CN110954636A

CN110954636A - 一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN110954636A
Application number: CN201911386084.6A
Authority: CN
Inventors: 曾选民; 徐霞; 廖雨岚
Original assignee: Hunan Jiudian Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiudian Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110954636B

Abstract

本申请公开了一种防已黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法，此方法使用了独特的色谱条件并成功检测了防己黄芪汤干膏的指纹图谱。本申请使用了液相色谱法检测，且峰形较好，与相邻色谱峰分离度高，重现性好。

Description

一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明属于黄芪汤干膏的分析领域，具体涉及一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法。

背景技术

防己黄芪汤干膏全方由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成，具有益气祛风，健脾利水之功，主治汗出恶风、小便不利、身重、苔白、舌淡、脉浮等症状。防己黄芪汤出自汉代张仲景所著的《金匮要略》，原文记载“风湿，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之；风水，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之”，为固表益气、祛风利湿的经典良方。全方由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成，配方体现“治水必治气，气行则水行”的思想，方中防己和黄芪共为君药，防己祛风行水，黄芪益气固表，兼可行水，臣以白术健脾补气祛湿，既助防己祛湿行水，又增黄芪益气固表之功。甘草、生姜、大枣调和诸药，共为佐使之用，助力黄芪益气固表之效。该方虽已逾千年，单由于其组方严谨、配伍精良、功效卓越等特点，应用甚为广泛。

防己黄芪汤干膏由六味药材组成，其所含化学成分相对复杂，而且多方面干扰因素众多，因此研究难度颇大，且生产上难以做到精确稳定可控。而目前中药复方领域在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在难以全面反映药味多，组分多的防己黄芪汤干膏质量状况的缺陷。。

中国专利CN201710354013.2公开了一种黄芪建中丸的化学成分指纹图谱的构建方法，步骤包括：1)取毛蕊异黄酮、芒柄花素和芍药苷各适量，制备得到对照品甲醇溶液；2)取黄芪建中丸制备成供试品甲醇溶液；3)取对照品及供试品甲醇溶液各10μl，注入超高效液相色谱仪，在超高效液相(UPLC)色谱条件下进行梯度洗脱，得到指纹图谱；液相色谱仪操作条件为：流动相由乙腈和0.1％的甲酸水溶液组成，流动相流速为0.3ml/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。构建的指纹图谱能够清晰地反映黄芪建中丸各有效成分的特征峰出峰位置，可用于黄芪建中丸的质量控制。

中国专利CN201811621837.2公开了一种芪龙胶囊指纹图谱结合液质联用的检测方法及其应用。本申请提出了一种芪龙胶囊的指纹图谱建立方法，及通过指纹图谱及黄芪甲苷的检测对芪龙胶囊进行质量控制的方法。本申请中通过高效液相建立指纹图谱，通过高效液相分离，得到15个共有峰，可从整体上反应芪龙胶囊的质量状况。该构建方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大，避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价芪龙胶囊的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。

防己黄芪汤干膏由六味药材组成，其所含化学成分相对复杂，而且多方面干扰因素众多，因此研究难度颇大，且生产上难以做到精确稳定可控。而目前中药复方领域在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在着难以全面反映药味多，组分多的防己黄芪汤干膏质量状况的缺陷。

发明内容

本申请的主要目的是提供一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法。

我方技术方案是基于中药复方领域在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在着难以全面反映药味多，组分多的防己黄芪汤干膏质量状况的缺陷的问题，进一步优化改进现有技术而成的。为了实现上述目的及解决现有技术中存在的问题，本申请采用了以下技术方案：

一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法，该方法采用了液相色谱分析法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取防己黄芪汤干膏，精密称定，加入乙腈润湿再加入甲醇，超声提取，放冷冷却至室温，离心取上清液经微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：取青藤碱对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、白术内酯Ⅰ对照品、6-姜辣素对照品、齐墩果酸对照品、甘草酸对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；

（3）测定：采用C18反相色谱柱，流动相A相为乙腈，B相为0.02～0.2mol/L乙酸铵和0.01～0.1%甲酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；

