CN106483227B - 桃核承气汤组合物的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了桃核承气汤组合物的质量控制方法，属于中药分析领域。本发明方法包括采用高效液相色谱法建立桃核承气汤组合物指纹图谱，色谱条件为：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长210nm～250nm；流速0.9ml/ml～1.1ml/ml，柱温：25℃～35℃，检测波长210nm～250nm，理论板数按儿茶素峰计算应不低于3000,以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按如下顺序进行梯度洗脱：指纹图谱检测洗脱的梯度条件
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，具体涉及桃核承气汤组合物的质量控制方法。
背景技术
中药汤剂是临床用药的主流，但因起煎煮、携带不方便，煎煮制备的汤剂质量往往因人、因煎煮器具而存在较大差异，而经典名方临床疗效确切，因简、便、验、廉而深受广大消费者喜爱，运用现代科学技术将经典名方开发承携带方便、便于服用的中药制剂，不仅是对中医药的传承，也是更好的促进经典名方的临床应用。颗粒剂制备工艺相对简单、易于赋形，服用、携带方便，在服用形式上与传统汤剂最为一致，能较大限度的保持传统汤剂的特点，因此以汤剂形式服用的经典名方选择颗粒剂最为适宜。颗粒剂的开发应遵循“原汁原味”的原则，在现有技术条件下，首先通过研究制备明确煎煮参数的标准(基准)汤剂，对基准汤剂的关键质量属性进行研究，主要以单处方标准汤剂的固含量(干膏率)、指纹图谱、多指标成分作为质量参比，指导颗粒的研制。研究中为减少不同来源的饮片存在的质量差异对一致性研究带来影响，选择随行对照的方式，采用同一批次的饮片，煎煮至少10份标准汤剂，以其关键质量的均值作为颗粒剂制备工艺参数研制的“基准”。本发明采用指纹图谱技术，结合多波长切换技术测定多指标成分的方式对桃核承气汤标准汤剂(以下称为第一桃核承气汤组合物)、桃核承气汤标准颗粒(以下称为第二桃核承气汤组合物)的质量进行全面评价。
桃核承气汤出自汉代《伤寒论》，由该方由桃仁、大黄、甘草、桂枝、芒硝五味中药组成，主治破血下淤，逐淤泻热，现代临床常方常随症加减治疗急性盆腔炎、附件炎、急性脑出血、卵巢囊肿、子宫内异位症等症状；目前在临床上常加减治疗“瘀热互结”的上、中、下焦的病症；在日本，桃核承气汤作为汉方药在药店销售排名第六位，因此，该方具有较强的开发价值。
桃核承气汤组合物由桃仁、大黄、甘草、桂枝、芒硝五味中药组成，主治破血下淤，逐淤泻热，现代临床常方常随症加减治疗急性盆腔炎、附件炎、急性脑出血、卵巢囊肿、子宫内异位症等症状；目前在临床上常加减治疗“瘀热互结”的上、中、下焦的病症；在日本，该方作为汉方药在药店销售排名第六位，因此，该方具有较强的开发价值。为了更全面、有效的控制本中药组合物的质量控制水平，和国际接轨，让临床用药安全及疗效更加有所保证，需要对本中药组合物采用更为先进的质量控制手段。
“桃核承气汤”传统用药剂型为水煎剂，为了更好的发挥桃核承气汤的临床疗效，医药工作者对该经典方进行了大量的研究，主要是对其临床药理作用作了大量工作，对其质量研究报道较少；作为含五味中药的复方制剂，所含药味多，具有多组分、多靶标等特点，目前大部分中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，难以全面反映产品的质量状况。鉴于目前质量控制方法在全面控制产品质量上存在不足，同时桃核承气汤中由于含有酚酸类、黄酮类等理化性质差异较大成分，若针对每个指标单独建立方法测定，较繁琐。目前在桃核承气汤全面质量控制方法的研究上未见报道，在桃核承气汤组合物的质量控制的研究上未见报道，因此目前本领域亟需一种桃核承气汤组合物的质量控制的方法或设备。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，难以全面反映药味多，组分多、靶标多的桃核承气汤组合物的质量状况的缺陷，从而提供桃核承气汤组合物的质量控制方法。
为此，本发明提供如下技术方案：
桃核承气汤组合物的质量控制方法，包括采用高效液相色谱法建立桃核承气汤组合物指纹图谱，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml，柱温：25℃～35℃，
检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长210nm～250nm；
理论板数按儿茶素峰计算应不低于3000；
参照物溶液为儿茶素的50％甲醇溶液；
流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液为系统按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
所述指纹图谱包括15个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间RRT为9.839,2号峰相对保留时间RRT为17.973，3号(S)峰相对保留时间RRT为22.210，4号峰相对保留时间RRT为24.563，5号峰相对保留时间RRT为31.572，6号峰相对保留时间RRT为39.139，7号峰相对保留时间RRT为43.253，8号峰相对保留时间RRT为48.801，9号峰相对保留时间RRT为55.976，10号峰相对保留时间RRT为60.140，11号峰相对保留时间RRT为61.066，S峰相对保留时间RRT为64.647，13号峰相对保留时间RRT为67.075，14号峰相对保留时间RRT为70.368，15号峰相对保留时间RRT为71.504，其中，3号S峰是参照物的色谱峰。
桃核承气汤组合物按如下两种方法制备：
