CN106645440B - 舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明首先公开了一种舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建方法，其次是提供一种舒筋活络止痛膏的质量检测方法，其步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测舒筋活络止痛膏的色谱图和对照品藁本内酯的色谱图，将待测舒筋活络止痛膏的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测舒筋活络止痛膏的色谱图中出现标准特征图谱中相同的11个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，则该舒筋活络止痛膏的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断舒筋活络止痛膏的质量。

Description

舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中成药的质量控制技术，具体涉及一种舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建及其质量检测方法。

背景技术

舒筋活络止痛膏是一种上市多年的中成药，现行执行标准是国家药品标准WS3-B-1832-94-2016。舒筋活络止痛膏由骨碎补、续断、土鳖虫、羌活、天南星、乳香、没药、当归、桃仁、五加皮、蒲公英、红花、冰片、樟脑、水杨酸甲酯、桉油等十六味组成。活血化瘀，舒筋通络，消肿止痛，用于跌打损伤，扭挫伤等软组织损伤。

目前，对舒筋活络止痛膏的质量控制方法主要是鉴别其中的当归、羌活、冰片、桉油、水杨酸甲酯，以及樟脑含量，这些方法虽能在一定程度上控制舒筋活络止痛膏的质量，但还是无法全面地反映其质量状况，例如，提取部分的药味中所含有的活性成分很多，因此若只用樟脑这个指标来评价和控制产品的质量则明显不足。为了弥补现有舒筋活络止痛膏的质量控制方法的缺陷，有必要构建该产品的标准特征图谱，以便于更好地进行该产品的质量控制。

目前，有关处方药味的特征图谱研究的专利和文献较多，经查阅资料可知：(1)名称为“一种当归配方颗粒的制备方法及其高效液相色谱特征指纹图谱控制方法”(申请号为CN103989717A)的发明专利公开了当归颗粒的特征图谱的检测方法，其是以水-醋酸(99:1)和乙腈溶液作为流动相，梯度洗脱，检测波长为280nm，特征指纹图谱共有5个特征峰；(2)名称为“当归、川芎中药材指纹图谱的建立方法”(申请号为CN1707260B)的发明专利公开了当归、川芎中药材指纹图谱的检测方法，其是以含0.4％冰醋酸的甲醇和含0.4％冰醋酸的水作为流动相，梯度洗脱，检测波长为280nm，当归的特征峰为15个；(3)名称为“一种红花药材的指纹图谱的鉴别方法”(申请号为CN103969381B)的发明专利公开了红花药材指纹图谱的鉴别方法，其是以乙腈和0.01-2％冰醋酸作为流动相，梯度洗脱，检测波长为280nm，有12个特征峰；(4)名称为“乳香药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱”(申请号为CN102809616B)的发明专利公开了乳香药材指纹图谱的检测方法，其是以1％冰醋酸水溶液和甲醇作为流动相，梯度洗脱，检测波长为280nm，有15个特征峰；(5)名称为“不同产地市售红花药材指纹图谱的建立”的文献公开了红花药材指纹图谱的检测方法，其是以乙腈和0.01％三氟乙酸溶液作为流动相，梯度洗脱，检测波长为280nm，共有25个指纹峰；(6)名称为“骨碎补的HPLC指纹图谱建立”的文献公开了骨碎补药材指纹图谱的检测方法，其是以乙腈和0.088％甲酸作为流动相，梯度洗脱，检测波长为263nm进行检测，共有5个指纹峰；(7)名称为“蒲公英药材高效液相色谱特征图谱建立”的文献公开了蒲公英药材指纹图谱的检测方法，其是以甲醇和0.015％的磷酸水作为流动相，梯度洗脱，检测波长为323nm，共有9个特征峰；(8)名称为“续断的指纹及LC-ESI-MS分析”的文献公开了续断药材指纹图谱的检测方法，其是以0.1％磷酸水和乙腈作为流动相，梯度洗脱，检测波长为205nm，共有17个特征峰；(9)名称为“云南续断药材HPLC特征指纹图谱研究”的文献公开了续断药材指纹图谱的检测方法，其是以甲醇和水作为流动相，梯度洗脱，检测波长为220nm，共有14个特征峰；(10)名称为“川续断的化学成分和质量标准研究”的硕士论文公开了川续断药材指纹图谱的检测方法，其是以乙腈和0.05％的磷酸水作为流动相，梯度洗脱，检测波长为212nm，共有21个特征峰；(11)名称为“当归水溶性成分HPLC指纹图谱研究”的文献公开了当归指纹图谱的检测方法，其是以0.1％甲酸水和乙腈作为流动相，梯度洗脱，检测波长为254nm，共有13个指纹峰；(12)中国药典2015年版一部第183页公开了羌活的特征图谱的检测方法，其是以乙腈和0.1％的磷酸水作为流动相，梯度洗脱，检测波长为246nm进行检测，共有4个特征峰；(13)名称为“骨碎补高效液相指纹图谱研究及主要成分含量测定”的文献公开了骨碎补指纹图谱的检测方法，其是以甲醇和磷酸水溶液(pH3.6)作为流动相，梯度洗脱，检测波长为283nm，共有6个指纹峰。