梯度洗脱的程序如下表所示：

A：乙腈；

B：乙酸铵及甲酸水溶液；

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入色谱仪，记录色谱图。

优选的，乙酸铵的浓度为0.02～0.2mol/L。

优选的，所述甲酸的与乙酸铵的体积比为1:999～9999。

优选的，防己黄芪汤干膏与乙腈的比例为1.0g:1.0ml。

优选的，防己黄芪汤干膏与甲醇的比例为1.0g:25ml。

优选的，微孔滤膜的孔径为0.22μm。

优选的，加入甲醇的体积百分数为50%。

优选的，制得的对照品每1ml中含有青藤碱对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、6-姜辣素对照品、齐墩果酸对照品、白术内酯Ⅰ对照品各0.02μg～1.0μg。

本检测方法的液相色谱的分析条件为以下（ⅰ）至（ⅵ）中的一项或者多项：

（ⅰ）色谱柱的规格为3.0mm*150mm*1.8μm，

（ⅱ）色谱柱温度为30±5℃，

（ⅲ）流动相比例的变换范围：±2%，

（ⅳ）流速为0.1～0.5ml/min，

（ⅴ）进样量为3～7μl，

（ⅵ）检测波长为190～400nm。

对于防已黄芪汤干膏的检测领域来说，现有技术中有较多的研究。但是，对于如何能够在保证检出13种共有峰的情况下又使得所使用的流动相的浓度最小，从而对色谱柱的损伤最小则没有相关揭示。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

1. 在我方申请的防己黄芪汤干膏指纹图谱方法建立的标准图谱相对其他方法能更有效更全面的评价样品质量，在允许的范围内原料和工艺发生变动确保质量可靠，最大限度的反映产品的药效和相关化学特性。

2.在我方申请的色谱条件之下，防已黄芪汤干膏中的13种共有峰能够被有效的检测出来，且分离时间适宜，峰形较好，与相邻色谱峰分离度高，重现性好。

3.相较于以往的防已黄芪汤干膏检测技术，我方采取了最低限度的乙酸铵和甲酸就检测出了13种共有峰，从而使得对柱的损害小，延长了色谱柱的使用寿命。

附图说明

图1是我方实施例1测得的防己黄芪汤干膏指纹图谱对照品图谱；

图2是我方实施例1测得的防己黄芪汤干膏指纹图谱供试品图谱；

图3是我方实施例2测得的防己黄芪汤干膏指纹图谱供试品图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1

一种防已黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：精密称取供试品防已黄芪汤干膏约1.0g加入1ml乙腈润湿再加入25ml 50%的甲醇，超声1h，冷却至室温，离心取上清液经0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

（2）对照品溶液的制备：取青藤碱对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、6-姜辣素对照品、齐墩果酸对照品、白术内酯Ⅰ对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液，具体称量如表1所示：

表1 对照品溶液配制表

（3）测定：

使用的色谱条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0mm*150mm 1.8μm USDE201935）；

流动相：0.02mol/L乙酸铵0.01%甲酸水溶液：乙腈；

梯度洗脱的程序如表2所示：

表2 梯度洗脱程序

检测波长：254nm ；柱温：30℃；流速：0.3ml/min；进样量为5μl。

取供试品溶液、对照品溶液续滤液各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图：结果如图1和图2所示，图1为测得的对照品溶液图谱，图2为测得的供试品溶液图谱。

由图可知，测得的供试品溶液图谱符合指纹图谱设定的基本要求，13种共有峰能够被有效的检测出来，且分离时间适宜，峰形较好，与相邻色谱峰分离度高。

实施例2

一种防已黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

（2）对照品溶液的制备：对照品溶液的制备延用实施例1的对照品溶液。

（3）测定：

使用的色谱条件如下：

流动相：0.02mol/L乙酸铵0.01%甲酸水溶液：乙腈；

梯度洗脱的程序如表3所示：

表3 梯度洗脱程序

检测波长：254nm ；柱温：30℃；流速：0.3ml/min；进样量为3μl。

取供试品溶液3ul注入液相色谱仪，记录色谱图：结果如图3所示。

由图可知，不同的进样体积测得的供试品溶液图谱也满足指纹图谱设定的基本要求，13种共有峰大部分能够被有效的检测出来，分离时间更适宜，峰形好，与相邻色谱峰分离度高。

实施例3 方法学验证相关例

1.重复性

为了确认重复性，从1批次取6次样品，相同浓度制备供试品溶液，按照实施例1中的色谱条件同一天进行分析。以最大峰面积（第9个峰）为标准，计算相对保留时间（relativeretention time， RRT）和相对峰面积(relative peak area， RPA)。对保留时间和峰面积的测定值和RRT，RPA计算平均值、标准偏差、相对标准偏差，确认重复性。分析结果，保留时间和峰面积测定值和相对值RSD<5%，保持高重复性。