(1)按重量份计称取如下饮片：燀桃仁12g，大黄12g，炙甘草6g，桂枝6g，芒硝6g；将除芒硝外的四味饮片置于4L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，加盖，加煮沸，保持微沸至煎液490-510ml，滤除药渣，加入芒硝，煮沸，即得第一桃核承气汤组合物；或
(2)按重量份计称取如下饮片：燀桃仁1000g，大黄1000g，桂枝500g，芒硝500g，炙甘草500g；将除芒硝外的四味饮片加8倍量的水，煎煮1.5h，得滤液；芒硝加入滤液中，减压浓缩至相对密度1.05-1.15的清膏，加入麦芽糊精，干燥，混匀，加硬脂酸镁，干压制粒，制成1000g，即得第二桃核承气汤组合物。
所述桃核承气汤组合物参照物溶液和供试品溶液按如下方法制备：
(1)供试品溶液的制备：取第一桃核承气汤组合物5ml，取溶液，离心，取上清液，即得；或取第二桃核承气汤组合物1.3g，置50ml容量瓶中，加水稀释，超声溶解，放冷，再加水定容，摇匀，取溶液，离心，取上清液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取儿茶素对照品，加50％甲醇配制成100μg/ml的参照物溶液；
进样量为10μl。
还包括用高效液相色谱法
测定桃核承气汤组合物中游离蒽醌含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长为254nm；
理论板数按大黄素峰计算，应不低于3000；
对照品溶液为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的甲醇溶液；
流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相按如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
梯度洗脱程序
测定游离蒽醌含量时，供试品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，取适量离心，取上清液，即得；
或取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量离心，取上清液，即得供试品溶液；
进样量为10μl～20μl。
还包括用高效液相法测定
总蒽醌的含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长为254nm；
理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的甲醇溶液；
流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
测定总蒽醌含量时，供试品溶液按如下方法制得：取第一桃核承气汤组合物30ml或称定第二桃核承气汤组合物1.0g，加入9ml的盐酸或8％盐酸溶液30ml，溶解，摇匀；加入三氯甲烷40ml，回流，取出，冷却，萃取，除水，干燥，加入甲醇溶解，过滤，即得总蒽醌供试品溶液；
测定总蒽醌进样量为10μl。
还包括用高效液相法测定苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长为210nm～278nm；
理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液为苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的甲醇溶液；
流动相为甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
供试品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，取适量离心，取上清液，即得；或取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量离心，取上清液，即得供试品溶液；
测定苦杏仁苷的含量时的进样量为10μl。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法中的指纹图谱可全面反映出桃核承气汤质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制桃核承气汤组合物制剂产品质量的目的。
2、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所测指纹图谱进行辨认，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
3、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批本组合物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了对照指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。
4、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算本组合物相似度，经多次试验研究，通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
5、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法采用指纹图谱较全面的表征组合物的质量信息，从整体上反映产品质量，同时针对处方五味药材，采用多波长切换技术建立其中四味(除矿物药芒硝无法采用高效液相色谱仪测定外，占100％)的含量控制指标，针对君药大黄分别建立功效不同的游离蒽醌和总蒽醌的含量控制方法，其中游离蒽醌供试品制备方法简单、便捷，且测定结果准确、可靠；本发明考虑目前现有技术在控制复方中成药上往往只有一个或两个指标性成分，且缺乏指纹图谱整体表征产品质量信息，因此提出以指纹图谱结合多指标成分含量控制的方式全面的控制桃核承气汤组合物质量。
