CN114200045B - 一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法 - Google Patents

一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药制剂、中药成分检测技术领域，具体涉及一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法；本发明首先将蠲痹汤制成颗粒，采用UPLC超高效液相色谱方法，以乙腈‑0.1％磷酸水作为流动相，梯度洗脱可同时检测经典名方复方制剂蠲痹汤活性成分中的龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11‑羰基‑β‑乙酰乳香酸；本发明的测定方法具有稳定性好、重复性好，回收率好的优点，能作为蠲痹汤制剂的质量控制手段。

Description

一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法
技术领域
本发明属于医药制剂、中药成分检测技术领域，具体涉及一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法。
技术背景
蠲痹汤，出自于清代程国彭所撰写的《医学心悟》，为临床上治疗风寒湿痹的常用方。该方组成为：羌活、独活、桂心、秦艽、当归、川芎、蜜炙甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香共11味药，是属于2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制订《古代经典名方目录(第一批)》中的100首经典名方之一。
“风、寒、湿三气，合成痹”，痹症即风，寒，湿等外邪侵袭人体，气血津液运行不畅,经络阻滞，关节筋脉失于濡养，致使肢体肌肉，筋骨，关节发生酸痛，麻木，重着，屈伸不利等。此方中羌活祛风胜湿止痛，善治上半身风寒湿痹。独活，新旧风寒湿痹均可用，以下半身寒湿痹痛为宜。两药同用，治上下之风湿，通利关节，止痹痛。海风藤、秦艽、桑枝可祛风湿、通经络。肉桂大热，散寒止痛力强，与当归、川芎两药同用可鼓舞气血生长。当归、川芎寓“治风先治血，血行风自灭”之意。木香点睛之笔，理气而止痛，加之乳香芳香走窜，“定诸经之痛”，多药伍用，全方可“通治风、寒、湿三气，合成痹”，具有疏风散寒、祛湿除痹之功效。随着研究的深入，蠲痹汤的临床应用范围不断扩大，蠲痹汤的随证加减方剂已用于多个病症。段安乐等人使用外用蠲痹汤熏洗治疗坐骨神经痛取得较好疗效(段安乐,李勇.程氏蠲痹汤薰洗治疗坐骨神经痛63例[J].中医学报,1998,013(002):46-47.)；张良登等遵循同病异治、异病同治的原则，以蠲痹汤为基础，随证加减药味用以治疗肩颈综合征，或合二妙丸加减治疗湿热痹阻证，合通瘀汤、通窍活血汤加减治疗多发性大动脉炎(张良登,张月,张吉.蠲痹汤的临床应用经验[J].河北中医,2009,31(2):2；张良登,张月,张吉.蠲痹汤的临床应用经验[J].河北中医,2009(2))；此外，蠲痹汤及其加减方剂还可用于治疗颞颌关节紊乱综合征、风湿性关节炎、足跟痛等病症(杨振宇,张良.蠲痹汤直流电导入结合水针疗法治疗痛风性关节炎疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2015,24(34):3)。
中药复方成分复杂，干扰因素众多，须采用有效手段反映其质量的真实性、稳定性，提供丰富的鉴别信息。随着现代分析技术的发展，多指标成分含量测定是中药复方制剂一种常用的质控手段，能够反映经典名方的整体基础物质情况。中药指纹图谱结合多指标成分反映复方的整体性，具有专属性强、稳定性好、重现性好等特性，已然成为中药复方控制质量的重要手段。中国专利CN113325094A公开了一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒三种活性成分含量同时测定的方法，其中以高效液相色谱法在320nm和277nm处检测出绿原酸、阿魏酸和龙胆苦苷，其采用的流动相为乙腈-0.1％甲酸水，显然通过该三种化学成分无法全面评价和控制蠲痹汤质量，能简单、准确测定蠲痹汤的多成分含量还是一个技术难题。蠲痹汤应用前景广阔，目前关于该方的研究主要集中于临床应用，对化学成分鉴别、质量控制方面等相关报道很少。为了更全面、更有效地控制蠲痹汤临床用药的质量，使其更安全有效，采用更先进的质量检测手段推动中医药和中成药的发展。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，可对蠲痹汤颗粒中龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸等活性成分及含量同时检测。
为达到上述目的，按照国家对经典名方的开发研究要求，首先将蠲痹汤制备成颗粒剂，以颗粒剂为检测样品，采用UPLC方法完成多种成分的含量检测，并对该方法检测过程的色谱条件、系统适用性试验、对照品制备和供试品制备等必要的线性关系、重现性、稳定性进行考察。
所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法包括：蠲痹汤颗粒的制备、蠲痹汤颗粒的多成含量测定；
