CN115969891A - 一种蛇床子总提取物及其应用和图谱构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛇床子总提取物,含有佛手柑素,还公开了该蛇床子总提取物在制备具有预防和/或治疗过敏变态反应性皮肤病、银屑病或带状疱疹的药物中的应用,以及该蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法。本发明采用LC‑MS技术,建立了蛇床子总提取物的指纹图谱,有效地提高了蛇床子总提取物的质量稳定性、均一性、可控性。
Description
技术领域
本发明属于蛇床子技术领域,具体涉及一种蛇床子总提取物及其应用和图谱构建方法。
背景技术
传统意义的中药指在中医药理论指导下的药用物质,具有切实可行的创新物质来源。中药生产涉及多个环节:中药材资源-中药饮片(包括炮制) -中药方剂-中药制剂(中成药),其中任何一个环节控制不好,都会影响产品的质量及临床疗效的安全性与有效性。因此,中药质量控制是现代中药发展的重点与难题之一。目前我国在现有标准中,中药材、中成药的质量标准大多限于鉴别外观、检查性状、水分,较少对其中有效成分进行检测,即使建立成分测定标准,所测定的成分大部分仅为1~2个代表性的指标成分而已,直接与疗效相关的有效成分测定是为痛点。因此,如何科学、合理全面的制订中药的质量控制标准,对中药质量、安全有效,对公众健康有着非常重要的意义。
中药指纹图谱是对中药材或中药制剂经适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
中药指纹图谱技术已涉及众多方法,包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR) 和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法,尤其是HPLC、TLCS和 GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测,且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC-MS和GC-MS等联用技术的应用,中药指纹图谱技术更趋完善。
目前,蛇床子总提取物其有效成分包括花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素等。但还有一些未知的成分没有被发现,随着提取技术的进步以及检测技术的发展,越来越多的功效成分正在被逐步提取出来并进一步利用。
发明内容
本发明的第一个目的在于一种蛇床子总提取物,该总提取物中含有佛手柑素。
本发明的目的还在于提供上述蛇床子总提取物在制备具有预防和/或治疗过敏变态反应性皮肤病、银屑病或带状疱疹的药物中的应用。
本发明的最后一个目的在于提供上述蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现:一种蛇床子总提取物,含有佛手柑素。
本发明通过蛇床子中药材、蛇床子总提取物及蛇床子制剂指纹图谱的构建方法,首次在蛇床子中药材、蛇床子总提取物及蛇床子制剂中发现了新成分佛手柑素。
其中蛇床子总提取物可以是市售的蛇床子提取物,也可以采用以下方法制备获得:取蛇床子中药材,加蛇床子总质量3~6倍的体积百分含量为80~85%的乙醇回流提取1~3次,每次2~3小时,过滤,合并滤液,减压浓缩得到醇提浸膏,再经结晶及干燥,得到蛇床子总提取物,即蛇床子总香豆素。更佳的,所述蛇床子总提取物通过以下方法制备获得:取蛇床子药材适量,加3~6倍量(质量) 85%(体积百分含量)乙醇,75℃温度下加热回流提取3次,每次2小时,滤过,合并滤液,减压浓缩,得到醇提浸膏,再经结晶、减压干燥得到蛇床子总提取物,即蛇床子总香豆素。
进一步的,所述蛇床子总提取物中,还含有花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物和橙皮内酯。
此外,本申请中的蛇床子总提取物,其成分主要是蛇床子总香豆素。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现:上述的蛇床子总提取物在制备具有预防和/或治疗过敏变态反应性皮肤病、银屑病或带状疱疹的药物中的应用。
优选的,所述过敏变态反应性皮肤病包括变态反应性接触性皮炎、特应性皮炎、湿疹、荨麻疹和药疹。
优选的,所述药物包括蛇床子总提取物加上药学上可接受的载体或辅料制成。
作为本发明一种优选的实施方案,所述药物为含有蛇床子总提取物的蛇床子软膏、蛇床子喷雾或蛇床子液体剂。
即本申请中的含有蛇床子总提取物的药物主要为蛇床子总香豆素外用制剂,包括蛇床子总香豆素软膏、蛇床子总香豆素喷雾剂及蛇床子总香豆素液体剂等,这些都是采用本领域常规方法制成。
优选的,所述蛇床子总香豆素软膏为蛇床子总香豆素与常规药用辅料制成的供外用的蛇床子总香豆素软膏剂,所述蛇床子总香豆素软膏中总香豆素的质量百分含量为10%。
本申请依据该中药的临床试验,根据其适用对象和适应症制剂优选为软膏剂。
为了使上述剂型能够实现,需在制备该剂型时加入适宜的药用辅料,例如增溶剂、基质、保湿剂等。增溶剂包括:聚山梨酯80等,基质包括白凡士林、硬脂酸、单双硬脂酸甘油酯等,保湿剂包括甘油等。
更佳的,所述的蛇床子总香豆素软膏通过以下方法制成:取蛇床子总香豆素原料与硬脂酸、单双硬脂酸甘油酯、凡士林制成的油相与甘油、水、聚山梨酯80 制成的水相经乳化、灌封,制得。
优选的,所述蛇床子总香豆素喷雾剂为蛇床子总香豆素与乙醇经超声溶解、放置、过滤及定容制成的供外用的蛇床子总香豆素喷雾剂,所述蛇床子总香豆素喷雾剂中总香豆素的质量百分含量为1~10%。
优选的,所述蛇床子总香豆素液体剂为蛇床子总香豆素与非纯乙醇溶剂制成的供外用的蛇床子总香豆素液体剂,其中非纯乙醇溶剂包括苯甲醇、丙二醇及聚山梨酯80,所述蛇床子总香豆素溶液剂中总香豆素的质量百分含量为0.5%~5%。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现:一种蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法,包括以下步骤:
(1)混合对照品溶液制备:取对香豆酸、蛇床子素、异茴芹素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素对照品,用乙醇溶解,得混合对照品溶液;
(2)供试品溶液制备:取蛇床子总提取物,加入乙醇,超声处理后,用乙醇补足减失质量,混匀,过滤,取滤液,得供试品溶液;
(3)取混合对照品溶液、供试品溶液,进样,采用液相色谱-高分辨质谱全扫描分析,使用软件对供试品特征图谱进行共有峰标识,对特征组分进行提取与确认,对蛇床子的特有化学成分进行结构的解析、归属指认和确证,获得蛇床子的化学成分,建立蛇床子总提取物的标准指纹图谱。
在该蛇床子提取物指纹图谱的构建方法中:
优选的,步骤(1)中混合对照品溶液制备包括:精密称定对香豆酸、蛇床子素、异茴芹素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素对照品约1mg,分别置于10mL量瓶中,加乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取上述溶液各1.0mL,置于10mL量瓶中,用体积百分含量为70%的乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。
