CN105738507A - 痛宁凝胶指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：步骤1，利用醇溶液对痛宁凝胶样品进行提取，获得样品溶液；利用相同的醇溶液溶解5?O?甲基维斯阿米醇苷以制备参照物溶液；步骤2，对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱。利用本发明所提供的方法所建立的痛宁凝胶指纹图谱，能有效地表征痛宁凝胶药物的质量，有利于全面监控药材的质量。同时，本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

Description

痛宁凝胶指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明属于中药质量鉴定技术领域，特别是涉及痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，以及利用该方法建立的痛宁凝胶指纹图谱。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC—MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种痛宁凝胶指纹图谱的建立方法。

本发明的第二目的是提供一种痛宁凝胶指纹图谱。

为了实现上述第一目的，本发明提供一种痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

步骤1，利用醇溶液对痛宁凝胶样品进行提取，获得样品溶液；利用相同的醇溶液溶解5-O-甲基维斯阿米醇苷以制备参照物溶液；

步骤2，对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱；

高效液相色谱条件如下：

流动相A和B分别为，乙腈-0.1v/v％磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1v/v％甲酸溶液、乙腈-含0.1v/v％甲酸与10mM乙酸铵的水、乙腈-0.02v/v％三乙胺溶液；优选的，以乙腈为流动相A，以0.1v/v％磷酸溶液为流动相B。

流速为0.8ml/min～1.2ml/min；优选的，流速为1.0ml/min。

柱温为25℃～35℃；优选的，柱温为30℃。

检测波长为230nm～300nm；优选的，检测波长为240nm。

本发明如上所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，优选的，在步骤1中，所述醇溶液为20～80v/v％的甲醇，或者为20～80v/v％的乙醇。更优选的，所述醇溶液为70v/v％的甲醇。

11.本发明如上所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，优选的，步骤1的具体过程为：取痛宁凝胶样品1.5g，精密称定，精密加入70v/v％甲醇25ml，超声提取30min，冷却，离心，取上清液，即得样品溶液；取5-O-甲基维斯阿米醇苷适量，加70v/v％甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得参照物溶液。

本发明如上所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，优选的，高效液相色谱条件如下：以乙腈为流动相A，以0.1v/v％磷酸溶液为流动相B；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm。

为了实现上述第一目的，本发明提供一种痛宁凝胶指纹图谱，其特征峰为5号峰升麻素苷、8号峰5-O-甲基维斯阿米醇苷和12号峰延胡索乙素，其保留时间分别为19.5min、28.1min、31.3min。进一步，痛宁凝胶指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、11号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰和18号峰，其保留时间分别为10.2min、13.2min、14.0min、16.9min、26.1min、27.4min、28.7min、29.5min、30.1min、38.3min、44.6min、50.5min、50.8min、53.8min、57.6min。

本发明的有益效果是：

1、用本发明所提供的方法所建立的痛宁凝胶指纹图谱，能有效地表征痛宁凝胶药物的质量，有利于全面监控药材的质量。

2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定痛宁凝胶整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。

3、本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

4、该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

附图说明

图1为本发明检测波长的选择试验所获得的色谱图；

图2为本发明流动相的选择试验所获得的色谱图；

图3为本发明柱温的考察试验所获得的色谱图；

图4为本发明流速的考察试验所获得的色谱图；

图5为本发明不同色谱柱的考察试验所获得的色谱图；

图6为本发明滞后峰测试试验所获得的色谱图；

图7为本发明空白溶剂测试试验所获得的色谱图；

图8为本发明色谱峰指认试验所获得的色谱图；

图9为本发明药材相关性考察试验所获得的色谱图；

图10为本发明痛宁凝胶指纹图谱生成试验所获得的色谱图；

图11为本发明指纹图谱的获得试验所获得的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一种痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

步骤1，取痛宁凝胶样品1.5g，精密称定，精密加入70v/v％甲醇25ml，超声提取30min，冷却，离心，取上清液，即得样品溶液；取5-O-甲基维斯阿米醇苷适量，加70v/v％甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得参照物溶液。所述醇溶液为20～80v/v％的甲醇，或者为20～80v/v％的甲醇乙醇。优选的，所述醇溶液为70v/v％的甲醇。

步骤2，对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱；

高效液相色谱条件如下：

流动相A和B分别为，乙腈-0.1v/v％磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1v/v％甲酸溶液、乙腈-含0.1v/v％甲酸与10mM乙酸铵的水、乙腈-0.02v/v％三乙胺溶液；优选的，以乙腈为流动相A，以0.1v/v％磷酸溶液为流动相B。