6、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法提出采用指纹图谱，结合多波长切换技术测定桃核承气汤组合物种多个指标成分。
7、本发明提供的桃核承气汤组合物的质量控制方法可以为桃核承气汤组合物提供一种较全面的质量控制方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是大黄素对照品DAD图；
图2是大黄酚对照品DAD图；
图3是大黄酸对照品DAD图；
图4是芦荟大黄素对照品DAD图；
图5是大黄素甲醚对照品DAD图；
图6芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚混合对照品色谱图；
图7游离蒽醌供试品溶液色谱图
图8总蒽醌供试品溶液色谱图
图9苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸混合对照品溶液色谱图
图10苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸供试品溶液色谱图
图11指纹图谱测定中的儿茶素参照物溶液色谱图
图12指纹图谱测定中的对照指纹图谱
图13连续四批样品指纹图谱对比色谱图
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明试药及仪器：
试药：
芦荟大黄素对照品(批号：110795-201007，中国药品生物制品检定研究院)、大黄酸对照品(批号：110757-200206，中国药品生物制品检定研究院)、大黄素对照品(批号：110756-200110，中国药品生物制品检定研究院)、大黄酚对照品(批号：201118，中国药品生物制品检定研究院)、大黄素甲醚对照品(批号：110758-201013，中国药品生物制品检定研究院)；苦杏仁苷对照品(批号：110820-201004，中国药品生物制品检定研究院)、肉桂酸对照品(批号：200503，中国药品生物制品检定研究院)、甘草酸对照品(批号：110731-201116，中国药品生物制品检定研究院)；甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)、乙睛(FisherScientific，色谱纯)、石英砂(分析纯，粒度范围10～40目)，桃核承气汤组合物(试验室自制)。试剂为分析纯，水为超纯水。
仪器：
Waters e2695高效液相色谱仪(2998DAD检测器)；Agilent 1260高效液相色谱仪(1290DAD检测器)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪；摇床innova 4000。
实施例1：桃核承气汤组合物的制备
第一桃核承气汤组合物：按重量份计称取如下饮片燀桃仁12g，大黄12g，炙甘草6g，桂枝6g，芒硝6g；四味饮片(除芒硝外)置于4L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，加盖，以sogo加热板为加热装置，煮沸(约25min)，保持微沸(约85分钟，蒸发量约10g/min)至煎液约500ml，采用两层医用纱布滤除药渣，加入芒硝，煮沸，即得。
第二桃核承气汤组合物：按重量份计称取如下饮片燀桃仁1000g，大黄1000g，桂枝500g，芒硝500g，炙甘草500g；四味饮片(除芒硝外)，加8倍量的水，煎煮1.5h，得滤液；芒硝加入滤液中，减压浓缩至相对密度为1.05-1.15(优选为1.10)清膏(60℃～70℃)，加入适量麦芽糊精，干燥，混匀，加适量硬脂酸镁，干压制粒，制成1000g，即得。第二桃核承气汤组合物第二桃核承气汤组合物采用聚酯镀铝/聚乙烯复合膜，包装规格为4.0g/袋。
实施例2.HPLC法测定桃核承气汤组合物中游离蒽醌含量
(1)色谱条件及系统适用性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，流速：1.0ml/min，柱温：30℃。
梯度洗脱程序
(2)对照品溶液的制备
精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg)。
(3)供试品溶液的制备
第一桃核承气汤组合物供试品溶液制备：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，取适量离心，取上清液，即得；
第二桃核承气汤组合物供试品溶液制备：取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量离心，取上清液，即得供试品溶液。
(4)检测波长的选择
取大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚的在线DAD图谱观察(见下图1-5)，五者的吸收曲线较一致，参照《中国药典》2010年版第一部收载的大黄的含量测定所使用的检测波长，将大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚的检测波长定为254nm。
(5)测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(见图6-7)
(6)标准曲线的制备
