CN116808147A - 一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物及其质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物及其质量检测方法，其由黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、车前子组成。本发明根据糖尿病肾病的发病特点以及中医药辨证论治的原则，通过大量实验筛选出最佳的原料组成和用量份数比，组配得到的中药复方可显著减轻糖尿病肾病患者蛋白尿和肾功能减退，并可改善其神疲倦怠、腰酸身痛和尿少浮肿等临床症状，显著提高了治疗糖尿病肾病的临床疗效。通过采用薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法进行定量检测，全面客观的对方中黄芪、赤芍、酒萸肉等药材成分含量进行检测和分析，且方法学检测表明，本发明提供的高效液相色谱法，精密度高、重复性和稳定性好。

Description

一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物及其质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体为一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物及其质量检测方法。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，同时也是引起终末期肾脏病的重要病因。临床上主要以持续存在的白蛋白尿和(或)肾小球滤过率进行性下降为特征。糖尿病肾病致病机制复杂，目前普遍认为氧化应激、炎症和自噬是其主要的发病机制。现代医学针对糖尿病肾病的干预药物远期疗效存在明显的局限性，并且有诸多不良反应，而目前仍然无治疗糖尿病肾病的理想方案，糖尿病肾病的治疗依然是亟待攻克的一个重点和难点。现代诸多研究证实中医药治疗糖尿病肾病有确切的临床疗效和特色优势。这一现状使我们将研究的方向锁定在中医药治疗的进一步探索上，希望能找到突破性的治疗方法。
芪苓护肾颗粒来源于江苏省中医院内分泌科安晓飞教授的经验方芪苓护肾方，该方由黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、盐车前子十味中药材组成，其中黄芪、茯苓为君药，有利水渗湿、化瘀通络、补脾益肾等功效，临床上主要用于治疗2型糖尿病肾脏病。
芪苓护肾颗粒成分复杂且含量差异较大，需借助快速、高效的分析手段来分析其中的活性成分，建立质量标准，从而保证临床有效性与安全性。目前关于芪苓护肾颗粒的质量检测方法不多，本发明建立其薄层鉴别和高效液相鉴别方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物及其质量检测方法。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，其特征在于，它由黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、盐车前子组成。
作为优选方案，以上所述的一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，它由黄芪20～60份、茯苓20～60份、赤芍10～30份、牛膝10～30份、山药15～45份、酒萸肉10～30份、白茅根20～60份、金银花10～30份、丝瓜络10～30份、盐车前子10～30份组成。
作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，它由它由黄芪20份、茯苓20份、赤芍10份、牛膝10份、山药15份、酒萸肉10份、白茅根20份、金银花10份、丝瓜络10份、盐车前子10份组成。
本发明所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量份数取黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、车前子，加水煎煮提取，合并煎煮提取液，滤过，得滤液，取滤液减压浓缩，然后采用直管式高速离心机离心，得离心后溶液；
(2)取糊精适量，置流化床中，当物料温度上升，开始进离心后溶液，进液速度控制在80～150r/min，喷雾干燥既得。
所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，它包括薄层色谱定性鉴别和和高效液相定量检测。
所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，它包括薄层色谱定性鉴别和和高效液相定量检测。
作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，所述的薄层色谱定性检测包括以下步骤：
(1)黄芪薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺黄芩药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用水饱和的正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，氨试液洗涤，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇溶解，分别制得中药复方组合物供试品溶液和黄芪阴性对照溶液；
2)取黄芪对照药材，加甲醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，氨试液洗涤，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为黄芪对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(2)酒萸肉的薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺酒萸肉药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为中药复方组合物供试品溶液和酒萸肉阴性对照溶液；
2)另取酒萸肉对照药材，加甲醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为酒萸肉对照药材溶液。