优选的,步骤(2)中所述乙醇的体积百分含量为70%,所述蛇床子总提取物与乙醇的用量关系为0.05g∶50mL,超声处理时间为60min。
优选的,步骤(3)中液相色谱的参数如下:色谱条件:C18色谱柱;流速: 0.5mL/min;柱温:40℃;波长:310nm;进样体积:10μL;流动相A:0.1%(体积百分含量)乙酸水溶液;流动相B:甲醇,梯度洗脱条件如下:
时间 | 流动相 | 流动相B |
0 | 95 | 5 |
10 | 65 | 35 |
20 | 55 | 45 |
35 | 55 | 45 |
40 | 53 | 47 |
65 | 53 | 47 |
70 | 30 | 70 |
75 | 10 | 90 |
85 | 10 | 90 |
85.1 | 0 | 100 |
120 | 0 | 100 |
120.1 | 95 | 5 |
130 | 95 | 5 |
优选的,步骤(3)中色谱柱为Thermo Scientific AcclaimTM 120C18 250×4.6mm,5μm。
优选的,步骤(3)中蛇床子总提取物的标准指纹图谱包括以下化合物:花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物、橙皮内酯和佛手柑素。
本申请还进一步建立了蛇床子中药材、蛇床子总提取物及蛇床子制剂指纹图谱的构建方法,该方法采用LC-MS技术,建立了中药材“蛇床子”、其总提取物“蛇床子香豆素”及其制剂如“蛇床子总香豆素软膏”的指纹图谱,有效地提高了蛇床子药材、蛇床子总提取物及其制剂产品的质量稳定性、一致性和可控性。
采用本申请中指纹图谱测定方法可以测定出蛇床子中药材中的10个共有峰,并确认7个峰的化合物分别为对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素;可以测定出蛇床子提取物及蛇床子制剂中的9 个共有峰,并确认7个峰的化合物分别为花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素。
具体的,蛇床子中药材的标准指纹图谱包括以下化合物:对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物、橙皮内酯和佛手柑素。
具体的,蛇床子总提取物及蛇床子制剂的标准指纹图谱包括以下化合物:花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物、橙皮内酯和佛手柑素。
本发明具有以下优点:
(1)本申请从蛇床子总提取物中获得了新成分佛手柑素;
(2)本申请采用LC-MS技术,建立了蛇床子总提取物的指纹图谱,还可以根据该方法进一步建立中药材蛇床子及含有蛇床子总提取物制剂如蛇床子总香豆素软膏的指纹图谱,有效地提高了蛇床子药材、蛇床子总提取物及其制剂产品的质量稳定性、均一性、可控性;
(3)本申请通过色谱条件的优化及检测方法的建立,检测了蛇床子总提取物中各成分的含量,并采用现代科学的鉴定手段(LC-MS等),对特征图谱共有峰进行了确认,确证了各组分的归属,建立蛇床子总提取物的指纹图谱,并进一步建立了蛇床子中药材及蛇床子总提取物制剂的指纹图谱,从而提高了产品质量的可控性。
附图说明
图1是实施例3中混合对照品的指纹图谱;
图2是实施例3中对照药材的指纹图谱,其中峰号分别代表的化合物为峰1 对香豆酸,峰2花椒毒酚,峰3橙皮内酯水合物,峰4花椒毒素,峰5异茴芹素,峰6橙皮内酯,峰7佛手柑内酯,峰8欧前胡素,峰9蛇床子素,峰10佛手柑素;
图3是实施例3中蛇床子药材的指纹图谱,峰号1-10同图2;
图4是实施例3中蛇床子总提取物(即蛇床子总香豆素)的指纹图谱,峰1 花椒毒酚,峰2橙皮内酯水合物,峰3花椒毒素,峰4异茴芹素,峰5橙皮内酯,峰6佛手柑内酯,峰7欧前胡素,峰8蛇床子素,峰9佛手柑素;
图5是实施例3中蛇床子总香豆素软膏制剂的指纹图谱,峰号1-9同图4;
图6是实施例3中中药材15批样品的指纹图谱对比色谱图;
图7是实施例3中中药材提取物15批样品的指纹图谱对比色谱图;
图8是实施例3中中药材提取物制成的制剂15批样品的指纹图谱对比色谱图;
图9为实施例3中蛇床子中药材10号未知峰质谱图;
图10为实施例3中蛇床子中药材10号未知峰局部放大提取离子流图;
图11为实施例3中蛇床子中药材10号未知峰质谱图;
图12为实施例3中蛇床子中药材10号未知峰二级质谱图;
图13为实施例3中佛手柑素的标准质谱图;
图14为实施例3中佛手柑素的结构图;
图15为实施例4中蛇床子总香豆素软膏对带状疱疹的效果图片;
图16为实施例4中蛇床子总香豆素软膏对于腹部银屑病的效果图片;
图17为实施例4中蛇床子总香豆素软膏对于背部银屑病的效果图片;
图18为实施例4中蛇床子总香豆素软膏对于膝盖窝特应性皮炎的效果图片;
图19为实施例4中蛇床子总香豆素软膏对于耳朵特应性皮炎的效果图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,以便本领域技术人员可以更好的了解本发明,但不因此限制本发明,以下采用原料,如无特殊说明,均来源于商业渠道。
实施例1蛇床子提取物的制备
制备方法:取中药材蛇床子药材1kg磨成粗粉后,置于提取器中,加入6 倍质量的85%(体积百分含量)乙醇溶剂,加热回流2小时,收集提取液,再加入3倍质量的85%(体积百分含量)乙醇溶剂同法提取2次,合并提取液,室温放置过夜,80℃下减压浓缩,得到浸膏,室温放置24小时后析出绿色沉淀物,滤出,干燥得到蛇床子总提取物,即蛇床子总香豆素。
实施例2软膏的制备
制备方法:将用实施例1的制备方法所得的蛇床子总香豆素与适宜的基质制成膏状外用软膏剂,即水包油型制剂,配方为:蛇床子总香豆素100g,硬脂酸 80g,单双硬脂酸甘油酯100g,白凡士林80g,甘油160g,聚山梨酯-8060g,水 280g,甘油:水(4:10)加至1000g,即得蛇床子软膏制剂。
实施例3
试验例:分别用中药材(蛇床子)、实施例1制备的蛇床子总提取物样品及实施例2制备的蛇床子软膏制剂样品进行以下方法学考察。包括系统适用性、专属性、重复性、中间精密度、稳定性等方面对该方法进行验证。
1、色谱条件
1.1仪器:赛默飞Vanquish高效液相色谱仪,紫外检测器;
1.2色谱条件:色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18,4.6*250mm,5μm:编号:GB-L-20-02-192;
设置如下参数为初始条件,流速:0.5mL/min;柱温:40℃;波长为310nm;流动相A:0.1%乙酸水溶液;流动相B:甲醇;梯度洗脱。洗脱程序,如下表1:
表1流动相梯度洗脱程序
2、色谱条件的优化
2.1色谱条件的优化