精密称取五个对照品，分别配制成芦荟大黄素配制成浓度为64.719、32.360、16.180、8.090、0.809、0.404和0.202μg/ml的对照品溶液；大黄酸配制成浓度为188.559、94.280、47.14、23.570、2.357、1.178和0.589μg/ml的对照品溶液；大黄素配制成浓度为66.340、33.170、16.585、8.293、0.829、0.415和0.207μg/ml的对照品溶液；大黄酚配制成浓度为104.435、52.218、26.109、13.054、1.305、0.653和0.326μg/ml的对照品溶液；大黄素甲醚配制成浓度为39.042、19.521、9.760、4.880、0.488、0.244和0.122μg/ml的对照品溶液；分别进样10μl，测定，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以浓度对平均峰面积进行回归分析，绘制标准曲线。分别进样10μl，测定，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以浓度对平均峰面积进行回归分析，绘制标准曲线。芦荟大黄素的线性回归方程为：A＝1.1833C+0.0954，r＝1.0000，在浓度为0.202～64.719μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄酸的线性回归方程为：A＝1.0031C+0.2059，r＝1.0000，在浓度为0.589～188.559μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄素的线性回归方程为：A＝0.8559C+0.0607，r＝1.0000，在浓度为0.207～66.340μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄酚的线性回归方程为：A＝1.2195C+0.1586，r＝1.0000，在浓度为0.326～104.435μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄素甲醚的线性回归方程为：A＝0.8734C+0.0341，r＝1.0000，在浓度为0.122～39.042μg·ml-1的范围内，线性关系良好。本品所用供试品溶液与对照品溶液的浓度均在此范围内。
(7)方法学考察及样品测定
该测定方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，样品在48h的稳定性良好，游离蒽醌五个指标RSD值依次分别为：0.2％，0.4％，0.3％，0.7％，0.9％；重复性测定结果五个指标RSD值分别为0.5％，0.7％，0.6％，0.8％，1.5％；五个指标平均加样回收率分别为：芦荟大黄素99.1％(n＝9)，RSD％为1.3％；大黄酸99.3％(n＝9)，RSD％为1.3％；大黄素100.3％(n＝9)，RSD％为1.0％；大黄酚99.9％(n＝9)，RSD％为1.3％，大黄素甲醚100.3％(n＝9)，RSD％为2.6％。表明方法准确度高，重复性良好。用本方法测定10批次第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物的游离蒽醌含量，结果如下：
表1 10批第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物游离蒽醌含量结果
(8)第一桃核承气汤组合物要求每份煎煮液、第二桃核承气汤组合物要求每4g含量，两者游离蒽醌均不得少于1.4mg。
实施例3.HPLC法测定桃核承气汤组合物中总蒽醌含量
(1)色谱条件及系统适用性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，流速：0.8ml/min，柱温：30℃。
梯度洗脱程序
(2)对照品溶液的制备
精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg)。
(3)供试品溶液的制备
第一桃核承气汤组合物供试品溶液制备：取第一桃核承气汤组合物30ml置于250ml平底烧瓶中，加入9ml的盐酸或8％盐酸溶液30ml，超声溶解，摇匀；加入三氯甲烷40ml，95℃回流1h(注意回流时加入少量石英砂)，取出，冷却，用三氯甲烷机械振摇萃取三次，每次30ml，合并三氯甲烷，无水硫酸钠除水，水浴挥干，精密加入25ml甲醇，溶解；取适量过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
第二桃核承气汤组合物供试品溶液制备：取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，加入8％盐酸溶液30ml，超声溶解，摇匀；加入三氯甲烷40ml，95℃回流1h(注意回流时加入少量石英砂)，取出，冷却，用三氯甲烷机械振摇萃取三次，每次30ml，合并三氯甲烷，无水硫酸钠除水，水浴挥干，精密加入25ml甲醇，溶解；取适量过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
(4)测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(见图8)
(5)标准曲线的制备