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，置用展开剂预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
(3)赤芍的薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺赤芍药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为中药复方组合物供试品溶液和赤芍阴性对照溶液；
2)另取赤芍对照药材，加乙醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解，作为赤芍对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点，阴性未见干扰。
作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，
步骤(1)黄芪薄层色谱鉴别，以体积比为4：1：5的正丁醇-乙酸乙酯-稀氨的上层溶液为展开剂；
步骤(2)酒萸肉薄层色谱鉴别，以体积比为3：1三氯甲烷-甲醇为展开剂；
步骤(3)赤芍薄层色谱鉴别，以体积比为40：5：10：0.2二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂。
作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，所述的高效液相定量检测包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
精密称取中药复方组合物的颗粒剂，加入甲醇，超声处理，取上清液过滤膜，得到供试品溶液。
(2)混合对照品溶液的制备
精密量取没食子酸、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花苷、异绿原酸B、异绿原酸C、胞嘧啶、木犀草苷、隐绿原酸、5-羟甲基糠醛适量，使用50％甲醇溶液定容至刻度作为混合标准品溶液。
(3)标准曲线的建立
取步骤(2)混合对照品溶液，加50％甲醇依次稀释得到5个不同浓度的混合对照品溶液，然后注入UPLC，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线方程，得胞嘧啶的回归方程为Y＝6335407.03X-6860.72，r＝1.0000；没食子酸的回归方程为Y＝2756224.81X+
14176.32，r＝1.0000；5HMF的回归方程为Y＝12557966.94X-396772.56，r＝1.0000；莫诺苷的回归方程为Y＝1717418.53X-45423.51，r＝1.0000；隐绿原酸的回归方程为Y＝
2242275.90X-17049.76，r＝1.0000；马钱苷的回归方程为Y＝1627939.07X-18981.93，r＝1.0000；芍药苷的回归方程为Y＝1208047.40X-83475.69，r＝1.0000；木犀草苷的回归方程为Y＝667562X-1633，0.9999；异绿原酸B的回归方程为Y＝3208652.06X-8607.08，r＝1.0000；异绿原酸C的回归方程为Y＝3524658.72X-17073.00，r＝1.0000；刺芒柄花苷的回归方程为Y＝6118318.87X-3683.12，1.0000；毛蕊异黄酮的回归方程为Y＝7745640.51X-5500.44，r＝1.0000。
(4)含量测定
分别精密吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液注入液相色谱仪，将峰面积代入步骤(3)的标准曲线方程，计算供试品中没食子酸、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花苷、异绿原酸B、异绿原酸C、胞嘧啶、木犀草苷、隐绿原酸、5-羟甲基糠醛的含量。
作为优选方案，以上所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，步骤(3)和(4)的色谱条件为：
以C18，规格4.6×250mm，5μm为色谱柱，流动相为：0.1％磷酸的水A相-乙腈为B相，梯度洗脱；检测波长：200～600nm范围内全波长扫描；柱温30℃±5℃；流速为1mL min-1；进样量为2μL；所述的梯度洗脱程序为：
时间/min A/％ B/％
0 95 5
30 90 10
35 88 12
45 87 13
50 80 20
70 70 30
。
本发明的有益效果是：
1.本发明中依据与糖尿病肾病的发病特点及中医药辨证论治的原则，方中黄芪补气利水，茯苓利水渗湿，为君药；赤芍活血化瘀，牛膝补肾活血，为臣药；山药补脾益肾，山萸肉补益肝肾，白茅根凉血利尿，三者为佐药；金银花清热解毒，丝瓜络通络活血，车前子利尿通淋，同为使药。通过大量实验筛选出最佳的原料组成和用量份数比，组配得到的中药复方可显著减轻糖尿病肾病患者蛋白尿和肾功能减退，并可改善其神疲倦怠、腰酸身痛和尿少浮肿等临床症状。
2.本发明通过大量实验筛选检测方法，通过采用薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法进行定量检测，可全面客观的对方中活性成分含量进行检测和分析，并且方法学检测表明，本发明提供的高效液相色谱法，精密度高、重复性和稳定性好。
附图说明
图1为本发明黄芪的薄层鉴别示意图；
图2为本发明不同点样量(2μL,4μL,6μL,10μL)芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图3为本发明正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(4：1：5)下芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图4为本发明正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(5：1：5)下芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图5为本发明正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(6：1：5)下芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图6为本发明批号为G20210413薄层板的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图7为本发明批号为G20200427薄层板的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图8为本发明湿度22％下的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图9为本发明湿度77％下的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图10为本发明温度10℃的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图11为本发明温度30℃的芪苓护肾颗粒黄芪薄层鉴别示意图；