具体检测步骤如下：
1、蠲痹汤颗粒的制备
所述颗粒的制备步骤为：取羌活、独活、肉桂、秦艽、当归、川芎、炙甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香共十一味饮片投料，加水煎煮，得到的提取液过滤、减压浓缩、干燥、粉碎、制粒，即得蠲痹汤颗粒；
2、蠲痹汤颗粒的多成含量测定
A.供试品溶液的制备：所述供试品溶液的制备方法为：取蠲痹汤颗粒置具塞锥形瓶中，加入溶剂，密塞，称定重量，以功率250W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
B.对照品溶液的制备：分别称取龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品适量，精密称定，分别加溶剂制成每1ml含龙胆苦苷10～200μg、阿魏酸10～200μg、紫花前胡苷10～200μg、桂皮醛10～200μg、甘草酸铵10～200μg、蛇床子素10～200μg、11-羰基-β-乙酰乳香酸10～200μg的混合溶液，作为对照品溶液；
C.UPLC超高效液相色谱检测：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Acquity UPLCBEH C18，规格为100×2.1mm，1.7μm，柱温设置为20℃～30℃，进样量为1～2μl，流速为0.2～0.5ml/min，PDA检测器检测波长254nm～310nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，按如下洗脱顺序进行梯度洗脱：
Figure BDA0003388770370000031
进一步地，所述的蠲痹汤颗粒组成为：羌活3.73kg、独活3.73kg、肉桂1.87kg、秦艽3.73kg、当归11.19kg、川芎2.61kg、蜜炙甘草1.87kg、海风藤7.46kg、桑枝11.19kg、乳香2.98kg、木香2.98kg。
进一步地，所述蠲痹汤颗粒的制备过程中加水煎煮两次，第一次加10～12倍量水，煎煮1～2h，第二次加8～10倍量水，煎煮0.5～1h，合并两次提取液，过滤采用200目滤布。
进一步地，所述龙胆苦苷、紫花前胡苷、甘草酸铵和11-羰基-β-乙酰乳香酸4种活性成分的检测波长为254nm；所述阿魏酸、桂皮醛和蛇床子素3种活性成分的检测波长为310nm。
进一步地，所述溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲基亚砜中的一种组合，优选为甲醇；
进一步地，所述供试品和对照品溶液的制备过程中甲醇的质量浓度为50～80％。
本发明检测过程中的对照品、供试品以及溶剂：
龙胆苦苷对照品(批号：110713-201813，中国药品生物制品检定研究院)；阿魏酸对照品(批号：111895-201504，中国药品生物制品检定研究院)；紫花前胡苷对照品(批号：111626-201610，中国药品生物制品检定研究院)；桂皮醛对照品(批号：110713-201813，中国药品生物制品检定研究院)；甘草酸铵对照品(批号：111895-201504，中国药品生物制品检定研究院)；蛇床子素对照品(批号：110822-201710，中国药品生物制品检定研究院)；11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品(批号：111626-201610，中国药品生物制品检定研究院)；蠲痹汤颗粒(自制；批号：JB210801～JB210810)；甲醇(美国BCR公司，色谱纯)。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用一套UPLC法可同时测定蠲痹汤制剂中龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸7种主要活性成分及含量，为了更好的检出，本发明将蠲痹汤剂制备成颗粒剂，以颗粒剂为检测样品，检测稳定性良好，重复性良好，其中龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸的平均加样回收率分别为98.33％、101.40％、99.19％、97.11％，98.35％，97.63％，99.42％；本发明采用的检测方法具有稳定性好、重复性好，回收率好的优点，能作为蠲痹汤制剂的质量控制手段。
附图说明
图1为对照品溶液、供试品溶液(批号为：JB210801)、80％甲醇空白溶液在波长为254nm处的UPLC色谱图，其中峰1：龙胆苦苷、峰3：紫花前胡苷、峰5：甘草酸铵、峰7：11-羰基-β-乙酰乳香酸。
图2为对照品溶液、供试品溶液(批号为：JB210801)、80％甲醇空白溶液在波长为310nm的UPLC色谱图，其中峰2：阿魏酸、峰4：桂皮醛、峰6：蛇床子素。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1 对照品溶液的制备
精密称定龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸7个对照品，加入质量浓度为80％的甲醇，制成每1ml溶液中含有龙胆苦苷189.5μg、阿魏酸49.7μg、紫花前胡苷50.42μg、桂皮醛88.65μg、甘草酸铵95.68μg、蛇床子素55.25μg、11-羰基-β-乙酰乳香155.15μg的混合溶液。