流速为0.8ml/min～1.2ml/min；优选地，流速为1.0ml/min。

柱温为25℃～35℃；优选地，柱温为30℃。

检测波长为230nm～300nm；优选地，检测波长为240nm。

1仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪,DAD紫外检测器(安捷伦公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪，VWD紫外检测器(安捷伦公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler AE240电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Milli-Q超纯水仪(密理博公司)；Centrifuge 5415D高速离心机(德国eppendrof公司)。

乙腈，色谱纯，美国天地公司；其他试剂均为分析纯，南京化学试剂公司；超纯水。

2药品来源

痛宁凝胶(批号130201、130202、130203、130301、130302、130303、140401、140402、140403和140404)，江苏南星药业有限责任公司生产。

3参照物的选择

痛宁凝胶处方由醋延胡索、川芎、威灵仙、伸筋草、东北透骨草、路路通、海桐皮、防风、花椒、牛膝、薄荷脑和冰片共12味药组成，根据对各药味的分析，其主要有效可测成分为延胡索乙素、阿魏酸、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷等，其中5-O-甲基维斯阿米醇苷含量较高，分离较好，保留时间较为适中，含量较稳定，因此选择其5-O-甲基维斯阿米醇苷作为参照物。

4供试品溶液的制备

试验对不同提取溶剂进行了考察，具体操作为：取批号为130201的痛宁凝胶样品1.5g，精密称定，精密加入提取溶剂(30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇25ml，超声提取30min，放冷，离心，取上清液进样分析。结果表明70％甲醇提取效果较优，峰型和分离情况较好。结果见表1。

表1 不同提取溶剂得指纹图谱主要峰的峰面积

根据上述考察结果，供试品溶液制备方法确定为：取痛宁凝胶样品约1.5g，精密称定，精密加入70％甲醇25ml，超声提取30min，放冷，离心，取上清液，即得。

5色谱条件

实施例1检测波长的选择

通过230nm、240nm、250nm、270nm、280nm和300nm 6个检测波长及190～400nm范围全扫描比较分析，240nm检测波长能较全面的反映痛宁凝胶中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，所以选择240nm为痛宁凝胶指纹图谱测定波长，见图1。

实施例2流动相的选择

使用Kromasil 100-5C18(4.6×250mm，5μm，S.N.103604)色谱柱比较了乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸溶液、乙腈-水(含0.1％甲酸和10mM乙酸铵)和乙腈-0.02％三乙胺溶液对本品指纹图谱的影响，结果上述各流动相系统所得指纹图谱中乙腈-0.1％磷酸系统分离情况和峰形较好，因此痛宁凝胶指纹图谱流动相选择乙腈-0.1％磷酸系统。见图2。

实施例3柱温的考察

试验比较了柱温为25℃、30℃和35℃所得图谱，结果柱温为30℃时所得指纹图谱中峰形和分离度较好。见图3。

实施例4流速的考察

试验比较了流速为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min所得图谱，结果流速为1.0ml/min时所得指纹图谱的分离情况和峰形较好。见图4。

实施例5不同色谱柱的考察

在试验过程中考察了Kromasil 100-5C18(4.6×250mm,5μm)、Agilent 5TC-C18(4.6nm*250nm,5μm)和Thermosyncronic C18(250mm*4.6mm，5μm)三种不同品牌色谱柱，结果Kromasil 100-5C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱对本品指纹图谱中各色谱峰分离较好，如图5。

实施例6空白溶剂和滞后峰测试

测定空白溶剂(70％甲醇)的色谱图，结果表明空白溶剂对本品指纹图谱的测定无干扰。延长测试时间1倍至120min，结果未见有滞后峰出现。见图6和图7。

综上所述，痛宁凝胶指纹图谱检测条件确定为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Kromasil 100-5C18,柱长为250mm,内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为240nm；柱温30℃。

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录60min图谱，即得。

对比例1色谱峰指认

用处方中药味已知成分升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、阿魏酸、延胡索乙素、槲皮素、山奈素进行比对，指认出5号峰为升麻素苷，8号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷，12号峰为延胡索乙素。如图8所示。

对比例2药材相关性考察

分别将醋延胡索、伸筋草、路路通、威灵仙、川芎、防风、牛膝、东北透骨草、海桐皮、花椒、薄荷脑和冰片粉碎，按处方折算取样量，分别精密加入70％甲醇25ml，超声处理30min，放冷，离心，取上清液，分别进样分析，结果表明1、2、3、15和16号峰来自花椒，2、4、6、10、11、17和18号峰来自海桐皮，12和13号峰来自延胡索，5号峰和8号峰来自防风。见图9。