图12为本发明酒萸肉的薄层鉴别示意图；
图13为本发明不同点样量(2μL,4μL,6μL,10μL)芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图14为本发明三氯甲烷：甲醇(3：1)下芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图15为本发明三氯甲烷：甲醇(4：1)下芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图16为本发明三氯甲烷：甲醇(5：1)下芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图17为本发明批号为G20210413薄层板的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图18为本发明批号为G20200427薄层板的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图19为本发明湿度20％下的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图20为本发明湿度75％下的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图21为本发明温度17℃的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图22为本发明温度27℃的芪苓护肾颗粒酒萸肉薄层鉴别示意图；
图23为本发明赤芍的薄层鉴别示意图；
图24为本发明不同点样量(2μL,4μL,6μL,10μL)芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图25为本发明二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)下芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图26为本发明二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(41：5：10：0.2)下芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图27为本发明二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(42：5：10：0.2)下芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图28为本发明批号为G20210413薄层板的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图29为本发明批号为G20200427薄层板的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图30为本发明湿度75％下的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图31为本发明湿度20％下的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图32为本发明温度23℃的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图33为本发明温度29℃的芪苓护肾颗粒赤芍薄层鉴别示意图；
图34为本发明芪苓护肾颗粒供试品溶液色谱示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
芪苓护肾颗粒剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)按处方比例取黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、盐车前子，加水煎煮提取两次，第一次加总药材重量12倍量的水，先浸泡30min，再煎煮提取45min，滤过；第二次加12倍量水，煎煮提取45min，滤过。滤液减压浓缩至相对密度约1.20(60℃)，直管式高速离心机离心(转速：16000r/min，流量：4～6L/min)，取离心后的上清液。
(2)取糊精适量，置流化床中，设置进风温度为100℃，当物料温度升至70℃时，开始进步骤(1)离心后的上清液，进液速度控制在80～150r/min，雾化压力外0.2MPa，内0.15MPa。喷雾结束，70℃继续干燥1小时，制得颗粒剂。
实施例2
芪苓护肾颗粒的薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
(1)黄芪的薄层鉴别
1)取实施例1制备得到的芪苓护肾颗粒12g，加水40ml，超声30分钟使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
取黄芪的阴性对照颗粒同法制备得到黄芪阴性对照溶液。
2)另取黄芪对照药材0.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为黄芪对照药材溶液。
3)照薄层色谱法(《中国药典》2020版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨(5-50)(4：1：5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
