CN113325094A - 一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒三种活性成分含量同时测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒三种活性成分含量同时测定的方法，该方法采用的色谱条件如下：色谱柱为AgilentZORBAX SB‑C18(250mm×4.6mm,5μm)，以乙腈‑0.1％甲酸梯度洗脱，流速为1.0ml·min^‑1，检测波长：绿原酸、阿魏酸为320nm和龙胆苦苷为277nm，柱温30℃，进样量为10μl。在此色谱条件下，绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的线性范围分别为9.848～59.088μg·ml^‑1(R＝0.99895)、49.588～297.528μg·ml^‑1(R＝0.99904)和6.016～36.096μg·ml^‑1(R＝0.9976)，平均加样回收率分别为101.4％(RSD＝2.4％)、97.2％(RSD＝2.7％)100.0％(RSD＝2.7％)(n＝6)。绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸色谱峰分离良好，浓度峰面积呈良好的线性关系。本方法简单、快速、准确、重现性好，可为全面评价和控制古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒的质量提供理论依据。

Description

一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒三种活性成分含量同时 测定的方法

技术领域

本发明涉及一种中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒中三种活性成分的检测方法，具体的说是一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒三种活性成分含量同时测定的方法，属于医药技术领域。

背景技术

中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒祛风除湿，蠲痹止痛，主治风寒湿三气合而成痹者。中医痹症，现代中医将其称之为尪痹，指风寒湿邪侵袭关节，气血痹阻所致的骨关节病，以小关节疼痛，肿胀，晨僵，甚至变形为特点，西医病名类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)为其中一种。类风湿性关节炎为自身免疫疾病，治愈难，发病率有逐年上升的趋势。蠲痹颗粒处方出自清代程国彭《医学心悟》。蠲痹汤，因临床用于防治RA，疗效确切，获批为国家古代经典名方类新药，医学前景良好。

目前国内关于中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒制剂质量控制方面少有研究，为使制剂质量得到有效控制，因此选择绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸为蠲痹颗粒的质量评价指标，为控制中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒质量提供科学依据。

本发明建立了同时测定中药新药古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸三种成分含量的检测方法，实验结果表明，本法建立的HPLC同时测定制剂中多个不同指标成分的含量测定方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时测定古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒中三种活性成分的方法的方法，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。

本发明的目的是这样实现的：利用高效液相色谱检测的方法，同时测定制剂中处方药材主要成分绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的含量，具体步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为0.9849mg/ml、0.99176mg/ml及1.00287mg/ml的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含绿原酸、龙胆苦苷及阿魏酸浓度分别为0.2955mg/ml、1.4876mg/ml、0.2006mg/ml 的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

(2)供试品溶液的制备：取蠲痹颗粒约2g，精密称定，加入0.1％甲酸甲醇溶液定容至25ml，超声提取40min，补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，备用。

(3)色谱条件及样品检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测，色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-0.1％甲酸梯度洗脱，流速为1.0ml·min^-1，检测波长：绿原酸、阿魏酸为320nm和龙胆苦苷为277nm，柱温30℃，进样量为10μl。记录峰面积计算含量即可。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制蠲痹颗粒质量提供理论基础和科学依据。

2、本发明方法采用高效液相色谱法及梯度洗脱检测的方法，实现了同时测定蠲痹颗粒中3种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸有效成分的含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分回收率均在95％以上。

3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为蠲痹颗粒有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。

附图说明

图1是本发明绿原酸及阿魏酸混合对照品溶液(A)、供试品溶液(B)、绿原酸及阿魏酸阴性对照(C) HPLC图谱。

附图标记说明：1-绿原酸、2-阿魏酸

A-绿原酸及阿魏酸混合对照品溶液HPLC图

B-供试品溶液HPLC图

C-绿原酸及阿魏酸照阴性HPLC图

图2是本发明龙胆苦苷对照品溶液(D)、供试品溶液(F)、龙胆苦苷阴性对照(G)HPLC图谱。

附图标记说明：3-龙胆苦苷

D-龙胆苦苷对照品溶液HPLC图

F-供试品溶液HPLC图

G-龙胆苦苷阴性HPLC图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

1仪器与试药

1.1仪器

美国Waters-e2695高效液相色谱仪(包括四元高压泵系统，自动进样器，UV检测器和柱温箱等)； BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；XS205电子天平(梅特勒-托利多)；超声清洗器 (SG250HE，上海冠特超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(HH-4，常州奥华仪器有限公司)；超纯水由密思博超纯水机制备等。

1.2试药

对照品：绿原酸(Chlorogenic acid)(B20782，含量98％)购于上海源叶生物科技有限公司、龙胆苦苷(Gentiopicroside)(供含量测定用，190513，含量98％)和阿魏酸(Ferulic acid)(供含量测定用， 110773-201614，含量99％)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯；Fisher公司)；甲酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)、甲醇(分析纯，西陇科学有限公司)；水为超纯水。