精密移取对照品储备液，稀释，芦荟大黄素配制成浓度为81.438、40.719、20.360、10.180、1.018、0.509、0.254和0.127μg/ml的对照品溶液；大黄酸配制成浓度为236.176、118.088、59.044、29.522、2.952、1.476、0.738和0.369μg/ml的对照品溶液；大黄素配制成浓度为86.320、43.160、21.580、10.790、1.079、0.540、0.270和0.135μg/ml的对照品溶液；大黄酚配制成浓度为133.270、66.635、33.318、16.659、1.666、0.833、0.416和0.208μg/ml的对照品溶液；大黄素甲醚配制成浓度为51.297、25.649、12.824、6.412、0.641、0.321、0.160和0.080μg/ml的对照品溶液。分别进样10μl，测定，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以浓度对平均峰面积进行回归分析，绘制标准曲线。芦荟大黄素的线性回归方程为：A＝1.1834C+0.0952，r＝1.0000，在浓度为0.127～81.438μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄酸的线性回归方程为：A＝1.0028C+0.1861，r＝1.0000，在浓度为0.369～236.176μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄素的线性回归方程为：A＝0.8558C+0.0689，r＝1.0000，在浓度为0.135～86.320μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄酚的线性回归方程为：A＝1.2195C+0.1801，r＝1.0000，在浓度为0.208～133.270μg·ml-1的范围内，线性关系良好，大黄素甲醚的线性回归方程为：A＝0.8734C+0.0360，r＝1.0000，在浓度为0.080～51.297μg·ml-1的范围内，线性关系良好，本品总蒽醌所用对照品、样品的进样浓度均在此范围内。
(6)方法学考察及样品测定
该测定方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，样品在40h的稳定性良好，总蒽醌五个指标RSD值依次分别为：0.4％，0.4％，0.3％，0.3％，0.6％；重复性测定结果五个指标RSD值分别为1.0％，1.3％，1.1％，1.8％，1.5％；五个指标平均加样回收率分别为：芦荟大黄素99.4％(n＝9)，RSD％为2.4％；大黄酸99.5％(n＝9)，RSD％为2.8％；大黄素99.4％(n＝9)，RSD％为2.5％；大黄酚98.2％(n＝9)，RSD％为2.4％，大黄素甲醚98.0％(n＝9)，RSD％为3.1％。该方法准确度高，重复性良好。用本方法测定10批次第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物的总蒽醌含量，结果如下：
表210批第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物总蒽醌含量结果
(7)第一桃核承气汤组合物要求每份煎煮液、第二桃核承气汤组合物要求每4g含量，两者总蒽醌均不得少于6.7mg。
实施例4.HPLC法测定桃核承气汤组合物中苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸含量
(1)色谱条件及系统适用性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，0.1％磷酸为流动相C，按下表进行梯度洗脱，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于3000。
梯度洗脱程序
检测波长表
(2)对照品溶液的制备
取肉桂酸、苦杏仁苷、甘草酸铵适量，用50％甲醇制备成每ml含苦杏仁苷120μg，肉桂酸10μg，甘草酸铵80μg的混合对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备
第一桃核承气汤组合物供试品溶液制备：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，取适量12000r/min离心10min，取上清液，即得供试品溶液。
第二桃核承气汤组合物供试品溶液制备：取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量12000r/min离心10min，取上清液，即得供试品溶液。
(4)测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。(见图9-10)
(5)标准曲线的制备
按照对照品溶液制备方法，取苦杏仁苷对照品，配制成浓度为6.400、12.800、25.601、51.202、102.404、204.808、409.615和819.230μg/ml的对照品溶液；肉桂酸配制成浓度为1.156、2.311、4.623、9.245、18.490、36.980、73.960和147.920μg/ml的对照品溶液；甘草酸配制成浓度为1.855、3.710、7.420、14.840、29.680、59.361、118.721和237.443μg/ml的对照品溶液。分别进样10μl，测定，记录色谱图。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，以浓度对平均峰面积进行回归分析，绘制标准曲线。苦杏仁苷线性回归方程为：A＝0.1108C+0.1385，r＝1.0000，线性关系良好；肉桂酸线性回归方程为：A＝0.9656C+0.0812，r＝1.0000，线性关系良好；甘草酸线性回归方程为：A＝0.1032C+0.0224，r＝1.0000，线性关系良好。根据标准曲线，苦杏仁苷浓度的线性范围为6.400～819.230μg·ml-1，肉桂酸浓度的线性范围为1.156～147.920μg·ml-1，甘草酸浓度的线性范围为1.855～237.443μg·ml-1，本品对照品与供试品溶液浓度均在此范围内。
(6)方法学考察及样品测定