4)黄芪薄层方法耐用性检测
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样2μL,4μL,6μL,10μL下，芪苓护肾颗粒黄芪的薄层鉴别方法的可行性。结果显示，点样10μL，鉴别点更加清晰，见图2中的5、6、7、8为黄芪对照药材，1、2、3、4为供试品；
不同比例展开剂：采用正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(4：1：5)为展开剂展开，为了近一步优化，在试验中尝试考察正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(5：1：5)和正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(6：1：5)，结果如图3-5，正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(5：1：5)的展开效果更好，图中1、2、3为不同批次供试品，4为黄芪对照药材，5为阴性对照。
不同批号薄层板：分别采用批号G20210413和批号G20200427薄层板进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，对薄层板无要求，见图6、图7，图6、图7中的5为黄芪对照药材，1、2、3为不同批次供试品，4为阴性对照；
不同湿度：分别检测湿度22％和77％下，芪苓护肾颗粒中黄芪的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，结果显示，湿度22％，鉴别点更加清晰见图8、图9，其中的4为黄芪对照药材，1、2、3为不同批次供试品，5为阴性对照。
不同温度：分别检测10℃和30℃下，采用上述方法进行黄芪薄层鉴别的展开为情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下芪苓护肾颗粒黄芪的薄层鉴别，见图10、图11，其中图中的4为黄芪对照药材。1、2、3为不同批次供试品，5为阴性对照；
步骤(2)对酒萸肉薄层色谱鉴别
1)取芪苓护肾颗粒12g，加水40ml，使溶解，用正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
取酒萸肉的阴性对照颗粒同法制备得到酒萸肉阴性对照溶液。
2)另取酒萸肉对照药材0.5g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为酒萸肉对照药材溶液。
3)照薄层色谱法(《中国药典》2020版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(3：1)为展开剂，置用展开剂预饱和15分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
4)酒萸肉薄层方法耐用性检测
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样2μL,4μL,6μL,10μL下芪苓护肾颗粒酒萸肉的薄层鉴别方法的可行性。结果显示，点样6μL，鉴别点更加清晰，见图13，其中图中的1、2、3、4为酒萸肉对照药材，5、6、7、8为不同批次供试品；
不同比例展开剂：采用三氯甲烷：甲醇(4：1)为展开剂展开，为了近一步优化，在试验中尝试考察三氯甲烷：甲醇(3：1)和三氯甲烷：甲醇(5：1)，结果如图14-16，结果无明显差异，图中1、2、3为不同批次供试品，4为酒萸肉对照药材，5为阴性对照。
不同批号薄层板：分别采用批号G20210413和批号G2020042进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，见图17、图18，其中图中的4为酒萸肉对照药材，1、2、3为不同批次供试品。
不同湿度：分别检测湿度20％和75％下，芪苓护肾颗粒中酒萸肉的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下酒萸肉的薄层鉴别，见图19、图20，图中的4为酒萸肉对照药材，1、2、3为不同批次供试品，5为阴性对照；
不同温度：分别检测17℃和27℃下，采用上述方法进行酒萸肉薄层鉴别的展开。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下芪苓护肾颗粒酒萸肉的薄层鉴别，见图21、图22，其中图中的1、2、3为不同批次供试品，4为酒萸肉对照药材，5阴性样品；
步骤(3)赤芍的薄层色谱鉴别
1)取芪苓护肾颗粒12g，加水40ml，使溶解，用正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
取赤芍的阴性对照颗粒同法制备得到赤芍阴性对照溶液。
2)另取赤芍对照药材0.5g，加乙醇10ml，超声处理5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为赤芍对照药材溶液。
3)照薄层色谱法(《中国药典》2020版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点，阴性未见干扰。
4)赤芍薄层方法耐用性检测
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样2μL,4μL,6μL,10μL下，芪苓护肾颗粒赤芍的薄层鉴别方法的可行性。结果，点样6μL，鉴别点更加清晰，见图24，其中1、2、3、4供试品溶液，5、6、7、8赤芍对照药材溶液。
不同比例展开剂：采用二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂展开，为了近一步优化，在试验中尝试考察二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(41：5：10：0.2)和二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(42：5：10：0.2)，结果如图25-27，二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸体积比为40：5：10：0.2更好些，图中1、2、3为不同批次供试品，4为赤芍对照药材，5为阴性对照。
