CN113237972A - 具有抗痛风作用的中药组合物及其指纹图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有抗痛风作用的中药组合物及其指纹图谱的检测方法,指纹图谱检测方法为:供试品溶液的制备;步骤2、混合对照品溶液的制备:步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图;步骤4,将步骤3中具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱仪器导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,用平均值计算法生成具有抗痛风作用的中药组合物的对照指纹图谱;步骤5,将指纹图谱和混合标准品图谱进行比对,指认主要成分。本发明所提供的物指纹图谱,能全面,客观地表征具有抗痛风作用的中药组合物的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药复方的检测方法,具体涉及具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法。
背景技术
痛风是由单钠尿酸盐晶体诱发的炎症性疾病,长期嘌呤代谢活跃、嘌呤摄入过多或尿酸排泄障碍,均可导致高尿酸血症。长期高尿酸血症可引起关节及周围软组织尿酸盐晶体沉积,进而出现反复发作的急性关节和软组织炎症、痛风石沉积、慢性关节炎和关节损坏。高尿酸血症亦可累及肾脏,引起慢性间质性肾炎和尿酸盐结石形成。痛风患者早期积极降尿酸治疗,可延缓或阻止脏器损害。
目前治疗痛风的药物疗效并不明显,一般采用非甾体类消炎药或激素类药物。中医药治疗痛风具有其特有的优势,本发明通过大量实验筛选出具有治疗痛风功效的中药复方,并且建立起指纹图谱检测方法
发明内容
发明目的:本发明的目的是解决现有技术的不足,提供一种具有抗痛风作用的中药组合物及其建立起指纹图谱检测方法,该检测方法可以客观、全面、准确的评价具有抗痛风作用的中药组合物的质量,对控制具有抗痛风作用的中药组合物的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案:为了实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,它包括以下步骤:
步骤1,具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的制备:
分别精密称取不同批次的具有抗痛风作用的中药组合物样品,置于圆底瓶中,加水或乙醇溶液,连续回流提取,过滤,过0.45μm微孔滤膜,得供试品溶液;
步骤2,混合对照品溶液的制备:
精密称定秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素对照品,置于容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,制成混合对照品溶液;
步骤3,分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
步骤4,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择不同批次具有抗痛风作用的中药组合物的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成具有抗痛风作用的中药组合物的对照指纹图谱,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分;
步骤5,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物对照指纹图谱和混合对照品图谱进行比对,指认出具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱中1号峰为绿原酸、4号峰为芦丁、9号峰为栀子苷、10号峰为欧前胡素、10号峰为秋水仙碱、11号峰为葛根素。
作为优选方案,以上所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,步骤1 具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液制备方法为:取10批次的具有抗痛风作用的中药组合物样品各20g,置于圆底瓶中,分别加乙醇醇溶液300mL,连续回流提取2次,每次1小时,过滤,合并滤液置于100mL容量瓶中,加乙醇定容,过0.45μm微孔滤膜,得供试品溶液。
作为优选方案,以上所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,步骤2 混合对照品溶液的制备:取精密称定秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素对照品,置于容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,制成含0.53mg/mL秋水仙碱、0.24mg/mL 绿原酸、0.28mg/mL芦丁、0.37mg/mL栀子苷、0.35mg/mL欧前胡素和0.75mg/mL葛根素组成的混合对照品溶液。
作为优选方案,以上所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,步骤3 中,液相色谱条件为:色谱柱:YMC-Pack ODS-A,流动相:乙腈和0.1%磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,二极管阵列检测器,检测波长:254nm,柱温35℃,流速0.8mL/min,进样体积: 10μL,梯度洗脱程序如下表:
程序 | 时间(min) | 乙腈体积(%) |
1 | 0 | 5 |
2 | 10 | 10 |
3 | 25 | 20 |
4 | 40 | 25 |
5 | 50 | 30 |
6 | 60 | 55 |
7 | 75 | 40 |
。
本发明所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,指纹谱图中共有峰 14个。
作为优选方案,以上所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,具有抗痛风作用的中药组合物是由山慈菇、生薏苡仁、白术、金钱草、蒲公英、茯苓、栀子组成。
作为优选方案,以上所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,具有抗痛风作用的中药组合物由生山慈菇10份、薏苡仁20份、白术10份、金钱草 20份、蒲公英15份、茯苓15份、栀子5份制成。
指纹图谱检测条件的优化:
1、在样品溶液的制备优化方面
本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、70%乙醇水溶液、85%乙醇水溶液、95%乙醇、无水乙醇)、进行实验比较,结果发现连续回流提取所得的谱图成分比较全面,分离度良好,故采用连续回流提取的方法;对提取溶剂的考察中发现乙醇提取物色谱图信息量最多,成分含量最高;所以选用乙醇进行提取。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察,提取230nm、254nm、280nm、284nm、 300nm处的色谱图,发现检测波长为254nm时,色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳,故选254nm为检测波长;