实施例2 蠲痹汤颗粒的制备
取羌活3.73kg、独活3.73kg、肉桂1.87kg、秦艽3.73kg、当归11.19kg、川芎2.61kg、蜜炙甘草1.87kg、海风藤7.46kg、桑枝11.19kg、乳香2.98kg、木香2.98kg，加水煎煮两次，第一次加12倍量水，煎煮2h，第二次加10倍量水，煎煮1h，合并两次提取液，趁热用200目滤布滤过，滤液减压浓缩，干燥，粉碎，制粒，即得蠲痹汤颗粒；
实施例3 供试品溶液的制备
精密称定10组实施例2中颗粒，每组0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
试验例一 色谱条件与系统性试验
采用Waters H-class超高效液相色谱仪，Waters PDA检测器，Empower工作站；
色谱柱采用Waters Acquity UPLC BEH C18(100×2.1mm，1.7μm)色谱柱；
流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％磷酸的超纯水，按表1洗脱程序进行梯度洗脱，流速0.5ml/min，柱温为30℃，进样量为2μL，检测波长分别为254nm和310nm；
表1：洗脱程序
Figure BDA0003388770370000051
试验例二 多成分含量测定
精密吸取对照品溶液和10个供试品(JB210801～JB210810)溶液各2μL，按色谱条件测定，记录色谱图，采用外标法计算，即得10批蠲痹汤颗粒中龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸含量，检测结果见表2；
表2：不同批次蠲痹汤颗粒中活性成分的含量测定结果(mg/g)
Figure BDA0003388770370000061
对比例一、色谱条件与系统性试验
与试验例一的区别在于流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，仪器、色谱柱、洗脱体系、流速、柱温、进样量、检测波长等其他参数与试验例一相同，得到的结果如下：
254nm：未检测出2、3、4和5峰重叠；
310nm：未检测出1、2、3、6，4和5峰重叠。
对比例二、色谱条件与系统性试验
与试验例一的区别在于流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％甲酸的超纯水，仪器、色谱柱、洗脱体系、流速、柱温、进样量、检测波长等其他参数与试验例一相同，得到的结果如下：
254nm：未检测出2、3、4、5、6；
310nm：未检测出1、3、5、6、7。
对比例三、色谱条件与系统性试验
与试验例一的区别在于流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％磷酸二氢钠的超纯水，仪器、色谱柱、洗脱体系、流速、柱温、进样量、检测波长等其他参数与试验例一相同，得到的结果如下：
254nm：未检测出2、3、4、5、7、6宽峰；
310nm：未检测出2、3、5、7、4宽峰、6宽峰。
试验例三 方法学研究
1、专属性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液(批号为：JB210801)、80％甲醇空白溶液各2μl，按试验例一色谱条件进样分析，结果见附图1～2，供试品色谱中与对照品色谱相应位置上有色谱峰，空白样品上没有相应峰，表明阴性无干扰，本方法专属性强。
2、精密度试验
精密吸取同一批(批号为：JB210801)供试品溶液，连续进样6次，测定各组分峰面积RSD值，结果龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸峰面积的RSD值均小于1.4％，表明仪器精密度良好。
3、稳定性试验
取同一批(批号为：JB210801)供试品溶液，于室温放置0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，精密吸取2μL，按试验例一所述色谱条件进样分析，计算各色谱峰面积的RSD值，结果龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸各组分峰面积的RSD值均小于1.5％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
4、重复性试验
取同一批(批号为：JB210801)供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，测定各组分峰面积RSD值，结果龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸峰面积的RSD值均小于1.7％，表明方法重复性良好。
5、加样回收率试验
精密称取已知含量的蠲痹汤样品(批号为：JB210801)6份，每份0.25g，置于圆底烧瓶中，分别加入各对照品适量，按实施例3供试品溶液制备方法制备，按试验例一所述色谱条件进行测定，计算龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸的平均加样回收率分别为98.33％、101.40％、99.19％、97.11％，98.35％，97.63％，99.42％，RSD分别为1.7％、1.9％、1.5％、1.9％，1.3％、1.7％、1.8％，均满足《中国药典》2020年版要求。