不同批号薄层板：分别采用批号G20210413和批号G2020042进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，见图28、图29，其中图中的4为赤芍对照药材，1、2、3为不同批次供试品。
不同湿度：分别检测湿度35％和56％下，芪苓护肾颗粒赤芍的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下赤芍的薄层鉴别，见图30、31，其中的1、2、3为三批供试品，3为赤芍对照药材5为阴性对照；
不同温度：分别检测23℃和29℃下，采用上述方法进行赤芍薄层鉴别的展开情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下芪苓护肾颗粒中赤芍的薄层鉴别，见图32、图33，其中1，2、3为不同批次供试品，4为赤芍对照药材，5为阴性对照。
实施例3
实施例1制备得到的芪苓护肾颗粒的含量测定方法
(1)色谱条件：以C18，规格4.6×250mm，5μm为色谱柱，流动相为：0.1％磷酸的水A相-乙腈为B相，梯度洗脱；检测波长：200～600nm范围内全波长扫描；柱温30℃±5℃；流速为1mL/min；进样量为2μL；所述的梯度洗脱程序为：
表1梯度洗脱表
(2)混合对照品溶液的制备：取标准品溶液适量于10ml容量瓶中，使用50％甲醇溶液定容至刻度，制作为含没食子酸(0.0239mg ml-1)、莫诺苷(0.0480mg ml-1)、马钱苷(0.031mg ml-1)、芍药苷(0.0828mg ml-1)、毛蕊异黄酮(0.0013mg ml-1)、刺芒柄花苷(0.0010mg ml-1)、异绿原酸B(0.0068mg ml-1)、异绿原酸C(0.0110mg ml-1)、胞嘧啶(0.0036mg ml-1)、木犀草苷(0.0054mg ml-1)、隐绿原酸(0.0166mg ml-1)、5-羟甲基糠醛(0.1200mg ml-1)的混合标准品溶液。
(3)供试品溶液的制备：精密称取芪苓护肾颗粒1.00348g，加入50％甲醇25ml，于250W，40kHz超声30min，取上清液过0.22μm滤膜，得到芪苓护肾颗粒溶液(0.0401392mg/ml)。
(4)系统适应性试验
1)分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱与对照品色谱在相同的位置有较大吸收。
2)吸取(2)中混合标准品溶液，将混合标准品溶液进行逐级使用甲醇稀释2、4、8、16、32倍，最终得到6个浓度的系列混标溶液，分别进样10μl，在(1)色谱条件下进行HPLC测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线方程，得胞嘧啶的回归方程为Y＝6335407.03X-6860.72，r＝1.0000；没食子酸的回归方程为Y＝2756224.81X+14176.32，r＝1.0000；5-羟甲基糠醛的回归方程为Y＝12557966.94X-396772.56，r＝1.0000；莫诺苷的回归方程为Y＝1717418.53X-45423.51，r＝1.0000；隐绿原酸的回归方程为Y＝2242275.90X-17049.76，r＝1.0000；马钱苷的回归方程为Y＝1627939.07X-18981.93，r＝1.0000；芍药苷的回归方程为Y＝1208047.40X-83475.69，r＝1.0000；木犀草苷的回归方程为Y＝667562X-1633，0.9999；异绿原酸B的回归方程为Y＝3208652.06X-8607.08，r＝1.0000；异绿原酸C的回归方程为Y＝3524658.72X-17073.00，r＝1.0000；刺芒柄花苷的回归方程为Y＝6118318.87X-3683.12，1.0000；毛蕊异黄酮的回归方程为Y＝7745640.51X-5500.44，r＝1.0000。
(5)精密度试验：取混合对照品溶液于进样瓶中，按(1)中色谱条件连续进样n(n＝6)次，以测定各待测成分的峰面积，以待测成分相对峰面积的RSD值评价精密度。
(6)重复性试验：取芪苓护肾颗粒样品研磨成均匀细粉，平行称定6份放置于50ml容量瓶中，使用50％甲醇定容，配置成含有2.01720g、2.00949g、2.00332g、2.00110g、2.01757g、2.01071g样品的溶液，于(1)色谱条件下进样检测，记录各待测成分最大吸收波长下的峰面积，并计算RSD值用于重复性评价。
(7)稳定性试验：根据(3)制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h按相应分析条件检测供试品溶液，并且记录下色谱图像，取用每种物质最大吸收波长下的峰面积数据，计算供试品中各成分峰面积的RSD值以评价稳定性。
(8)加样回收试验：取已测定含量的样品溶液75μl共6份，分别加入50、75、100μl的混合标准品溶液，使用(1)的分析条件，得到加样回收样品中目标化合物的最大吸收波长下的峰面积数据。根据(4)中的标准曲线方程，计算得到样品中化合物的含量。与理论值进行比对，计算供试品中各成分含量的加样回收率、平均加样回收率以及RSD值，对加样回收率进行评价，如表2。
表2加样回收率试验结果(n＝6)
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(9)样品含量测定：本实验选择了芪苓护肾颗粒中的12种主要成分，即胞嘧啶、没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、隐绿原酸、马钱苷、芍药苷、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸C、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮进行了含量测定，如表3。
表3芪苓护肾颗粒中12种成分含量：
化合物 浓度(μg/g)
胞嘧啶(cytosine) 0.002676
没食子酸(gallic acid) 0.025392
5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural) 0.029537
莫诺苷(morroniside) 0.050098
隐绿原酸(Cryptochlorogenic acid) 0.128712
马钱苷(loganin) 0.033982
芍药苷(paeoniflorin) 0.109917
木犀草苷(cynaroside) 0.005116
