤:
a2.称取适量本公司自行研发的枇杷清肺饮颗粒,批号为2011001,2011002,2011003各 1份,分别制得枇杷清肺饮颗粒的供试品溶液,待鉴定;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定 的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批 枇杷清肺饮对照提取物进行合成,得到该枇杷清肺饮颗粒的图谱,见附图12,将图12与图4 进行比对,可以得出枇杷清肺饮颗粒的图谱的相对保留时间在此范围,即该待检测品的处方 中,该项检测合格。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本 发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之 内。
Claims (18)
1.一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、药材前处理:取药用人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏,净选至饮片检查无泥沙、杂质、非药用部位,取药用枇杷叶,除去绒毛,去泥沙、杂质、非药用部位;再润制至手握法检查润至透心;再切制,至饮片长度检查,异形片不得超过10%;再干燥至符合水分要求,再将枇杷叶炮制得蜜炙枇杷叶,得人参、甘草、黄连、桑白皮、黄柏和蜜炙枇杷叶饮片;
B、煎煮:按枇杷清肺饮的配方称取步骤A中的各饮片,加5-8倍量水,浸泡20-40min,煎煮20-30min,煎煮2-3次,合并药液,过滤,收集滤液;
C、浓缩:将步骤B中的滤液在温度50±2℃、负压0.080Mpa的真空度下,浓缩至相对密度为1.02-1.06,得浓缩液;
D、冷冻干燥:将步骤C中的浓缩液,先在常压下预冻,再在压力为0.0pa条件下升华干燥,再进行解析干燥后,在温度10-26℃、相对湿度40-60%环境下收粉、称重、分装于棕色西林瓶,并封口,得枇杷清肺饮对照提取物冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤D中,升华干燥的条件是:
温度-40℃,维持1h;
温度-30℃,维持1h;
温度-20℃,维持2h;
温度-10℃,维持3h;
温度0℃,维持3h。
3.根据权利要求2所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤D中,解析干燥的条件是:
温度10℃,维持3h,压力0.0pa;
温度20℃,维持2h,压力0.0pa;
温度30℃,维持2h,压力0.0pa;
温度45℃,维持22h,压力0.0pa。
4.根据权利要求3所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤A中,干燥的条件是:所述黄连晾干或在干燥温度50℃的条件下,干燥至符合水分要求;所述人参、枇杷叶、甘草、桑白皮、黄柏,干燥温度75±5℃,干燥至符合水分要求。
5.根据权利要求4所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤A中,所述蜜炙枇杷叶的方法为:按每100kg枇杷叶丝,用炼蜜20kg准备枇杷叶丝和炼蜜,先将炼蜜加适量沸水稀释后,加入枇杷叶丝中拌匀,闷透,置炒制容器内,用文火炒至不粘手时,取出,放凉。
6.根据权利要求5所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤B中,按枇杷清肺饮的配方称取步骤A中的各饮片,一煎,加入7倍量水,浸泡30min,煎煮30min;二煎加入7倍量水,煎煮20min,合并药液,过滤,收集滤液。
7.根据权利要求6所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述步骤B中,过滤的条件是采用200目过滤的过滤器进行过滤,再收集滤液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的制备方法,其特征在于,所述枇杷清肺饮的配方为,按质量份数计:人参1.12份,枇杷叶7.46份,甘草1.12份,黄连3.73份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份。
9.一种枇杷清肺饮对照提取物,其特征在于:所述权利要求1-7任一项所得到的枇杷清肺饮对照提取物的冻干粉水分为4.6%-7.4%,黄棕色至黄褐色粉末,气微,味微苦、涩。
10.一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.对照品溶液的制备:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品,加溶剂溶解,得对照品溶液;
b.供试品溶液的制备:取权利要求1所述的枇杷清肺饮对照提取物冻干粉,加溶剂,制备枇杷清肺饮对照提取物的供试品溶液;
c.将步骤a、b中得到的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测,以对照品溶液的特征图谱为参照图谱,从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰,构建枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱。
11.根据权利要求10所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤a中,对照品溶液的制备方法包括:取桑皮苷A、盐酸小檗碱对照品,分别加70%甲醇制成每1mL含50μg的混合对照品溶液。
12.根据权利要求10所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述步骤b中,供试品溶液的制备方法包括:取枇杷清肺饮对照提取物冻干粉0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50mL,密塞,称定重量,超声处理,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,得枇杷清肺饮对照提取物的供试品溶。
13.根据权利要求11或12所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,在步骤c中,所述高效液相色谱检测条件满足:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
进样量:10μL;
检测波长:210nm;
流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸水溶液,梯度脱洗。
14.根据权利要求13所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,所述梯度洗脱过程为:
0~52min,流动相A为5~40%,流动相B为95~60%,
52~100min,流动相A为40~95%,流动相B为60~5%。
15.根据权利要求14所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,枇杷清肺饮对照提取物冻干粉的制备步骤包括:
a1:按原料重量份数计,取饮片:人参1.12份,枇杷叶7.46份,甘草1.12份,黄连3.73份,桑白皮7.46份,黄柏3.73份;
b1:将a1步骤中的全部饮片,放在煎煮容器中,一煎加7倍量水,浸泡30min,煎煮30min;第二次加5倍量水,煎煮30min,共煎煮2次,每次1小时,过滤,合并滤液,冷冻干燥成冻干粉。
16.根据权利要求15所述的一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法,其特征在于,在步骤b1中,所述冷冻干燥工艺包括预冻、升华干燥、解析干燥。
17.一种枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱,其特征在于:根据权利要求10中枇杷清肺饮对照提取物的特征图谱构建方法得到的特征图谱包含11个特征峰,11个特征峰中包括:桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、甘草苷、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的特征峰。
18.一种枇杷清肺饮提取物的鉴别方法,其特征在于,包括以下步骤:
a2.称取待鉴定的枇杷清肺饮提取物冻干粉适量,制得枇杷清肺饮提取物的供试品溶液;
b2.将步骤a2中制得的供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪检测,即得对应的待鉴定的特征色谱;
c2.将步骤b2中得到的待鉴定的特征色谱与权利要求10所述方法构建得到的对应的特征图谱进行比对,若待鉴定的特征色谱与之对应的构建得到的特征色谱一致,则鉴别为质量合格。
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