筛选蛇床子药材样品中含量较高的对照品可指认的优势成分(蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异茴芹素、对香豆酸),先采用基础色谱条件(表1),并以其峰面积加和为指标,同时考察各成分之间的分离度,分别进行了色谱柱的筛选、流动相配比的筛选等条件试验,最终以能使优势成分对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异茴芹素、蛇床子素相互之间能较好分离,且以上优势成分与供试品中相邻成分均能较好分离作为目标,最终优化得到的色谱条件见表2。
表2优化后的色谱条件
3、提取条件试验
3.1样品处理方法:分别取蛇床子药材约0.5g、蛇床子总香豆素原料约50mg 及蛇床子总香豆素软膏约0.1g,通过正交试验优化提取方法,包括提取溶剂的考察,提取溶剂的浓度、提取方式、提取时间、提取溶剂的体积,条件设置见表3。
表3优化提取条件试验
3.2试验结论:
(1)70%(体积百分含量)乙醇作为药材提取溶剂时,其“总峰面积/称样量”值最大,即提取效率最高;而作为原料及制剂提取溶剂时,甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇的“总峰面积/称样量”基本一致,综合考虑溶剂的毒性及经济性,故选择70%乙醇作为提取溶剂。
(2)药材与制剂超声提取方式“总峰面积/称样量”略高于加热回流提取,原料超声提取方式“总峰面积/称样量”略低于加热回流提取。两种提取方式提取能力无明显差异,考虑到操作的简便性,选择超声处理为提取方式。
(3)药材超声60min“总峰面积/称样量”值最大,即提取效率最高;原料药10~60min总峰面积/称样量基本一致;制剂20~60min总峰面积/称样量基本一致。结合药材、原料和制剂试验结果情况,故最终提取时间选择超声60min。
(4)随着提取溶剂的增加,换算成浓度一致时,“总峰面积/称样量”也随着增加,考虑到各特征峰的响应,最终选择提取溶剂体积为50mL。
4、供试品的制备
通过提取条件试验,供试品溶液制备方法的确定如下:
蛇床子药材特征图谱供试品制备方法为:取蛇床子药材粗粉约0.5g,精密称定,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声处理60min后,待溶液冷却后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取滤液,即得。
蛇床子总香豆素原料特征图谱供试品制备方法为:取蛇床子总香豆素(即蛇床子总提取物)约50mg,精密称定,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声处理60min后,待溶液冷却后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
蛇床子总香豆素软膏特征图谱供试品制备方法为:取蛇床子总香豆素软膏约0.1g,精密称定,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声处理60min后,待溶液冷却后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
4.1对照品及样品来源信息
4.1.1对照品
花椒毒酚购自成都乐美天医药科技有限公司,对香豆酸、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯和欧前胡素购自成都格利普生物科技有限公司,蛇床子素和蛇床子对照药材购自中国药品生物制品检定院(中检院)。
4.1.2样品
对香豆酸(99.97%,纯度,下同)、花椒毒素(99.88%)、异茴芹素(99.97%)、佛手柑内酯(99.85%)、欧前胡素(98.24%)购自成都乐美天医药科技有限公司,花椒毒酚(≥98.0%)购自成都乐美天医药科技有限公司,蛇床子素(99.5)、蛇床子对照药材(NA)购自中国药品生物制品检定院(中检院)。
4.1.2样品
方法开发用样品蛇床子、蛇床子总香豆素原料、蛇床子总香豆素软膏来自广东海赛特药业有限公司。
方法学验证用样品及指纹图谱测定用样品蛇床子药材均购自安徽、广州,蛇床子总香豆素原料、蛇床子总香豆素软膏及蛇床子总香豆素空白软膏均购自广东海赛特药业有限公司。
蛇床子总香豆素原料、蛇床子总香豆素软膏也可以按照实施例1-2中的方法制备。
4.2对照品及样品制备
4.2.1混合对照品的制备
精密称取对香豆酸、蛇床子素、异茴芹素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素对照品约1mg,分别置10mL量瓶中,加乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取上述溶液各1.0mL,置10mL量瓶中,用70%乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。用本发明方法测定的图谱见图1。
4.2.2样品的制备
4.2.2.1药材样品的制备:取药材约0.5g,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声60min后,待溶液冷却至室温后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。用本发明方法测定的图谱见图2(蛇床子对照药材)及图3(蛇床子药材)。
4.2.2.2提取物样品的制备精密称取蛇床子总香豆素原料约50mg,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声60min后,待溶液冷却至室温后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。用本发明方法测定的图谱见图4。
4.2.2.3软膏样品的制备精密称取蛇床子总香豆素软膏约0.1g,精密加70%乙醇50mL,称定重量,超声60min后,待溶液冷却至室温后再次称重,用70%乙醇补足减失重量,摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。用本发明方法测定的图谱见图5。
5、方法学验证
5.1专属性试验
5.1.1药材专属性
照4.2.1及4.2.2项下方法分别制备混合对照品溶液及样品供试品溶液,同时制备空白溶液及软膏制剂的阴性样品(不含提取物),按确定的色谱条件测定,记录色谱图。
5.1.2试验结论
(1)空白溶剂对蛇床子药材10个特征峰的检测无干扰,且与参照物峰的保留时间一致,其中对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素与混合对照品溶液中相对应的峰保留时间一致。表明本方法对蛇床子药材指纹图谱测定具有良好的专属性。
(2)空白溶剂对蛇床子总香豆素原料9个特征峰的检测无干扰,其中对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素与混合对照品溶液中相对应的峰保留时间一致。表明本方法对蛇床子总香豆素原料药指纹图谱测定具有良好的专属性。
(3)空白溶剂及阴性样品对蛇床子总香豆素软膏中9个特征峰的检测无干扰,其中对香豆酸、花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素与混合对照品溶液中相对应的峰保留时间一致。表明本方法对蛇床子总香豆素软膏的指纹图谱测定具有良好的专属性。
