CN105044260A - 玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法及检测方法。所述构建方法包括如下步骤：取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，然后精密加入甲醇，回流提取1-3h，过滤，即得供试品溶液；精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的玉屏风制剂指纹图谱，其中，所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。该构建方法建立了由22个共有峰组成的玉屏风制剂液相色谱指纹图谱，共有峰具有特征性，可全面有效地控制玉屏风制剂的质量，同时鉴定了其中10个主要指纹峰，并对全部的共有峰进行了峰归属，结果可靠，重复性好。

Description

玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及药材检测领域，特别是涉及玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法。

背景技术

经典方剂玉屏风制剂是扶正祛邪的代表方，来源自南宋嘉定六年(1213年)张松《究原方》，由黄芪、白术和防风组成。其中黄芪甘温，内补脾肺之气，外可固表止汗，为君药；白术健脾益气，助黄芪以加强益气固表之功，为臣药；佐以防风走表而散风邪。该方对人体犹如抵御外邪的屏障，故称玉屏风。具有益气固表、健脾止汗的作用。主治气虚自汗、易感风寒之证，临床疗效确切，被称为中成药中的丙种球蛋白。

玉屏风制剂为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立玉屏风制剂的指纹图谱将能较为全面地反映其中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。玉屏风制剂指纹图谱的研究和建立，对于提高玉屏风散质量，促进中药现代化具有重要意义。

然而，就目前而言，玉屏风制剂的质量控制方法还存在一定缺陷，《中国药典》仅通过经氨转化所得黄芪甲苷的含量来表征其质量，而现有关于玉屏风的指纹图谱研究多数集中在汤剂，其它剂型的质量较少得到关注，且获得的指纹图谱的共有特征峰较少，难以全面有效的表征或控制玉屏风制剂的质量。

发明内容

基于此，有必要提供一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法。

一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h(优选为2h)，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的玉屏风制剂指纹图谱，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱(优选为YMCHydrosphereC₁₈，4.6×250mm，5μm)；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长230nm。

本发明还提供一种玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

在其中一个实施例中，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱(优选为YMCHydrosphereC₁₈，4.6×250mm，5μm)；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长230nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，通过大量的实验对供试品溶液的制备以及高效液相色谱的条件进行了优化研究：

采用甲醇对玉屏风制剂进行回流提取，并合理控制提取时间为1-3h，可有效增加玉屏风制剂中如毛蕊异黄酮葡萄糖苷等成分的稳定性，提高构建所得指纹图谱的准确性和精密度；

通过对流动相系统进行考察，发现采用乙腈-体积浓度(0.02-0.1)％磷酸水溶液(优选体积浓度为0.05％)系统按照本发明所述的梯度洗脱方式进行洗脱，可获得较多的特征峰(共22个特征共有峰)，且各特征峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，且较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱；

采用C18色谱柱(优选为YMCHydrosphereC₁₈)分析所得的指纹图谱中，色谱峰尖锐对称，可获得较为丰富的峰信息。

综上所述，本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，建立了由22个共有峰组成的玉屏风制剂液相色谱指纹图谱，共有峰具有特征性，较为全面的将每味中药的主要成分都进行的控制，有别于药典标准和现有文献评价方法，并且对每味药材的指标色谱峰做了定性鉴别和峰归属，使得玉屏风制剂的质量控制更为全面和精确。经检验，该玉屏风制剂指纹图谱的构建方法结果可靠，具有较好的重复性和精密度。

本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，可以更准确全面地对玉屏风制剂的质量进行控制，且精密度高，重复性好。

附图说明

图1为空白溶剂高效液相色谱图；

图2为供试样品溶液高效液相色谱图；

图3为缺黄芪阴性对照高效液相色谱图；

图4为缺防风阴性对照高效液相色谱图；

图5为缺麸炒白术阴性对照高效液相色谱图；

图6为对照品溶液高效液相色谱图；

图7为12批玉屏风制剂指纹图谱(S1-S12)及对照指纹图谱(RFP)；

图8为玉屏风制剂的对照指纹图谱；

图9为实施例2所述待测样品的指纹图谱；

图10为实施例3所述待测样品的指纹图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的玉屏风制剂指纹图谱的构建方法和检测方法作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法。