并且对流速(1mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min)进行筛选,最终在流速为0.8mL/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。
因具有抗痛风作用的中药组合物中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分,并且还存在酸性和碱性的成分,本发明比较了甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸,乙腈-甲醇,0.1%磷酸二氢钠水溶液、乙腈和0.05%磷酸水,乙腈-0.1%磷酸水7个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1%磷酸二氢钠水溶液为流动相时,具有抗痛风作用的中药组合物中各成分,能达到很好的分离效果,故最终选定以乙腈和和0.1%磷酸二氢钠水溶液为流动相。为了实现更好发分离度,本分明继续对梯度洗脱程序进行了筛选,结果表明按以下梯度洗脱程序:
0~10min 5~10%乙腈体积;10~25min 10~20%乙腈体积;
25~40min 20~25%乙腈体积;40~50min 25~30%乙腈体积;
50~60min 30~55%乙腈体积;60~75min 55~40%乙腈体积;
采用这种梯度洗脱时,各化合物能够实现最好的分离度,且在方法学考察时,具有最好的精密度,重复性,稳定性和精密度。
有益效果:
1、本发明提供的中药组合物中具有很好的抗痛风作用,可降低患者尿酸水平。
2、本发明根据具有抗痛风作用的中药组合物中所含的活性成分的结构性质特点,含有酸性黄酮和秋水仙碱等,通过大量实验筛选出最佳的流动相组成,梯度洗脱程序、流速,检测波长、色谱柱,柱温等分析条件,经多次实验验证表明,本发明提供的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱检测方法,可以全面、客观、准确的检测和评价具有抗痛风作用的中药组合物的质量,为保证临床具有抗痛风作用的中药组合物疗效具有重要意义。
3、本发明提供的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为混合对照品色谱图。
图2为本发明具有抗痛风作用的中药组合物的对照指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、一种具有抗痛风作用的中药组合物,它由山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5克制成。
2、一种具有抗痛风作用的中药组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤,取山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5 克,加入药材总重量10倍量的乙醇,连续回流提取2次,每次2小时,合并提取液,减压浓缩,既得。
实施例2
1、实施例用到的仪器与试剂如下:
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统,包括全自动在线脱气系统,全自动进样系统Prominence SIL-20A,二极管阵列检测器SPD-M20A。
1.2药品与试剂
秋水仙碱对照品、绿原酸对照品、芦丁对照品、栀子苷对照品、欧前胡素对照品和葛根素对照品均购自国家食品药品检定研究院;乙腈(色谱纯)。
一种具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,包括以下步骤:
步骤1,具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的制备:
分别精密称取10批次的具有抗痛风作用的中药组合物样品(山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5克),置于圆底瓶中,分别加乙醇醇溶液300mL,连续回流提取2次,每次1小时,过滤,合并滤液置于100mL容量瓶中,加乙醇定容,过0.45μm微孔滤膜,得供试品溶液。
步骤2,混合对照品溶液的制备:
精密称定秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素对照品,置于容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,制成含0.53mg/mL秋水仙碱、0.24mg/mL绿原酸、0.28mg/mL 芦丁、0.37mg/mL栀子苷、0.35mg/mL欧前胡素和0.75mg/mL葛根素组成的混合对照品溶液。
步骤3,分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10微升,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
步骤4,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择不同批次具有抗痛风作用的中药组合物的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成具有抗痛风作用的中药组合物的对照指纹图谱(如图2所示),计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图(如图1)的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分;
步骤5,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物对照指纹图谱和混合对照品图谱进行比对,指认出具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱中2号峰为绿原酸、3号峰为芦丁、 6号峰为栀子苷、7号峰为欧前胡素、10号峰为秋水仙碱、11号峰为葛根素。
步骤3中,液相色谱条件为:色谱柱:YMC-Pack ODS-A,流动相:乙腈和0.1%磷酸二氢钠水溶液,梯度洗脱,二极管阵列检测器,检测波长:254nm,柱温35℃,流速0.8mL/min,进样体积:10μL,梯度洗脱程序如下表:
程序 | 时间(min) | 乙腈体积(%) |
1 | 0 | 5 |
2 | 10 | 10 |
3 | 25 | 20 |
4 | 40 | 25 |
5 | 50 | 30 |
6 | 60 | 55 |
7 | 75 | 40 |
。
实施例3指纹图谱检测方法的法学研究:
1、精密度研究
取具有抗痛风作用的中药组合物样品(山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草 20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5克),按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液,按照实施例1的检测方法和色谱条件分析,平行进样6次,进样量为10μL,以秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素、葛根素为参照峰,通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积,并计算RSD值,秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素 RSD值分别为1.26%、1.11%、2.02%、1.58%、1.89%和2.15%。结果表明精密性良好。
2、稳定性研究