该测定方法经过方法学验证，阴性样品对测定结果无干扰，样品在40h的稳定性良好，三个指标RSD值依次分别为：0.2％，0.5％，0.3％；重复性测定结果五个指标RSD值分别为0.9％，0.6％，1.0％；三个指标平均加样回收率分别为：苦杏仁苷96.8％(n＝9)，RSD％为1.3％；肉桂酸97.7％(n＝9)，RSD％为1.1％；甘草酸100.1％(n＝9)，RSD％为0.9％。该方法准确度高，重复性良好。用本方法测定10批次第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物的三个指标的含量，结果如下：
表3 10批第一桃核承气汤组合物与连续四批次第二桃核承气汤组合物三个指标含量结果
(7)第一桃核承气汤组合物要求每份煎煮液、第二桃核承气汤组合物要求每4g含量，两者苦杏仁苷均不得少于34.7mg，肉桂酸均不得少于1.5mg，甘草酸均不得少于7.7mg。
实施例5.HPLC法建立桃核承气汤组合物的指纹图谱的检测方法
(1)色谱条件及系统适应性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速1.0ml/ml，柱温：30℃，检测波长230nm。理论板数按儿茶素峰计算应不低于5000。
指纹图谱流动相梯度程序
(2)参照物溶液的制备
取儿茶素对照品适量，加50％甲醇配制成100μg/ml的参照物溶液，即得。(见图11)
(3)供试品溶液的制备
取第一桃核承气汤组合物5ml，12000r/min离心10min，取上清液，即得；或取第二桃核承气汤组合物1.3g，置50ml容量瓶中，加水稀释，超声溶解，放冷，再加水定容，摇匀，取溶液，12000r/min离心10min，取上清液，即得
(4)测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
(5)桃核承气汤组合物对照指纹图谱的确定及相似度分析
采用同一批次饮片，制备第一桃核承气汤组合物10份，分别第一桃核承气汤组合物供试品溶液，按指纹图谱测定法测定，记录图谱。通过分析，确定其共有特征峰为15个(见附图12)，所述的15个共有特征峰的相对保留时间偏差RSD均小于2％，即：
1号峰相对保留时间RRT为9.839，RSD％为1.39％；
2号峰相对保留时间RRT为17.973，RSD％为0.07％；
3号(S)峰相对保留时间RRT为22.210，RSD％为0.04％；
4号峰相对保留时间RRT为24.563，RSD％为0.05％；
5号峰相对保留时间RRT为31.572，RSD％为0.04％；
6号峰相对保留时间RRT为39.139，RSD％为0.03％；
7号峰相对保留时间RRT为43.253，RSD％为0.02％；
8号峰相对保留时间RRT为48.801，RSD％为0.02％；
9号峰相对保留时间RRT为55.976，RSD％为0.02％；
10号峰相对保留时间RRT为60.140，RSD％为0.01％；
11号峰相对保留时间RRT为61.066，RSD％为0.01％；
12(S)峰相对保留时间RRT为64.647，RSD％为0.01％；
13号峰相对保留时间RRT为67.075，RSD％为0.01％；
14号峰相对保留时间RRT为70.368，RSD％为0.01％；
15号峰相对保留时间RRT为71.504。其中，3号S峰是参照物的色谱峰。
运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)处理图谱，以160512-1作为参照图谱，得到第一桃核承气汤组合物对照指纹图谱。采用夹角余弦法计算样品相似度，结果表明，煎煮的10份第一桃核承气汤组合物相似度在0.934～1.000之间，相似度较高。
表4 10份第一桃核承气汤组合物相似度评价结果
取第一桃核承气汤组合物所对应的饮片，制备连续三批次第二桃核承气汤组合物样品，按指纹图谱测定方法测定，记录色谱图(见附图13)，以第一桃核承气汤组合物生成的对照指纹图谱作为随行对照图谱，计算4批次第二桃核承气汤组合物的相似度。结果见下表。
第二桃核承气汤组合物相似度计算结果
(6)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，以mark峰计，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.桃核承气汤组合物的质量控制方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱法建立桃核承气汤组合物指纹图谱，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml，柱温：25℃～35℃，
检测仪器采用紫外检测器，检测波长210nm～250nm；
理论板数按儿茶素峰计算应不低于3000；
参照物溶液为儿茶素的50％甲醇溶液；
流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液为系统按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
还包括用高效液相色谱法测定桃核承气汤组合物中游离蒽醌含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，检测波长为254nm；
理论板数按大黄素峰计算，应不低于3000；
对照品溶液为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的甲醇溶液；
流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相按如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
还包括用高效液相法测定总蒽醌的含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，检测波长为254nm；