5.2精密度试验
5.2.1试验方法
取混合对照品溶液,以蛇床子素为参照,按选定的色谱条件测定,记录色谱图,计算相对保留时间与相对峰面积。结果见表4~5。
表4对照品溶液精密度考察结果(相对峰面积)
表5对照品溶液精密度考察结果(相对保留时间)
5.2.2试验结论
对照品溶液中各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%~0.2%范围内,相对峰面积RSD在0.0%~0.2%范围内,表明仪器精密度良好。
5.3重复性试验
5.3.1操作方法
取同一份药材、提取物及软膏制剂按照4.2对照品及样品制备项下方法,分别平行制备各6份供试品溶液,以蛇床子素为参照,按选定的色谱条件测定,记录色谱图,计算相对保留时间与相对峰面积,考察其RSD,结果见表6~表11。
表6蛇床子药材重复性考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
重复性1 | 0.00861 | 0.0162 | 0.0790 | 0.0275 | 0.0408 | 0.0292 | 0.0571 | 0.274 | 1.000 | 0.00872 |
重复性2 | 0.00824 | 0.0152 | 0.0709 | 0.0277 | 0.0405 | 0.0274 | 0.0578 | 0.278 | 1.000 | 0.00858 |
重复性3 | 0.00809 | 0.0151 | 0.0698 | 0.0294 | 0.0411 | 0.0275 | 0.0576 | 0.280 | 1.000 | 0.00867 |
重复性4 | 0.00841 | 0.0163 | 0.0789 | 0.0277 | 0.0402 | 0.0286 | 0.0570 | 0.277 | 1.000 | 0.00870 |
重复性5 | 0.00829 | 0.0158 | 0.0738 | 0.0281 | 0.0418 | 0.0278 | 0.0583 | 0.276 | 1.000 | 0.00878 |
重复性6 | 0.0084 | 0.0161 | 0.0739 | 0.0289 | 0.0415 | 0.0288 | 0.0572 | 0.278 | 1.000 | 0.00861 |
RSD(%) | 2.2 | 3.3 | 5.3 | 2.8 | 1.5 | 2.7 | 0.9 | 0.8 | 0.0 | 0.9 |
表7蛇床子药材重复性考察结果(相对保留时间)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
重复性1 | 0.306 | 0.379 | 0.512 | 0.540 | 0.684 | 0.707 | 0.730 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
重复性2 | 0.306 | 0.379 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.707 | 0.730 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
重复性3 | 0.306 | 0.379 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.707 | 0.729 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
重复性4 | 0.306 | 0.379 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
重复性5 | 0.306 | 0.378 | 0.512 | 0.539 | 0.683 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
重复性6 | 0.306 | 0.378 | 0.512 | 0.539 | 0.683 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.000 | 1.045 |
RSD(%) | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
表8蛇床子总香豆素原料重复性考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
重复性1 | 0.000151 | 0.000288 | 0.000280 | 0.0000940 | 0.00150 | 0.00144 | 0.0131 | 1.000 | 0.000124 |
重复性2 | 0.000140 | 0.000255 | 0.000276 | 0.0000892 | 0.00137 | 0.00128 | 0.0128 | 1.000 | 0.000128 |
重复性3 | 0.000145 | 0.000264 | 0.000281 | 0.0000938 | 0.00141 | 0.00134 | 0.0132 | 1.000 | 0.000130 |
重复性4 | 0.000144 | 0.000263 | 0.000273 | 0.0000963 | 0.00141 | 0.00130 | 0.0129 | 1.000 | 0.000125 |
重复性5 | 0.000149 | 0.000274 | 0.000273 | 0.0000961 | 0.00145 | 0.00133 | 0.0128 | 1.000 | 0.000126 |
重复性6 | 0.000165 | 0.000316 | 0.000278 | 0.0001053 | 0.00160 | 0.00144 | 0.0124 | 1.000 | 0.000115 |
RSD(%) | 5.9 | 8.1 | 1.3 | 5.6 | 5.7 | 5.2 | 2.2 | 0.0 | 4.2 |
表9蛇床子总香豆素原料重复性考察结果(相对保留时间)
表10蛇床子总香豆素软膏重复性试验考察结果(相对保留时间)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
重复性1 | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.684 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
重复性2 | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.684 | 0.706 | 0.730 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
重复性3 | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.684 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