申请人曾采用上述方法检测舒筋活络止痛膏的特征图谱，结果色谱峰较少，也即是说直接或基于上述现有方法均难以对舒筋活络止痛膏的质量控制提供检测依据。因此，如何对舒筋活络止痛膏的特征图谱进行有效测定，进而为舒筋活络止痛膏的质量检测控制提供依据，这是目前尚需解决的技术瓶颈。

发明目的

本发明的首要目的是提供一种操作方便、重现性好、精密度高的舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建方法，其步骤如下：

a)标样溶液、参照物溶液的准备：将至少15批次合格的舒筋活络止痛膏分别超声提取得到各标样溶液，将藁本内酯对照品加甲醇制成参照物溶液；

b)高效液相色谱分析：精密吸取等量的各标样溶液、参照物溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，即得各标样溶液和参照物溶液的色谱图；

c)标准特征图谱的构建：将得到的各标样溶液的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定得到舒筋活络止痛膏的标准特征图谱，该标准特征图谱中有11个特征峰，按出现的时间顺序将所述的11个特征峰依次编号1～3、S、4～10，以参照物溶液的色谱峰的相对保留时间为1，计算得知1～10号特征峰的平均相对保留时间分别为0.47、0.63、0.75、1.08、1.27、1.38、1.45、2.09、2.25、2.56；所述的S号色谱峰是藁本内酯的特征峰，其平均相对保留时间为1。

本发明公开的舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建方法是申请人经多年的试验研究获得，不仅能反映舒筋活络止痛膏的内在质量，而且操作简便快捷。采用本发明公开的上述方法构建的标准特征图谱中的11个特征峰的分离度高，从而为后续舒筋活络止痛膏产品的质量检测有效地提供了数据基础，进而为舒筋活络止痛膏今后的标准化生产提供一种可行的质量控制模式。具体说来，本发明是将合格的各舒筋活络止痛膏制得的标样溶液与藁本内酯对照品制得的参照物溶液在规定的实验条件下测定分析得到色谱图，这样将藁本内酯对照品的色谱图与合格的各舒筋活络止痛膏的色谱图进行比对，从而可以确定两者之间的共有特征峰，亦即找出各舒筋活络止痛膏测得的色谱图上的藁本内酯的特征峰，从而以藁本内酯特征峰的相对保留时间为1，计算出各舒筋活络止痛膏的色谱图上其他特征峰的相对保留时间，进而为后续的待测舒筋活络止痛膏产品的质量检测提供数据基础。

需要说明的是，所述的合格的舒筋活络止痛膏也可以理解为是标准舒筋活络止痛膏，其是质量完全符合国家相关标准的舒筋活络止痛膏。

优选的，高效液相色谱分析的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.025～0.1％的磷酸溶液为流动相B，流动相按体积比为10～55：90～45的A相和B相梯度洗脱；流速0.5～1.5ml/min；检测波长333±2nm；柱温30～40℃；进样液的进样量为10～20μl；按照藁本内酯计算，理论塔板数≥6000。申请人通过研究摸索发现，采用上述色谱条件检测得到的色谱峰分离度高，且长时间下来色谱峰也无明显变化，说明采用该色谱条件能够很好的反映样品的特征信息。

作为进一步的优选方案,步骤b)所述的A相为色谱级甲醇；步骤b)中梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10min，A相35％→55％，B相65％→45％；10～20min，A相55％→60％，B相45％→40％；20～60min，A相60％→90％，B相40％→90％；60～65min，A相90％→45％、B相10％→55％。