异绿原酸B(Isochlorogenic acid B) 0.008480
异绿原酸C(Isochlorogenic acid C) 0.016024
刺芒柄花苷(Ononin) 0.001005
毛蕊异黄酮(calycosin) 0.001046
。
实施例4临床疗效观察
根据T2DKD及中医湿瘀阻络证的诊断标准，纳入来自江苏省中医院门诊和病房的患者400例，采用随机平行对照原则，最终完成研究的患者384例，其中治疗组196例，对照组188例，对照组患者予基础治疗(包括健康宣教、调整生活方式、控制血压血糖血脂等)，治疗组患者在基础治疗的同时予芪苓护肾方，每日一剂，疗程12周。观察治疗组和对照组治疗前后患者尿微量白蛋白/肌酐(UACR)、估算肾小球滤过率(eGFR)、血肌酐(SCr)、胱抑素-C(Cys-C)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(PBG2h)、糖化血红蛋白(HbAIc)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、中医症候积分的变化情况以及安全性情况，评估芪苓护肾方的临床疗效和安全性。结果显示：(1)治疗组和对照组患者治疗前在性别、年龄、病程、BMI、合并症及合并用药、尿蛋白、肾功能、血压、血糖、血脂和中医症候积分等指标方面无统计学差异(P>0.05)，两组患者具有同质性和可比性。(2)在改善尿蛋白水平方面：两组患者在经过12周治疗后，治疗组患者UACR较治疗前明显下降，具有统计学差异(P<0.05)，对照组患者UACR治疗前后无统计学差异(P>0.05)，治疗组UACR下降幅度(治疗前后差值)明显优于对照组，具有显著统计学差异(P<0.01)。亚组分层分析显示，在A2期(UACR:30-300mg/g)，两组患者UACR较治疗前均明显下降，具有统计学差异(P<0.05)，但两组UACR下降幅度比较无统计学差异(P>0.05)。在A3期(UACR:>300mg/g)，治疗组患者UACR较治疗前明显下降，具有显著统计学差异(P<0.01)，而对照组患者UACR较治疗前无统计学差异(P>0.05)，治疗组UACR下降幅度明显优于对照组，具有显著统计学差异(P<0.01)。(3)在改善肾功能方面：两组患者SCr、Cys-c和eGFR治疗前后均无统计学差异(P>0.05)，治疗后两组患者SCr、Cys-c和eGFR比较无统计学差异(P>0.05)。(4)在改善血压、糖脂代谢方面：两组患者SBP、PBG2h和HbAIc治疗后较治疗前均明显下降，具有统计学差异(P<0.05)，两组患者DBP、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C治疗前后均无统计学差异(P>0.05)；治疗后两组患者SBP、DBP、FBG、PBG2h、HbAIc、TC、TG、HDL-C和LDL-C比较均无统计学差异(P>0.05)。(5)在改善中医症候疗效方面：治疗组总有效率达93.9％，明显优于对照组(31.9％)，具有显著统计学差异(P<0.01)。中医症候单项积分比较，治疗组在改善患者疲倦乏力、面肢浮肿、脘腹胀满、腰膝酸软、小便浑浊、口干咽燥、手足心热、夜尿频多、肌肤甲错症状疗效上均优于对照组，有统计学差异(P<0.05)。(6)在安全性指标方面：治疗组和对照组患者血常规、肝功能和尿常规治疗前后无明显变化，观察期间无不良反应发生，安全性良好。

Claims (10)

1.一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，其特征在于，它由黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、车前子组成。
2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，其特征在于，它由黄芪20～60份、茯苓20～60份、赤芍10～30份、牛膝10～30份、山药15～45份、酒萸肉10～30份、白茅根20～60份、金银花10～30份、丝瓜络10～30份、盐车前子10～30份组成。
3.根据权利要求2所述的一种治疗糖尿病肾病的中药复方组合物，其特征在于，它由黄芪20份、茯苓20份、赤芍10份、牛膝10份、山药15份、酒萸肉10份、白茅根20份、金银花10份、丝瓜络10份、盐车前子10份组成。
4.权利要求1～3任一项所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按重量份数取黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、车前子，加水煎煮提取，合并煎煮提取液，滤过，得滤液，取滤液减压浓缩，然后采用直管式高速离心机离心，得离心后溶液；
(2)取糊精适量，置流化床中，当物料温度上升，开始进离心后溶液，进液速度控制在80～150r/min，喷雾干燥即得。
5.权利要求1～3任一项所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，包括薄层色谱定性检测和高效液相定量检测；
所述的薄层色谱定性检测包括以下步骤：
(1)黄芪薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺黄芩药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用水饱和的正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，氨试液洗涤，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇溶解，分别制得中药复方组合物供试品溶液和黄芪阴性对照溶液；
2)取黄芪对照药材，加甲醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，氨试液洗涤，弃去氨液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为黄芪对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(2)酒萸肉的薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺酒萸肉药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为中药复方组合物供试品溶液和酒萸肉阴性对照溶液；