重复性4 | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.706 | 0.730 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
重复性5 | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.685 | 0.707 | 0.732 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
重复性6 | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.685 | 0.708 | 0.732 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
RSD(%) | 0.2 | 0.2 | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
表11蛇床子总香豆素软膏重复性试验考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
重复性1 | 0.000459 | 0.000223 | 0.00175 | 0.000450 | 0.00118 | 0.00398 | 0.0761 | 1.000 | 0.00146 |
重复性2 | 0.000463 | 0.000269 | 0.00174 | 0.000446 | 0.00119 | 0.00402 | 0.0781 | 1.000 | 0.00147 |
重复性3 | 0.000473 | 0.000269 | 0.00175 | 0.000446 | 0.00119 | 0.00396 | 0.0764 | 1.000 | 0.00148 |
重复性4 | 0.000463 | 0.000252 | 0.00177 | 0.000438 | 0.00119 | 0.00400 | 0.0758 | 1.000 | 0.00147 |
重复性5 | 0.000462 | 0.000268 | 0.00175 | 0.000456 | 0.00117 | 0.00392 | 0.0777 | 1.000 | 0.00145 |
重复性6 | 0.000457 | 0.000193 | 0.00171 | 0.000450 | 0.00115 | 0.00386 | 0.0754 | 1.000 | 0.00146 |
RSD(%) | 1.2 | 12.8 | 1.2 | 1.4 | 1.4 | 1.5 | 1.5 | 0.0 | 0.8 |
5.3.2试验结论
(1)重复测定6份蛇床子药材样品,各特征峰相对峰面积RSD在0.8%~5.3%范围内,相对保留时间RSD在0.0%~0.2%范围内,表明该特征图谱分析方法重复性良好。
(2)重复测定6份蛇床子总香豆素原料样品,各特征峰相对保留时间RSD 在0.0%~0.1%范围内,相对峰面积RSD在1.3%~8.1%范围内,表明该特征图谱分析方法重复性良好。
(3)重复测定6份蛇床子总香豆素软膏样品,各特征峰相对保留时间RSD 在0.0%~0.2%范围内,相对峰面积RSD在0.8%~12.8%范围内,表明该特征图谱分析方法重复性良好。
5.4中间精密度
5.4.1操作方法
由其他分析人员在不同日期、不同色谱仪、不同批号色谱柱下操作,取同一批蛇床子药材、提取物及软膏样品,按照4.2对照品及样品制备项下方法,分别平行制备各6份供试品溶液,以蛇床子素为参照,按选定的色谱条件测定,记录色谱图,计算相对保留时间与相对峰面积,实验结果见表12~表17。
表12蛇床子药材中间精密度考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
中间精密度1 | 0.0115 | 0.0160 | 0.0710 | 0.0306 | 0.0409 | 0.0279 | 0.0542 | 0.265 | 1.0000 | 0.00753 |
中间精密度2 | 0.0119 | 0.0157 | 0.0680 | 0.0299 | 0.0404 | 0.0268 | 0.0542 | 0.266 | 1.0000 | 0.00750 |
中间精密度3 | 0.0114 | 0.0160 | 0.0691 | 0.0306 | 0.0412 | 0.0277 | 0.0532 | 0.266 | 1.0000 | 0.00741 |
中间精密度4 | 0.0116 | 0.0158 | 0.0696 | 0.0310 | 0.0410 | 0.0279 | 0.0539 | 0.266 | 1.0000 | 0.00752 |
中间精密度5 | 0.0103 | 0.0127 | 0.0535 | 0.031O | 0.0423 | 0.0226 | 0.0577 | 0.265 | 1.0000 | 0.00704 |
中间精密度6 | 0.011O | 0.0143 | 0.0594 | 0.0302 | 0.0412 | 0.0247 | 0.0561 | 0.266 | 1.0000 | 0.00724 |
RSD(%) | 5.0 | 8.9 | 10.8 | 1.5 | 1.6 | 8.3 | 3.1 | 0.2 | 0.0 | 2.7 |
与重复性RsD(%) | 16.2 | 6.7 | 10.4 | 4.6 | 1.5 | 6.8 | 3.2 | 2.3 | 0.0 | 8.7 |
表13蛇床子药材中间精密度考察结果(相对保留时间)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
中间精密度1 | 0.308 | 0.386 | 0.532 | 0.560 | 0.717 | 0.746 | 0.766 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度2 | 0.308 | 0.386 | 0.531 | 0.560 | 0.716 | 0.745 | 0.765 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度3 | 0.308 | 0.386 | 0.531 | 0.560 | 0.716 | 0.745 | 0.766 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度4 | 0.308 | 0.386 | 0.531 | 0.560 | 0.716 | 0.745 | 0.765 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度5 | 0.308 | 0.386 | 0.531 | 0.560 | 0.716 | 0.745 | 0.765 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度6 | 0.308 | 0.386 | 0.531 | 0.559 | 0.716 | 0.745 | 0.765 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