实际在制备标样溶液和参照物溶液时，优选方案是取15批合格的舒筋活络止痛膏分别进行超声提取操作制得各标样溶液，具体的，步骤a)中各标样溶液的超声提取步骤为：取各合格的舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～40ml，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为标样溶液；步骤a)中参照物溶液的制备步骤为：取藁本内酯对照品，加甲醇制成每1ml含40μg藁本内酯的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。按上述限定参数进行操作制取的标样溶液中各组分的分离效果最好，测得的舒筋活络止痛膏的色谱图也最为准确。

本发明的另一个目的是基于以上方法构建的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱，提供一种舒筋活络止痛膏的质量检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，一种舒筋活络止痛膏的质量检测方法，其步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测舒筋活络止痛膏的色谱图和对照品藁本内酯的色谱图，将待测舒筋活络止痛膏的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测舒筋活络止痛膏的色谱图中出现标准特征图谱中相同的11个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，则该舒筋活络止痛膏的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断舒筋活络止痛膏的质量。

附图说明

图1-8为实施例1测得的色谱图；

图9实施例2测得的藁本内酯的色谱图；

图10为实施例2测得的标准舒筋活络止痛膏的色谱图；

图11为实施例2测得的15批标准舒筋活络止痛膏的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析导出的截图；

图12为实施例2制定得到的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱。

具体实施方式

以下结合实施例1-4对本发明公开的技术方案作进一步的说明：

实施例1：不同条件下舒筋活络止痛膏的供试液的HPLC测定

1、仪器与药品

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的合格的舒筋活络止痛膏，批号为20150101；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的藁本内酯对照品(纯度88.9％)，批号为111737-201103。

2、供试液制备

取舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入90％乙醇/甲醇20ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为供试液，结果表明以甲醇作为溶媒提取的供试液色谱图较好，如图1所示，故以下2.2均采用以甲醇作为溶媒提取的供试液进行试验。

2.2色谱条件的选择

(1)依据2015年版《中国药典》一部羌活药材项下指纹图谱检测的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；柱温为30℃，PDA检测波长范围200-500nm，流速为1.0ml/min；精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定，比较200-500nm的色谱峰，在波长为333nm时，色谱峰相对较好，但4分钟后只有1个色谱峰，如图2所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(2)依据名称为“骨碎补的HPLC指纹图谱研究”(作者刘珂第等)的文献资料公开的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；同(1)方法进行测定，在波长为333nm时，5分钟后只有1个色谱峰，如图3所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(3)依据名称为“云南续断药材的HPLC特征指纹图谱研究”(作者为杨紫刚等)的文献资料公开的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；同(1)方法进行测定，在波长为333nm时，50分钟后出现多个密集色谱峰，如图4所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(4)依据名称为“当归水溶性成分HPLC指纹图谱研究”(作者为张敏等)的文献资料公开的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱；同(1)方法进行测定，在波长为333nm时，50分钟后出现多个密集色谱峰，如图5所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(5)依据名称为“蒲公英药材高效液相色谱特征图谱研究”(作者为李喜凤等)的文献资料公开的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以甲醇为流动相A，0.15％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；同(1)方法进行测定，在波长为333nm时，55分钟后出现多个密集色谱峰，如图6所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

(6)依据名称为“不同产地市售红花药材指纹图谱的建立”(作者为金莹莹等)的文献资料公开的色谱条件，采用Sepax Bio-C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以甲醇为流动相A，0.01％三氟乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱；同(1)方法进行测定，在波长为333nm时，5-8分钟后出现若干个色谱峰，如图7所示，说明采用该色谱条件不能很好的反映样品的特征信息。

从上述(1)-(6)可以看出，按照以上现有文献的特征图谱或指纹图谱色谱条件方法测定所得的舒筋活络止痛膏样品的HPLC图谱峰较少，不能准确地反映该品种内在质量的特征信息。需要说明的是，图3-7中的峰值数据显示在图中有交叉重叠的问题，导致数据显示不够清楚，但是这些附图主要是说明了采用现有的条件测定得到的图谱存在缺陷，这些图并不对本发明需要保护的技术内容产生影响，故此处不再对附图的具体数据做出说明。