取具有抗痛风作用的中药组合物样品(山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草 20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5克),按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液,按照实施例1的检测方法和色谱条件分析,采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析,进样量为10μL,以秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素、葛根素为参照峰,通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积计算RSD值,秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素RSD值分别为1.75%、1.87%、1.65%、2.04%、2.11%和2.46%。表明具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化,稳定性非常好。
3、重复性研究
取具有抗痛风作用的中药组合物样品(山慈菇10克、薏苡仁20克、白术10克、金钱草 20克、蒲公英15克、茯苓15克、栀子5克),按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液,按照实施例1的检测方法和色谱条件分析,进样量为10μL,以秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素、葛根素为参照峰,通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积,计算RSD值分别为2.01%、1.53%、1.79%、1.86%、1.85%和2.06%,结果表明样品色谱峰重现性好,该方法的重复性良好。
以上实验结果表明,本发明提供的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱检测方法,稳定性好,精密度高,重复性好,能全面客观评价具有抗痛风作用的中药组合物的质量,为保证临床疗效具有重要的意义。
实施例4
1、李某、男,年龄23岁,体重87公斤,肌酐509,尿酸508高尿,痛风,脚趾关节红肿,腿痛6个多月。服用本发明实施例1制备得到的中药提取物,早晚各一次,每次10g。连续服用14天,肌酐降低为310,尿酸降低为377,腿痛减轻,再连续服用14天,肌酐降低为260,尿酸降低为327。关节红肿明显减弱,腿疼症状消失。
2、常某、男,年龄19岁,体重82公斤,肌酐476,尿酸604高尿,痛风,手、脚趾关节红肿II度,腿痛1年余。服用本发明实施例1制备得到的中药提取物,早晚各一次,每次 10g。连续服用14天,肌酐降低为334,尿酸降低为421,腿痛减轻,再连续服用14天,肌酐降低为212,尿酸降低为347。关节红肿明显减弱,腿疼症状明显减轻,配合限量饮食,加强运动,恢复良好。
3、于某、女,年龄23岁,体重85公斤,肌酐498,尿酸565高尿,痛风,脚趾关节红肿II度,腿痛3月余。服用本发明实施例1制备得到的中药提取物,早晚各一次,每次10g。连续服用14天,肌酐降低为241,尿酸降低为304,腿痛减轻,再连续服用14天,肌酐降低为197,尿酸降低为256。关节红肿明显减弱,腿疼症状消失。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例,不用于限制本发明,本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内,对本发明做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,它包括以下步骤:
步骤1,具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的制备:
分别精密称取不同批次的具有抗痛风作用的中药组合物样品,置于圆底瓶中,加水或乙醇溶液,连续回流提取,过滤,过0.45μm微孔滤膜,得供试品溶液;
步骤2,混合对照品溶液的制备:
精密称定秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素对照品,置于容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,制成混合对照品溶液;
步骤3,分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图;
步骤4,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A;选择不同批次具有抗痛风作用的中药组合物的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰;用平均值计算法生成具有抗痛风作用的中药组合物的对照指纹图谱,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积;并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分;
步骤5,将步骤3中获得的具有抗痛风作用的中药组合物对照指纹图谱和混合对照品图谱进行比对,指认出具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱中2号峰为绿原酸、3号峰为芦丁、6号峰为栀子苷、7号峰为欧前胡素、10号峰为秋水仙碱、11号峰为葛根素。
2.根据权利要求1所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,步骤1具有抗痛风作用的中药组合物供试品溶液制备方法为:取10批次的具有抗痛风作用的中药组合物样品各20g,置于圆底瓶中,分别加乙醇醇溶液300mL,连续回流提取2次,每次1小时,过滤,合并滤液置于100mL容量瓶中,加乙醇定容,过0.45μm微孔滤膜,得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,步骤2混合对照品溶液的制备:取精密称定秋水仙碱、绿原酸、芦丁、栀子苷、欧前胡素和葛根素对照品,置于容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀,制成含0.53mg/mL秋水仙碱、0.24mg/mL绿原酸、0.28mg/mL芦丁、0.37mg/mL栀子苷、0.35mg/mL欧前胡素和0.75mg/mL葛根素组成的混合对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,指纹谱图中共有峰14个。
6.根据权利要求1至5任一项所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,具有抗痛风作用的中药组合物是由山慈菇、生薏苡仁、白术、金钱草、蒲公英、茯苓、栀子组成。
7.根据权利要求6所述的具有抗痛风作用的中药组合物指纹图谱的检测方法,其特征在于,具有抗痛风作用的中药组合物由山慈菇10份、薏苡仁20份、白术10份、金钱草20份、蒲公英15份、茯苓15份、栀子5份制成。
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2021
- 2021-04-30 CN CN202110480159.8A patent/CN113237972A/zh active Pending
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