RSD(%) | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.1 |
与重复性RSD(%) | 0.4 | 1.1 | 2.0 | 2.0 | 2.5 | 2.8 | 2.6 | 0.1 | 0.0 | 0.2 |
表14蛇床子总香豆素原料中间精密度考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
中间精密度1 | 0.000226 | 0.000334 | 0.000372 | 0.0000625 | 0.00193 | 0.00151 | 0.0174 | 1.0000 | 0.000170 |
中间精密度2 | 0.000226 | 0.000334 | 0.000371 | 0.0000570 | 0.00195 | 0.00156 | 0.0175 | 1.0000 | 0.000171 |
中间精密度3 | 0.000237 | 0.000361 | 0.000372 | 0.0000560 | 0.00200 | 0.00159 | 0.0180 | 1.0000 | 0.000173 |
中间精密度4 | 0.000232 | 0.000338 | 0.000364 | 0.0000620 | 0.00196 | 0.00155 | 0.0176 | 1.0000 | 0.000173 |
中间精密度5 | 0.000230 | 0.000339 | 0.000361 | 0.0000510 | 0.00197 | 0.00155 | 0.0177 | 1.0000 | 0.000163 |
中间精密度6 | 0.000250 | 0.000360 | 0.000388 | 0.0000620 | 0.00211 | 0.00166 | 0.0190 | 1.0000 | 0.000187 |
RSD(%) | 3.9 | 3.7 | 2.6 | 7.9 | 3.3 | 3.3 | 3.4 | 0.0 | 4.6 |
与重复性RSD% | 23.6 | 13.0 | 16.0 | 26.4 | 16.6 | 8.6 | 17.3 | 0.0 | 17.5 |
表15蛇床子总香豆素原料中间精密度考察结果(相对保留时间)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
中间精密度1 | 0.3855 | 0.5322 | 0.5602 | 0.7174 | 0.7462 | 0.7698 | 0.9795 | 1.0000 | 1.0486 |
中间精密度2 | 0.3854 | 0.5323 | 0.5603 | 0.7168 | 0.7461 | 0.7698 | 0.9795 | 1.0000 | 1.0485 |
中间精密度3 | 0.3854 | 0.5320 | 0.5599 | 0.7160 | 0.7457 | 0.7695 | 0.9795 | 1.0000 | 1.0485 |
中间精密度4 | 0.3854 | 0.5319 | 0.5601 | 0.7161 | 0.7453 | 0.7690 | 0.9794 | 1.0000 | 1.0485 |
中间精密度5 | 0.3855 | 0.5321 | 0.5600 | 0.7164 | 0.7457 | 0.7689 | 0.9793 | 1.0000 | 1.0485 |
中间精密度6 | 0.3857 | 0.5321 | 0.5602 | 0.7178 | 0.7456 | 0.7692 | 0.9794 | 1.0000 | 1.0486 |
RSD(%) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
与重复性RsD(%) | 1.0 | 2.1 | 1.9 | 2.5 | 2.9 | 2.9 | 0.1 | 0.0 | 0.2 |
表16蛇床子总香豆素软膏中间精密度试验考察结果(相对峰面积)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
中间精密度1 | 0.000388 | 0.000259 | 0.00182 | 0.000442 | 0.00120 | 0.00409 | 0.0762 | 1.0000 | 0.00136 |
中间精密度2 | 0.000415 | 0.000254 | 0.00185 | 0.000461 | 0.00118 | 0.00430 | 0.0783 | 1.0000 | 0.00137 |
中间精密度3 | 0.000415 | 0.000249 | 0.00177 | 0.000478 | 0.00132 | 0.00434 | 0.0743 | 1.0000 | 0.00135 |
中间精密度4 | 0.000403 | 0.000284 | 0.00182 | 0.000447 | 0.00123 | 0.00422 | 0.0790 | 1.0000 | 0.00144 |
中间精密度5 | 0.000389 | 0.000248 | 0.00175 | 0.000453 | 0.00123 | 0.00424 | 0.0787 | 1.0000 | 0.00144 |
中间精密度6 | 0.000385 | 0.000194 | 0.00176 | 0.000439 | 0.00123 | 0.00425 | 0.0755 | 1.0000 | 0.00134 |
RSD(%) | 3.5 | 12.0 | 2.3 | 3.2 | 3.9 | 2.1 | 2.6 | 0.0 | 3.3 |
与重复性RSD% | 8.1 | 16.5 | 2.3 | 6.3 | 7.1 | 7.1 | 2.0 | 0.0 | 3.8 |
表17蛇床子总香豆素软膏中间精密度试验考察结果(相对保留时间)
样品名称 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
中间精密度1 | 0.386 | 0.533 | 0.561 | 0.717 | 0.747 | 0.768 | 0.979 | 1.000 | 1.048 |
中间精密度2 | 0.386 | 0.532 | 0.561 | 0.717 | 0.747 | 0.768 | 0.979 | 1.000 | 1.049 |
中间精密度3 | 0.386 | 0.532 | 0.560 | 0.717 | 0.747 | 0.768 | 0.979 | 1.000 | 1.048 |
中间精密度4 | 0.386 | 0.532 | 0.560 | 0.718 | 0.747 | 0.768 | 0.979 | 1.000 | 1.048 |
中间精密度5 | 0.386 | 0.532 | 0.560 | 0.717 | 0.746 | 0.767 | 0.979 | 1.000 | 1.048 |
中间精密度6 | 0.386 | 0.532 | 0.560 | 0.716 | 0.747 | 0.768 | 0.979 | 1.000 | 1.048 |