理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的甲醇溶液；
流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述指纹图谱包括15个共有峰：各峰的相对保留时间分别为：1号峰相对保留时间RRT为9.839,2号峰相对保留时间RRT为17.973，3号(S)峰相对保留时间RRT为22.210，4号峰相对保留时间RRT为24.563，5号峰相对保留时间RRT为31.572，6号峰相对保留时间RRT为39.139，7号峰相对保留时间RRT为43.253，8号峰相对保留时间RRT为48.801，9号峰相对保留时间RRT为55.976，10号峰相对保留时间RRT为60.140，11号峰相对保留时间RRT为61.066，S峰相对保留时间RRT为64.647，13号峰相对保留时间RRT为67.075，14号峰相对保留时间RRT为70.368，15号峰相对保留时间RRT为71.504，其中，3号S峰是参照物的色谱峰。
3.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，桃核承气汤组合物按如下两种方法制备：
(1)按重量份计称取如下饮片：燀桃仁12g，大黄12g，炙甘草6g，桂枝6g，芒硝6g；将除芒硝外的四味饮片置于4L砂锅中，加1400ml水，浸泡30分钟，加盖，加煮沸，保持微沸至煎液490-510ml，滤除药渣，加入芒硝，煮沸，即得第一桃核承气汤组合物；或
(2)按重量份计称取如下饮片：燀桃仁1000g，大黄1000g，桂枝500g，芒硝500g，炙甘草500g；将除芒硝外的四味饮片加8倍量的水，煎煮1.5h，得滤液；芒硝加入滤液中，减压浓缩至相对密度为1.05-1.15的清膏，加入麦芽糊精，干燥，混匀，加硬脂酸镁，干压制粒，制成1000g，即得第二桃核承气汤组合物。
4.根据权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于，所述桃核承气汤组合物参照物溶液和供试品溶液按如下方法制备：
(1)供试品溶液的制备：取第一桃核承气汤组合物5ml，离心，取上清液，即得；或取第二桃核承气汤组合物1.3g，置50ml容量瓶中，加水稀释，超声溶解，放冷，再加水定容，摇匀，取溶液，离心，取上清液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取儿茶素对照品，加50％甲醇配制成100μg/ml的参照物溶液；
进样量为10μl。
5.根据权利要求4所述的质量控制方法，其特征在于，测定游离蒽醌含量时，
供试品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，取适量离心，取上清液，即
即得；
或取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量离心，取上清液，即得供试品溶液；
进样量为10μl～20μl。
6.根据权利要求5所述的质量控制方法，其特征在于，测定总蒽醌含量时，
供试品溶液按如下方法制得：取第一桃核承气汤组合物30ml或称定第二桃核承气汤组合物1.0g，加入9ml的盐酸或8％盐酸溶液30ml，溶解，摇匀；加入三氯甲烷40ml，回流，取出，冷却，萃取，除水，干燥，加入甲醇溶解，过滤，即得总蒽醌供试品溶液；
测定总蒽醌进样量为10μl。
7.根据权利要求6所述的质量控制方法，其特征在于，还包括用高效液相法测定苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的含量，色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流速0.9ml/ml～1.1ml/ml；柱温：25℃～35℃；
检测仪器采用紫外检测器，检测波长为210nm～278nm；
理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液为苦杏仁苷、肉桂酸、甘草酸的甲醇溶液；
流动相为甲醇-乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相按照如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
8.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于，供试品溶液按如下方法制得：精密量取第一桃核承气汤组合物5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，取适量离心，取上清液，即得；或取第二桃核承气汤组合物1.0g，精密称定，置于100ml量瓶中，加50％甲醇超声溶解并定容至刻度，取适量离心，取上清液，即得供试品溶液；
测定苦杏仁苷的含量时的进样量为10μl。
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| HPLC法测定不同产地桃仁中苦杏仁苷的含量;叶晶晶;《中华中医药学刊》;20110131;第29卷(第1期);第206-207页 |
| 桃核承气汤中桃仁不同配伍对苦杏仁苷含量的影响;黄家卫等;《浙江中医药大学学报》;20120430;第36卷(第4期);第422-424页 |
| 桃核承气汤中桃仁单煎与桃仁甘草合煎的苦杏仁苷含量变化研究;吴巧凤等;《浙江中医药大学学报》;20090930;第33卷(第5期);第738-740页 |
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| CN106483227A (zh) | 2017-03-08 |
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