保留时间的重复性结果见表4，峰面积的重复性结果见表5。

表4 保留时间的重复性

表5 峰面积的重复性

由表可知，保留时间和峰面积测定值和相对值RSD<5%，保持高重复性。

2. 中间精密度

为了确保精密度，对1个批次，第一天，第三天，第五天各取样品，不同的人员制备供试品溶液，进行分析，确认了保留时间和峰面积的中间精密度。分析结果保留时间和峰面积对测定值和相对值RSD<5%，保持高精密度。

保留时间的中间精密度结果见表6，峰面积的中间精密度结果见表7。

表6 保留时间的中间精密度

表7 峰面积的中间精密度

由表可知，保留时间和峰面积对测定值和相对值RSD<5%，保持高精密度。

3. 样本成分指纹图谱及评价

标准成分指纹图谱可作为质量评价的标准和化学相似度评价标准。为了与标准成分指纹图谱比较，选取比较对象样品与标准成分指纹图谱中选择的相同峰，得到样品的成分指纹图谱。通过样品中各峰面积和标准成分指纹图谱的峰面积之间的同等性相关系数统计学上评级化学相似度。

为了与标准成分指纹图谱做比较，同样的分析条件下进行了HPLC分析。样品出峰时间与标准成分指纹图谱中的峰的保留时间类似。根据这些峰面积利用EXCE L计算相关系数。

比较对象样品的保留时间和峰面积见表8。

表8标准成分指纹图谱和比较对象样品的峰面积及同等性相关系数

样品与标准成分指纹图谱峰面积比较时显示0.9441相似度，样品与标准图谱相似。

4. 共有峰的归属

阴性供试品溶液的制备：分别取防己黄芪汤干膏缺防己阴性样品、缺黄芪阴性样品，缺甘草阴性样品，缺白术阴性样品，缺生姜阴性样品，缺大枣阴性样品，按前述防己黄芪汤干膏指纹图谱的测定方法的供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

用前述防己黄芪汤干膏指纹图谱的构建方法的色谱条件，取上述阴性样品，照高效液相色谱法进行检测，得防己黄芪汤干膏相关性图谱。

结果：防己黄芪汤干膏标准指纹图谱中的13个共有峰，通过阴性样品及对照品做对照，对其进行归属，结果表明：2、3号峰归属为防己药材；4号峰归属为黄芪药材；5、6、8、9号峰归属为甘草药材；11号峰归属为生姜药材；12号峰归属为大枣药材；13号峰归属为白术药材。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种防己黄芪汤干膏指纹图谱的检测方法，该方法采用了液相色谱分析法，其特征在于，包括以下步骤：

梯度洗脱的程序如下表所示：

A：乙腈；

B：乙酸铵及甲酸水溶液；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酸铵的浓度为0.02～0.2mol/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲酸的与乙酸铵的体积比为1:999～9999。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防己黄芪汤干膏与乙腈的比例为1.0g:1.0ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述防己黄芪汤干膏与甲醇的比例为1.0g:25ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入甲醇的体积百分数为50%。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制得的对照品每1ml中含有青藤碱对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、甘草酸对照品、6-姜辣素对照品、齐墩果酸对照品、白术内酯Ⅰ对照品各0.02μg～1.0μg。

9.如权利要求1～8所述的方法，其特征在于，其中液相色谱的分析条件为以下（ⅰ）至（ⅵ）中的一项或者多项：

（ⅰ）色谱柱的规格为3.0mmx150mm 1.8μm，

（ⅱ）色谱柱温度为30±5℃，

（ⅲ）流动相比例的变换范围：±2%，

（ⅳ）流速为0.1～0.5ml/min，

（ⅴ）进样量为3～7μl，

（ⅵ）检测波长为190～400nm。