RSD(%) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 | 0.0 | 0.1 |
与重复性RSD(%) | 1.1 | 2.0 | 1.9 | 2.5 | 2.9 | 2.7 | 0.1 | 0.0 | 0.2 |
5.4.2试验结论
(1)不同分析人员在不同日期、不同色谱仪、不同批号色谱柱下操作,10 个共有特征峰相对保留时间RSD在0.0%~0.1%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在0.1%~2.8%范围内,10个共有特征峰相对峰面积RSD在0.2%~10.8%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在1.5%~16.2%范围内,该特征图谱分析方法中间精密度符合要求。
(2)不同分析人员在不同日期、不同色谱仪、不同批号色谱柱下操作,蛇床子总香豆素原料中9个共有特征峰相对保留时间RSD在0.1%~0.2%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在0.1%~2.9%范围内,9个共有特征峰相对峰面积RSD在2.6%~7.9%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在8.6%~26.4%范围内,该特征图谱分析方法中间精密度符合要求。
(3)不同分析人员在不同日期、不同色谱仪、不同批号色谱柱下操作,蛇床子总香豆素软膏中9个共有特征峰相对保留时间RSD在0.0%~0.1%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在0.1%~2.9%范围内,9个共有特征峰相对峰面积RSD在2.1%~12.0%范围内,与重复性试验6个数据的RSD在2.0%~16.5%范围内,该特征图谱分析方法中间精密度符合要求。
5.5稳定性试验
5.5.1试验方法
按照4.2项下方法,制备药材、提取物及软膏供试品溶液,室温放置,分别在0、21、40、60、87、94小时进样。结果见表18~表23。
表18蛇床子药材供试品溶液稳定性考察结果(相对峰面积)
时间 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
0h | 0.00862 | 0.0161 | 0.0758 | 0.0273 | 0.0404 | 0.0286 | 0.0566 | 0.276 | 1.00 | 0.00882 |
21h | 0.00850 | 0.0164 | 0.0757 | 0.0271 | 0.0404 | 0.0286 | 0.0566 | 0.277 | 1.00 | 0.00882 |
40h | 0.00853 | 0.0164 | 0.0758 | 0.0270 | 0.0402 | 0.0286 | 0.0566 | 0.276 | 1.00 | 0.00878 |
60h | 0.00858 | 0.0164 | 0.0758 | 0.0272 | 0.0403 | 0.0286 | 0.0565 | 0.276 | 1.00 | 0.00884 |
87h | 0.00823 | 0.0164 | 0.0764 | 0.0271 | 0.0396 | 0.0284 | 0.0561 | 0.269 | 1.00 | 0.00861 |
94h | 0.00817 | 0.0165 | 0.0766 | 0.0273 | 0.0395 | 0.0283 | 0.0559 | 0.269 | 1.00 | 0.00857 |
RSD(%) | 2.3 | 0.9 | 0.6 | 0.5 | 1.1 | 0.5 | 0.6 | 1.4 | 0.0 | 1.4 |
表19蛇床子药材供试品溶液稳定性考察结果(相对保留时间)
时间 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 | 峰10 |
0h | 0.306 | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.685 | 0.709 | 0.732 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
21h | 0.306 | 0.379 | 0.512 | 0.540 | 0.684 | 0.707 | 0.730 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
40h | 0.306 | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
60h | 0.306 | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.685 | 0.708 | 0.731 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
87h | 0.305 | 0.378 | 0.511 | 0.539 | 0.681 | 0.705 | 0.727 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
94h | 0.305 | 0.378 | 0.511 | 0.538 | 0.681 | 0.705 | 0.727 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
RSD(%) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
表20蛇床子总香豆素原料稳定性考察结果(相对峰面积)
时间 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
0h | 0.000118 | 0.000211 | 0.000284 | 0.0000789 | 0.00116 | 0.00101 | 0.0139 | 1.000 | 0.000148 |
21h | 0.000119 | 0.000203 | 0.000271 | 0.0000835 | 0.00117 | 0.00102 | 0.0139 | 1.000 | 0.000145 |
40h | 0.000121 | 0.000197 | 0.000278 | 0.0000830 | 0.00118 | 0.00102 | 0.0138 | 1.000 | 0.000147 |
60h | 0.000121 | 0.000204 | 0.000272 | 0.0000813 | 0.00117 | 0.00100 | 0.0137 | 1.000 | 0.000145 |
87h | 0.000120 | 0.000209 | 0.000268 | 0.0000819 | 0.00118 | 0.00102 | 0.0134 | 1.000 | 0.000153 |