(7)依据本发明公开的色谱条件，采用C18柱(尺寸250mm×4.6mm,粒径5μm)、以甲醇为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，检测波长为333nm，流速为1.0ml/min，精密吸取供试液10μl，注入液相色谱仪中，测定，即得，在波长为333nm时，色谱峰的分离度高，且在1小时后色谱峰无明显变化，如图8所示，说明采用该色谱条件能够很好的反映样品的特征信息。

表1流动相梯度表

实施例2：舒筋活络止痛膏标准特征图谱的构建

1、仪器与药品

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的15批标准舒筋活络止痛膏，批号分别为20160601、20160501、20160301、20151201、20151101、20151001、20150901、20150801、200150401、20150103、20150102、20150101、20141001、20140901、20140801，上述15批标准舒筋活络止痛膏依次编号为S1～S15；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的藁本内酯对照品(纯度88.9％)，批号为111737-201103。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以0.025％的磷酸溶液为流动相B，流动相按体积比为10～55：90～45的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10min，A相35％→55％，B相65％→45％；10～20min，A相55％→60％，B相45％→40％；20～60min，A相60％→90％，B相40％→90％；60～65min，A相：90％、B相：10％，流速0.5ml/min；检测波长333nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照藁本内酯峰计算，理论塔板数≥6000。

3、标准特征图谱的特征峰的测定

3.1标准特征图谱的构建

(1)标样溶液的制备：取15批上述合格的舒筋活络止痛膏分别进行超声提取操作，各舒筋活络止痛膏的超声提取步骤为：取舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为标样溶液。

(2)参照物溶液的制备：取藁本内酯对照品，置100ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含10μg藁本内酯的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和标样溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得藁本内酯对照品的色谱图(见图9)和标准舒筋活络止痛膏的色谱图(见图10，为批号为20150101的舒筋活络止痛膏的色谱图)。

(4)标准特征图谱的构建

将检测得到的15批标准舒筋活络止痛膏的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，相应操作后得到如图11所示的标准舒筋活络止痛膏的特征图谱，图11中的R号图谱为系统生成的对照图谱，导出即得如图12所示的标准舒筋活络止痛膏的标准特征图谱。

3.2标准特征图谱中特征峰的确定

经比较15批标准舒筋活络止痛膏色谱图和藁本内酯的色谱图，确定舒筋活络止痛膏的色谱图中有11个特征峰，按出现的时间顺序将这11个特征峰依次编号1～3、S、4～10，其中S号色谱峰为藁本内酯的特征峰，设定S号峰的相对保留时间为1，计算其他10个峰的相对保留时间，结果如表2所示。经计算，1～10号峰的平均相对保留时间分别为：0.47、0.63、0.75、1.08、1.27、1.38、1.45、2.09、2.25、2.56，相对标准差均不超过0.066％。

表2 15批标准舒筋活络止痛膏的色谱图中各特征峰的相对保留时间

3.3标准特征图谱的精密度试验

取舒筋活络止痛膏(批号为20150101)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，连续进样6次，得到6个色谱图，均出现11个特征峰，设定藁本内酯的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中其它10个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中10个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD≤0.08％。

3.4标准特征图谱的重复性试验

取舒筋活络止痛膏(批号为20150101)6份，按照3.1中步骤(1)公开的方法分别制备成标样溶液，分别检测得到6个色谱图，均出现11个特征峰，设定藁本内酯的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中10个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中10个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD≤0.048％。

3.5标准特征图谱的稳定性试验

取舒筋活络止痛膏(批号为20150101)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，精密吸取6份标样溶液，每份10μl，按上述色谱条件分别在0h、1h、2h、4h、8h和12h进样，检测得到6个色谱图，均出现11个特征峰，设定藁本内酯的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中10个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中10个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD≤0.077％。

以上试验结果表明，采用本发明公开的方法构建得到的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱精密度高，重复性好，结果准确可靠，其能全面的反映舒筋活络止痛膏的化学信息，进而确保该产品的质量与疗效。