1、材料

1.1药物与试剂

黄芪、防风、麸炒白术为香雪制药股份有限公司自生产；玉屏风散样品为香雪制药股份有限公司自生产，将黄芪、防风、麸炒白术，分别粉碎，按3:1:1比例混合均匀即得。

对照品：升麻素苷(中国食品药品检定研究院，111522-201209)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(中国食品药品检定研究院，111920-201203)、升麻素(成都瑞芬思生物科技有限公司，S-007-130908)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(中国食品药品检定研究院，111523-201208)、亥茅酚苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，H-027-130912)、毛蕊异黄酮(成都瑞芬思生物科技有限公司，M-021-130525)、芒柄花素(成都瑞芬思生物科技有限公司，C-018-130428)、白术内酯Ⅲ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-035-130428)、白术内酯Ⅰ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-033-130428)、白术内酯Ⅱ(成都瑞芬思生物科技有限公司，B-035-130428)、芒柄花苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，M-013-130516)和槲皮素(中国食品药品检定研究院，100081-200907)。

甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

电子天平(MettlerToledoXS204(d＝0.1mg)、MettlerToledoXP205(d＝0.01mg))、HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、SimplicityUV纯水机(Millipore)、高效液相色谱仪(DIONEXUltimate3000、DAD-3000检测器)。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱条件：色谱柱(YMCHydrosphereC₁₈，4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-体积浓度0.05％磷酸(B)，梯度洗脱(梯度见表1)；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；检测波长230nm。

表1梯度条件

2.2对照品溶液的制备

对照品储备液的制备：分别精密称取升麻素苷3.5mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.0mg、升麻素2.0mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷3.0mg、亥茅酚苷2.5mg、毛蕊异黄酮2.0mg、芒柄花素4.0mg、白术内酯Ⅲ4.0mg、白术内酯Ⅰ4.0mg、白术内酯Ⅱ4.0mg、芒柄花苷2.0mg、槲皮素2.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，储存于4℃的冰箱中，备用。

对照品溶液的制备：分别精密量取各对照品储备液适量，用甲醇定容，配制成含升麻素苷35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷20μg/mL、升麻素10μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷30μg/mL、亥茅酚苷25μg/mL、毛蕊异黄酮20μg/mL、芒柄花素40μg/mL、白术内酯Ⅲ5μg/mL、白术内酯Ⅰ5μg/mL、白术内酯Ⅱ5μg/mL、芒柄花苷20μg/mL、槲皮素20μg/mL的混合标准品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取玉屏风散粉末1g，精密称定，加50mL甲醇回流提取2h，过滤，滤液浓缩至干后，加甲醇定容至10mL，即得。

2.4色谱峰归属和部分峰定性

分别制备黄芪、防风和麸炒白术的阴性对照样品，按2.3项供试品溶液制备方法同法制备。

分别取空白溶剂、供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液，过0.45μm滤膜，按2.1项色谱条件进样测定，进行色谱峰归属和部分峰定性分析。

结果，空白溶剂进样在本系统条件下在100min左右有溶剂峰出现，见图1，分析指纹峰时应予以排除；在当前色谱条件下，选择归一化面积大于0.5％的色谱峰作为指纹峰，共选择了22个指纹峰，见图2；对22个指纹峰采用阴性样品对照，进行峰归属分析，得峰2、5、6、7、8、10、11、13、14、15、21为来源黄芪的色谱峰，峰1、3、4为来源防风的色谱峰，峰16、17、18、19、22为来源麸炒白术的色谱峰，见图3-5；以对照品溶液结合随行对照的方式，鉴定了其中10个主要指纹峰，分别为升麻素苷(1)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(2)、升麻素(3)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(4)、芒柄花苷(7)、毛蕊异黄酮(10)、槲皮素(11)、芒柄花素(13)、白术内酯Ⅲ(16)、白术内酯Ⅰ(17)，其中峰9和峰20存在干扰，结合纯品随行对照可能为亥茅酚苷(9)和白术内酯Ⅱ(20)。

2.5参照峰和共有峰的选择

在本系统下测定了12批自生产的玉屏风散，比较所得的色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了22个共有峰。毛蕊异黄酮在41.9min左右出峰，其与相邻峰的分离度良好，无干扰峰，在测定时比较稳定，峰面积适中，因此选作参照峰。在此色谱条件下，毛蕊异黄酮的理论塔板数不得低于140000。