含量测定方法研究所用蠲痹颗粒样品由广西中医药大学制药厂自制(生产批号为20201201、20201202、 20201203、20201204、20201205、20210101、20210102、20210103、20210104、20210105)。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱[5min，5％A；5～20min，5～12％A；20～40min，12～20％A；40～50min，20％A；50～65min， 20～90％A；65～80min，90％A]；检测波长:龙胆苦苷277nm；绿原酸、阿魏酸320nm；流速为1ml·min^-1；柱温30℃；进样量10μl。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备精密称取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为0.9849mg/ml、0.99176mg/ml及1.00287mg/ml的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含绿原酸、龙胆苦苷及阿魏酸浓度分别为0.2955mg/ml、1.4876mg/ml、0.2006mg/ml 的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.2.2供试品溶液制备取蠲痹颗粒约2g，精密称定，加入0.1％甲酸甲醇溶液定容至25ml，超声提取40 min，补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.2.3阴性样品溶液制备按蠲痹颗粒的处方比例及制备工艺要求配制阴性样品(1)不含当归、羌活、独活；阴性样品(2)不含秦艽，照“2.2.2”项下方法制成(1)绿原酸、阿魏酸阴性样品溶液，(2)龙胆苦苷阴性样品溶液。

2.3系统适用性试验

按“2.1”项下色谱条件分别测定对照品、供试品及阴性溶液，实验结果显示：(320nm)目标物质绿原酸、阿魏酸和(277nm)目标物质龙胆苦苷分别在320nm和277nm相应的对照品色谱与供试品色谱中相同的保留时间处都有色谱峰，并且分离度均大于1.5、理论塔板数均大于5000，拖尾因子均在0.95～1.05之间。说明该色谱条件适用于蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸这3个成分的测定，结果见图1、图2。

2.4线性范围考察

取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液，进样体积分别为2、4、6、8、10、12μl注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表1。

表1回归方程及线性范围

Tab1 Regression equations and linear range ofreference substances

2.5精密度试验

取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸混合对照品溶液(浓度分别为：0.2955mg/ml、1.4876mg/ml、0.2006mg/ml)，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，分别测定绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的峰面积，计算日内精密度的RSD值分别为0.44％、0.20％、0.15％，和日间精密度的RSD值分别为0.25％、0.55％、0.71％，结果表明精密度良好。

2.6稳定性试验

取蠲痹颗粒(批号20201201)2.0g，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备一份供试品溶液，分别在 0h、2h、4h、8h、12h、24h，按“2.1”项下色谱条件依次测定绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的峰面积，计算平均含量分别为2.9573、19.3217、2.2485mg·g^-1，x±s值分别为2.9573±0.0038、19.3217±0.0261、2.2485±0.0152，表明样品溶液在24h内稳定。

2.7重复性试验

取蠲痹颗粒(批号20201201)2.0g 6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，结果6份试样中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸平均含量分别：2.9123mg·g^-1、19.3205mg·g^-1、 2.2464mg·g^-1，x±s值分别为2.9123±0.0276、19.3205±0.0652、2.2464±0.0094，结果表明该方法的重复性良好。

2.8加样回收率试验

取蠲痹颗粒(批号20201201)(绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸平均含量分别为2.9123mg·g^-1、19.3205mg·g^-1、 2.2464mg·g^-1)1.0g，精密称定6份，分别精密加入绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品各2.9547mg、18.84344 mg、2.00574mg。按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件测定各峰面积，计算绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸各加样回收率分别为101.4％、97.2％、100.0％，RSD值分别为2.4％、2.7％、 2.7％。实验结果表明方法准确度良好，见表2。

表2加样回收率试验的结果(n＝6)

Tab 2 Results ofrecovery test(n＝6)

2.9样品测定

取广西中医药大学制药厂自制的蠲痹颗粒10批，各约2g，精密称定，按“2.2.2”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，每批测定2次，计算绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的平均值±标准差，结果见表3。

表3样品含量测定结果(mg·g^-1,n＝2)

Tab 3 Contents in the sample(mg·g^-1,n＝2)

综上所述，本方法的专属性、重现性、准确度均良好，可以作为蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸含量测定的方法。

Claims (1)

1.一种古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒中三种活性成分含量的测定方法，其特征在于：该方法利用高效液相色谱法(HPLC)在同一实验条件下同时分离并测定古代经典名方复方制剂蠲痹颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸的含量，具体步骤如下：(1)对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、龙胆苦苷、阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，分别制成浓度为0.9849mg/ml、0.99176mg/ml及1.00287mg/ml的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含绿原酸、龙胆苦苷及阿魏酸浓度分别为0.2955mg/ml、1.4876mg/ml、0.2006mg/ml的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。(2)供试品溶液的制备：取蠲痹颗粒约2g，精密称定，加入0.1％甲酸甲醇溶液定容至25ml，超声提取40min，补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，备用。(3)分离检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测，色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-0.1％甲酸梯度洗脱，流速为1.0ml·min^-1，检测波长：绿原酸、阿魏酸为320nm和龙胆苦苷为277nm，柱温30℃，进样量为10μl。记录峰面积计算含量即可。

Images