实施例3：舒筋活络止痛膏的质量检测

1、仪器与试药

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的舒筋活络止痛膏，批号为20160301；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的藁本内酯对照品(纯度88.9％)，批号为111737-201103。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％的磷酸溶液为流动相B，流动相按体积比为10～55：90～45的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10min，A相35％→55％，B相65％→45％；10～20min，A相55％→60％，B相45％→40％；20～60min，A相60％→90％，B相40％→90％；60～65min，A相90％、B相10％，流速1.5ml/min；检测波长333nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照藁本内酯峰计算，理论塔板数≥6000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取藁本内酯对照品，置100ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含50μg藁本内酯的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液。。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得藁本内酯对照品的色谱图和待测舒筋活络止痛膏的色谱图。待测舒筋活络止痛膏的色谱图中共有11个特征峰，以藁本内酯的特征峰的相对保留时间为1，其1-10号峰的相对保留时间分别为：0.470、0.627、0.746、1.078、1.266、1.383、1.446、2.097、2.254、2.563。经计算，待测舒筋活络止痛膏的色谱图中的1-10号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，即在规定范围内，说明该舒筋活络止痛膏(批号为20160301)的质量合格。

实施例4舒筋活络止痛膏的质量检测

1、仪器与试药

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的舒筋活络止痛膏，批号分别为20140901；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的藁本内酯对照品(纯度88.9％)，批号为111737-201103。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以0.05％的磷酸溶液为流动相B，流动相按体积比为10～55：90～45的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10min，A相35％→55％，B相65％→45％；10～20min，A相55％→60％，B相45％→40％；20～60min，A相60％→90％，B相40％→90％；60～65min，A相：90→45％、B相：10→55％。流速1.0ml/min；检测波长333nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照藁本内酯峰计算，理论塔板数≥6000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取藁本内酯对照品，置100ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含30μg藁本内酯的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液。。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得藁本内酯对照品的色谱图和待测舒筋活络止痛膏的色谱图。待测舒筋活络止痛膏的色谱图中共有11个特征峰，以藁本内酯的特征峰的相对保留时间为1，其1-10号峰的相对保留时间分别为：0.469、0.626、0.746、1.078、1.266、1.383、1.447、2.098、2.255、2.563。经计算，待测舒筋活络止痛膏的色谱图中的1-10号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，即在规定范围内，说明该舒筋活络止痛膏(批号为20140901)的质量合格。

Claims (4)

1.一种舒筋活络止痛膏的标准特征图谱的构建方法，其步骤如下：

a)标样溶液、参照物溶液的准备：将至少15批次合格的舒筋活络止痛膏分别超声提取得到各标样溶液，将藁本内酯对照品加甲醇制成参照物溶液；

b)高效液相色谱分析：精密吸取等量的各标样溶液、参照物溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，即得各标样溶液和参照物溶液的色谱图；

c)标准特征图谱的构建：将得到的各标样溶液的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定得到舒筋活络止痛膏的标准特征图谱，该标准特征图谱中有11个特征峰，按出现的时间顺序将所述的11个特征峰依次编号1～3、S、4～10，以参照物溶液的色谱峰的相对保留时间为1，计算得知1～10号特征峰的平均相对保留时间分别为0.47、0.63、0.75、1.08、1.27、1.38、1.45、2.09、2.25、2.56；所述的S号色谱峰是藁本内酯的特征峰，其平均相对保留时间为1；

所述步骤b)中高效液相色谱分析的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.025～0.1％的磷酸溶液为流动相B，流动相A相和B相按照下述记载的时间和比例进行梯度洗脱；流速0.5～1.5ml/min；检测波长333±2nm；柱温30～40℃；进样液的进样量为10～20μl；按照藁本内酯计算，理论塔板数≥6000；

其中梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～10min，A相35％→55％，B相65％→45％；10～20min，A相55％→60％，B相45％→40％；20～60min，A相60％→90％，B相40％→10％；60～65min，A相90％→45％、B相10％→55％；

所述特征图谱用于舒筋活络止痛膏的质量检测，其检测方法的具体步骤为：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测舒筋活络止痛膏的色谱图和藁本内酯对照品的色谱图，将待测舒筋活络止痛膏的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测舒筋活络止痛膏的色谱图中出现标准特征图谱中相同的11个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，则该舒筋活络止痛膏的质量合格，反之则不合格。

2.根据权利要求1所述的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤b)中所述的A相为色谱级甲醇。

3.根据权利要求2所述的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤a)中各标样溶液的超声提取步骤为：取各合格的舒筋活络止痛膏2片，除去盖衬，剪成小片，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20～40ml，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即为标样溶液。

4.根据权利要求3所述的舒筋活络止痛膏的标准特征图谱的构建方法，其特征在于：步骤a)中参照物溶液的制备步骤为：取藁本内酯对照品，加甲醇制成每1ml含40μg藁本内酯的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。