精密度试验

取批号为130201的供试品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6针，测定结果见表2和表3。结果表明供试品溶液中共有峰的相对保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致(RSD<5％)，精密度良好。

表2 痛宁凝胶指纹图谱精密度考察结果(共有峰相对保留时间)

表3 痛宁凝胶指纹图谱精密度考察结果(主要峰的相对峰面积)

重复性试验

取批号为130201的痛宁凝胶，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，依法测定，测定结果见表4和表5。结果表明，供试品溶液中共有峰的相对保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致(RSD<3％)，结果表明该方法重复性良好。

表4 痛宁凝胶指纹图谱重复性考察结果(共有峰的相对保留时间)

表5 痛宁凝胶指纹图谱重复性考察结果(主要峰的相对峰面积)

稳定性试验

取批号为130201，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h测定一次指纹图谱，共测7次，测定结果见表6和表7。结果表明，供试品溶液中共有峰的相对保留时间和主要色谱峰的相对峰面积基本一致(RSD<3％)，表明供试品溶液室温18小时内稳定性良好。

表6 痛宁凝胶指纹图谱稳定性考察结果(共有峰的相对保留时间)

表7 痛宁凝胶指纹图谱稳定性考察结果(主要峰的相对峰面积)

以上方法学考察结果，表明该方法测定痛宁凝胶指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

痛宁凝胶指纹图谱生成

收集十批痛宁凝胶样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液。测定指纹图谱，十批不同批号的痛宁凝胶指纹图谱见图10。

对照指纹图谱的获得及共有峰的确定

上述十批样品用药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价软件计算相似度，生成对照指纹图谱，选择十批样品指纹图谱中均存在的色谱峰作共有峰。见图11。

10批痛宁凝胶指纹图谱相似度计算

采用对照指纹图谱用药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算10批痛宁凝胶指纹图谱相似度，结果见表8。

表8 10批痛宁凝胶指纹图谱相似度结果

结果表明，10批痛宁凝胶指纹图谱相似度均在0.90以上，因此确定痛宁凝胶指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱的相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱经相似度计算，其相似度不得低于0.90。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，利用醇溶液对痛宁凝胶样品进行提取，获得样品溶液；利用相同的醇溶液溶解5-O-甲基维斯阿米醇苷以制备参照物溶液；

步骤2，对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录60min图谱；

高效液相色谱条件如下：

流动相A和B分别为，乙腈-0.1v/v％磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1v/v％甲酸溶液、乙腈-含0.1v/v％甲酸与10mM乙酸铵的水、乙腈-0.02v/v％三乙胺溶液；

流速为0.8ml/min～1.2ml/min；

柱温为25℃～35℃；

检测波长为230nm～300nm。

2.根据权利要求1所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤1中，所述醇溶液为20～80v/v％的甲醇，或者为20～80v/v％的乙醇；步骤1的具体过程为：取痛宁凝胶样品1.5g，精密称定，精密加入70v/v％甲醇25ml，超声提取30min，冷却，离心，取上清液，即得样品溶液；取5-O-甲基维斯阿米醇苷适量，加70v/v％甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得参照物溶液。

3.根据权利要求2所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述醇溶液为70v/v％的甲醇。

4.根据权利要求1所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，以乙腈为流动相A，以0.1v/v％磷酸溶液为流动相B。

5.根据权利要求1所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，流速为1.0ml/min。

6.根据权利要求1所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，柱温为30℃。

7.根据权利要求1所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，检测波长为240nm。

8.根据权利要求1-7任一项所述的痛宁凝胶指纹图谱的建立方法，其特征在于，高效液相色谱条件如下：以乙腈为流动相A，以0.1v/v％磷酸溶液为流动相B；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为240nm。

9.一种痛宁凝胶指纹图谱，其特征在于，其特征峰为5号峰升麻素苷、8号峰5-O-甲基维斯阿米醇苷和12号峰延胡索乙素，其保留时间分别为19.5min、28.1min、31.3min。

10.根据权利要求9所述的痛宁凝胶指纹图谱，其特征在于，还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、11号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰和18号峰，其保留时间分别为10.2min、13.2min、14.0min、16.9min、26.1min、27.4min、28.7min、29.5min、30.1min、38.3min、44.6min、50.5min、50.8min、53.8min、57.6min。