2.6稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24h注入液相色谱仪，记录指纹图谱。结果表明，各主要共有指纹峰的相对保留时间无明显变化，RSD在0.01％-0.13％；相对峰面积RSD集中在0.38％-3.0％，个别峰稍大于3.0％，见表2和表3。说明样品制备液在24h内稳定。

表2样品稳定性试验结果(相对保留时间)

表3样品稳定性试验结果(相对峰面积)

2.7精密度试验

取同一份供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，分别在同一天连续进样6次进行精密度试验，记录指纹图谱。结果表明，各主要共有指纹峰的的相对保留时间无明显变化，RSD在0.01％-0.05％；相对峰面积RSD集中在0.25％-2.25％，个别峰稍大于3.0％，见表4和表5。表明仪器精密度良好。

表4样品精密度试验结果(相对保留时间)

表5样品精密度试验结果(相对峰面积)

2.8重现性试验

精密称取同一批玉屏风散粉末6份，按照2.3项方法制备供试品溶液，按照2.1项色谱条件进样分析，记录指纹图谱。结果表明，各主要共有指纹峰的的相对保留时间无明显变化，RSD在0.01％-0.27％；相对峰面积RSD集中在0.30％-2.67％，个别峰稍大于3.0％，见表6和表7。表明该方法重复性良好。

表6样品重现性试验结果(相对保留时间)

表7样品重现性试验结果(相对峰面积)

2.9对照指纹图谱的建立和相似度评价

将12批自生产的玉屏风散色谱图原始信号导入《中国药典》相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，计算生成对照指纹图谱(平均值法)；指纹图谱(S1-S12)及对照指纹图谱(RFP)对比见图7，相似度均在0.9以上，对照指纹图谱可见图8。

综上所述，本发明所述玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，较为全面的将每味中药的主要成分都进行的控制，有别于药典标准和文献评价方法，并且对每味药材的色谱指标峰做了定性鉴别和峰归属，使得质量控制更为全面和精确。

实施例2

本实施例一种玉屏风散指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备

取待测样品粉末(批号：20150120的玉屏风散，香雪制药股份有限公司自生产)1g，精密称定，加50mL甲醇回流提取2h，过滤，滤液浓缩至干后，加甲醇定容至10mL，即得；

(2)检测

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱(YMCHydrosphereC₁₈，4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-体积浓度0.05％磷酸(B)，梯度洗脱(梯度同表1)；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；检测波长230nm，检测器：紫外检测。

待测样品的指纹图谱如图9所示。

通过与对照指纹图谱(图8)比较，可知，该待测样品的指纹图谱与对照指纹谱图的相似度为0.981，可以认为该待测样品质量稳定，符合质量要求，为合格产品。

实施例3

本实施例一种玉屏风颗粒指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备

取待测样品颗粒5包(现有市售的玉屏风颗粒)，混合均匀后，碾碎过三号筛，取2g，精密称定，加50mL甲醇回流提取2h，过滤，滤液浓缩至干后，加甲醇定容至10mL，即得；

(2)检测

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱仪的条件如下：

色谱柱(YMCHydrosphereC₁₈，4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-体积浓度0.05％磷酸(B)，梯度洗脱(梯度同表1)；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；检测波长230nm，检测器：紫外检测。

待测样品的指纹图谱如图10所示。

通过与对照指纹图谱(图8)比较，可知，该待测样品的指纹图谱与对照指纹谱图的相似度不到0.5，可以认为该待测样品质量存在问题。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，得到由22个共有特征峰构成的玉屏风制剂指纹图谱，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

2.根据权利要求1所述的玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

3.根据权利要求1所述的玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的玉屏风制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长230nm。

5.一种玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取玉屏风制剂，粉碎或不粉碎后精密称定，加入甲醇回流提取1-3h，过滤，即得供试品溶液；

精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，即得，其中，

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：以乙腈为流动相A，体积浓度0.02-0.1％磷酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式。

6.根据权利要求5所述的玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱方式为：0-60min，流动相A的体积百分数由15％变化至35％；60-80min，流动相A的体积百分数由35％变化至47％；80-95min，流动相A的体积百分数由47％变化至70％；95-110min，流动相A的体积百分数由70％变化至90％。

7.根据权利要求5所述的玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述流动相B为体积浓度0.05％磷酸水溶液。

8.根据权利要求5-7任一项所述的玉屏风制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪的条件为：色谱柱为C18色谱柱；所述流动相的流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长230nm。