6、线性范围试验
分别精密吸取对照品溶液适量，逐级稀释成质量浓度分别为100％、75％、50％、25％、10％、1％的对照品溶液，按试验例一所述色谱条件进行测定，记录不同质量浓度(X)对照品的色谱峰面积(拟合得到线性回归方程为龙胆苦苷Y＝19063X+6744.9(R＝0.9997)、阿魏酸Y＝5622.8X-97.4(R＝0.9999)、紫花前胡苷Y＝20807X-7813.3(R＝0.9999)，桂皮醛Y＝12473X-673.4(R＝0.9999)，甘草酸铵Y＝13528X-2568.2(R＝0.9999)、蛇床子素Y＝11825.3X-1125.4(R＝0.9999)、11-羰基-β-乙酰乳香酸Y＝11542.8X-2486.3(R＝0.9999))；
分析结果表明，龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸分别在1.895～189.5、0.497～49.7、0.504～50.42、0.886～88.65、0.956～95.68、0.552～55.25、1.551～155.15μg/ml的范围内线性关系良好。
以上试验结果表明，应用此方法具有稳定性好、重复性好，回收率好的优点，能作为控制蠲痹汤颗粒的的质量控制手段。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述蠲痹汤制剂以蠲痹汤颗粒形式进行，采用甲醇提取，所述蠲痹汤颗粒中的活性成分包括龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸；
所述的测定方法采用超高效液相色谱，其检测步骤包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为100×2.1mm，1.7μm，柱温设置为20℃～30℃，进样量为1～2μl，流速为0.2～0.5ml/min，PDA检测器检测波长254nm～310nm，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％磷酸的超纯水，梯度洗脱程序为：0～8min，A为8～11％；8～15min，A为11～17％；15～20min，A为17～22.5％；20～30min，A为22.5～42.5％；30～36min，A为42.5～61％；36～40min，A为61～100％。
2.根据权利要求1所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述蠲痹汤颗粒的制备步骤为：取羌活、独活、肉桂、秦艽、当归、川芎、炙甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香投料，加水煎煮，过滤、减压浓缩、干燥、粉碎、制粒。
3.根据权利要求2所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述蠲痹汤颗粒的制备步骤为：取羌活3.73kg、独活3.73kg、肉桂1.87kg、秦艽3.73kg、当归11.19kg、川芎2.61kg、炙甘草1.87kg、海风藤7.46kg、桑枝11.19kg、乳香2.98kg、木香2.98kg投料，加水煎煮，过滤、减压浓缩、干燥、粉碎、制粒。
4.根据权利要求2所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述蠲痹汤颗粒的制备过程中加水煎煮两次，第一次加10～12倍量水，煎煮1～2h，第二次加8～10倍量水，煎煮0.5～1h，合并两次提取液，过滤采用200目滤布。
5.据权利要求1所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述龙胆苦苷、紫花前胡苷、甘草酸铵和11-羰基-β-乙酰乳香酸4种活性成分的检测波长为254nm；所述阿魏酸、桂皮醛和蛇床子素3种活性成分的检测波长为310nm。
6.据权利要求1所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述测定方法还包括对照品溶液的制备，具体为：分别精密称定龙胆苦苷、阿魏酸、紫花前胡苷、桂皮醛、甘草酸铵、蛇床子素、11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品，分别加入甲醇制成每1ml含龙胆苦苷10～200μg、阿魏酸10～200μg、紫花前胡苷10～200μg、桂皮醛10～200μg、甘草酸铵10～200μg、蛇床子素10～200μg、11-羰基-β-乙酰乳香酸10～200μg的溶液。
7.据权利要求1所述的蠲痹汤制剂活性成分的测定方法，其特征在于，所述测定方法还包括供试品溶液的制备，具体为：取蠲痹汤颗粒置具塞锥形瓶中，加入甲醇，密塞，称定重量，以功率250W、频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
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