2)另取酒萸肉对照药材，加甲醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为酒萸肉对照药材溶液。
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇为展开剂，置用展开剂预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
(3)赤芍的薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂和缺赤芍药材的中药复方组合物的颗粒剂，分别加水溶解，用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为中药复方组合物供试品溶液和赤芍阴性对照溶液；
2)另取赤芍对照药材，加乙醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇溶解，作为赤芍对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点，阴性未见干扰。
6.根据权利要求5所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，
步骤(1)黄芪薄层色谱鉴别，以体积比为4：1：5的正丁醇-乙酸乙酯-稀氨的上层溶液为展开剂；
步骤(2)酒萸肉薄层色谱鉴别，以体积比为3：1三氯甲烷-甲醇为展开剂；
步骤(3)赤芍薄层色谱鉴别，以体积比为40：5：10：0.2二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂。
7.根据权利要求5所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物质量检测方法，其特征在于，所述的高效液相定量检测包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
精密称取中药复方组合物，加入甲醇，超声处理，取上清液，过滤，得到供试品溶液；
(2)混合对照品溶液的制备
精密量取没食子酸、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花苷、异绿原酸B、异绿原酸C、胞嘧啶、木犀草苷、隐绿原酸、5-羟甲基糠醛适量，使用50％甲醇溶液定容至刻度作为混合标准品溶液；
(3)标准曲线的建立
取步骤(2)混合对照品溶液，加50％甲醇依次稀释得到5个不同浓度的混合对照品溶液，然后注入UPLC，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线方程，得胞嘧啶的回归方程为Y＝6335407.03X-6860.72，r＝1.0000；没食子酸的回归方程为Y＝2756224.81X+14176.32，r＝1.0000；5-羟甲基糠醛的回归方程为Y＝12557966.94X-396772.56，r＝1.0000；莫诺苷的回归方程为Y＝1717418.53X-45423.51，r＝1.0000；隐绿原酸的回归方程为Y＝2242275.90X-17049.76，r＝1.0000；马钱苷的回归方程为Y＝1627939.07X-18981.93，r＝1.0000；芍药苷的回归方程为Y＝1208047.40X-83475.69，r＝1.0000；木犀草苷的回归方程为Y＝667562X-1633，0.9999；异绿原酸B的回归方程为Y＝3208652.06X-8607.08，r＝1.0000；
异绿原酸C的回归方程为Y＝3524658.72X-17073.00，r＝1.0000；刺芒柄花苷的回归方程为Y＝6118318.87X-3683.12，1.0000；毛蕊异黄酮的回归方程为Y＝7745640.51X-5500.44，r＝1.0000；
(4)含量测定
分别精密吸取步骤(1)供试品溶液和步骤(2)对照品溶液注入液相色谱仪，将峰面积代入步骤(3)的标准曲线方程，计算供试品中没食子酸、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花苷、异绿原酸B、异绿原酸C、胞嘧啶、木犀草苷、隐绿原酸、5-羟甲基糠醛的含量。
8.根据权利要求7所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)和步骤(4)的色谱条件为：
以C18，规格4.6×250mm，5μm为色谱柱，流动相为：0.1％磷酸的水A相-乙腈为B相，梯度洗脱；检测波长：200～600nm范围内全波长扫描；柱温30℃±5℃；流速为1mLmin-1；进样量为2μL；所述的梯度洗脱程序为：
时间/min A/％ B/％ 0 95 5 30 90 10 35 88 12 45 87 13 50 80 20 70 70 30
。
9.根据权利要求7所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，
步骤(1)供试品溶液的制备方法为：
精密称取中药复方组合物黄芪、茯苓、赤芍、牛膝、山药、酒萸肉、白茅根、金银花、丝瓜络、车前子，研磨成粉，加入50％甲醇25ml，于250W，40kHz超声30min，取上清液过0.22μm滤膜，得到供试品溶液；
步骤(2)混合对照品溶液的制备方法为：
精密量取没食子酸、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、毛蕊异黄酮、刺芒柄花苷、异绿原酸B、异绿原酸C、胞嘧啶、木犀草苷、隐绿原酸、5-羟甲基糠醛对照品适量，使用50％甲醇溶液定容至刻度，制作为含没食子酸0.0239mg ml-1、莫诺苷0.0480mg ml-1、马钱苷0.031mg ml-1、芍药苷0.0828mg ml-1、毛蕊异黄酮0.0013mg ml-1、刺芒柄花苷0.0010mg ml-1、异绿原酸B0.0068mg ml-1、异绿原酸C 0.0110mg ml-1、胞嘧啶0.0036mg ml-1、木犀草苷0.0054mg ml-1、隐绿原酸0.0166mg ml-1、5-羟甲基糠醛0.1200mg ml-1的混合标准品溶液。
10.权利要求1～3任一项所述的治疗糖尿病肾病的中药复方组合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
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