94h | 0.000123 | 0.000204 | 0.000279 | 0.0000850 | 0.00118 | 0.00102 | 0.0135 | 1.000 | 0.000148 |
RSD(%) | 1.5 | 2.5 | 2.2 | 2.6 | 0.7 | 0.9 | 1.6 | 0.0 | 2.0 |
表21蛇床子总香豆素原料稳定性考察结果(相对保留时间)
表22蛇床子总香豆素软膏稳定性试验考察结果(相对峰面积)
时间 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
0h | 0.000467 | 0.000264 | 0.00184 | 0.000460 | 0.00122 | 0.00418 | 0.0752 | 1.000 | 0.00148 |
21h | 0.000482 | 0.000253 | 0.00179 | 0.000477 | 0.00123 | 0.00420 | 0.0752 | 1.000 | 0.00144 |
40h | 0.000466 | 0.000226 | 0.00178 | 0.000486 | 0.00125 | 0.00417 | 0.0753 | 1.000 | 0.00145 |
60h | 0.000493 | 0.000259 | 0.00181 | 0.000489 | 0.00126 | 0.00449 | 0.0752 | 1.000 | 0.00147 |
87h | 0.000465 | 0.000272 | 0.00177 | 0.000481 | 0.00124 | 0.00418 | 0.0733 | 1.000 | 0.00141 |
94h | 0.000399 | 0.000274 | 0.00174 | 0.000458 | 0.00126 | 0.00419 | 0.0731 | 1.000 | 0.00142 |
RSD(%) | 7.2 | 6.8 | 2.0 | 2.8 | 1.4 | 3.0 | 1.5 | 0.0 | 1.9 |
表23蛇床子总香豆素软膏稳定性试验考察结果(相对保留时间)
时间 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4 | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9 |
0h | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.685 | 0.708 | 0.732 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
21h | 0.378 | 0.513 | 0.540 | 0.684 | 0.706 | 0.730 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
40h | 0.378 | 0.512 | 0.540 | 0.683 | 0.706 | 0.729 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
60h | 0.379 | 0.513 | 0.541 | 0.684 | 0.707 | 0.731 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
87h | 0.377 | 0.511 | 0.538 | 0.681 | 0.704 | 0.727 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
94h | 0.377 | 0.510 | 0.538 | 0.680 | 0.703 | 0.726 | 0.979 | 1.00 | 1.045 |
RSD(%) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.4 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
5.5.2试验结论
(1)在室温放置94小时内,蛇床子药材供试品溶液中10个共有特征峰相对保留时间RSD在0.0%~0.3%范围内,相对峰面积RSD在0.5%~2.3%范围内,表明供试品溶液在室温条件下94小时内稳定性良好。
(2)在室温放置94小时内,蛇床子总香豆素原料供试品溶液9个共有特征峰相对保留时间RSD在0.0%~0.3%范围内,相对峰面积RSD在0.7%~2.6%范围内,表明供试品溶液在室温放置94小时内稳定性良好。
(3)在室温放置94小时内,蛇床子总香豆素软膏供试品溶液9个共有特征峰相对保留时间RSD在0.0%~0.4%范围内,相对峰面积RSD在1.4%~7.2%范围内,表明供试品溶液室温放置94小时内稳定性良好。
6、样品指纹图谱建立与分析
6.1指纹图谱的建立及相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行指纹图谱分析,汇总多批样品数据(不低于15批),采用多点校正后进行自动匹配,用中位数法生成对照指纹图谱。
6.2指纹图谱共有峰的指认与归属
(1)采用液相色谱-高分辨质谱全扫描数据采集:制备蛇床子药材供试品、蛇床子总提取物供试品、蛇床子制剂供试品、蛇床子制剂阴性对照供试品(即除蛇床子外,取其余辅料),同上述指纹图谱开发的液相方法进样,液相色谱-高分辨质谱的全扫描分析。并使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对15批蛇床子药材特征图谱进行共有峰标识,以蛇床子素为参照峰(即S峰),选择其中相对保留时间和相对峰面积较为稳定的共有峰作为特征峰。
(2)组分确认:结合样品的源数据,对上述软件中所获得的特征组分进行提取与确认。
(3)组分化学结构式推测与确认:利用专有的中药成分数据库及软件,对蛇床子(药材、提取物、制剂)中蛇床子的特有化学成分进行结构的解析、归属指认和确证。
(4)形成蛇床子(药材、提取物、制剂)中蛇床子的化学成分研究总结报告及建立标准指纹图谱。
结论:本发明中中药材蛇床子及对照药材均符合现行版中国药典的质量标准,蛇床子总香豆素原料及蛇床子总香豆素软膏的制备及检验均按照国家药品生产 GMP实施。为了考察产品的稳定性及提高产品的质量标准,本发明研究了本发明中药材蛇床子、中药材蛇床子总提取物(蛇床子总香豆素)及蛇床子总香豆素软膏的指纹图谱,分别对不同批次的15份样品按优化后建立的方法进行了提取和测定分析,指纹图谱中筛选出有代表性的7个共有峰,并进行了指认,且各峰之间的分离度较好,15批之间的指纹图谱相似度均大于90%,说明本品产品是稳定可控的。15批药材的特征图谱(指纹图谱)见图6;15批蛇床子药材提取物(蛇床子总香豆素)的特征图谱(指纹图谱)见图7;15批蛇床子药材提取物 (蛇床子总香豆素)制成的制剂(蛇床子总香豆素软膏)的特征图谱(指纹图谱) 见图8。对蛇床子药材未知峰(10号峰)的相关鉴定详见图9~图14。
(1)通过高分辨质谱定性以及与蛇床子药材特征图谱共有特征峰进行比对,并选用多个对照品定位指认,确定蛇床子药材特征图谱中峰1:对香豆酸,峰2:花椒毒酚,峰3:橙皮内酯水合物,峰4:花椒毒素,峰5:异茴芹素,峰6:橙皮内酯,峰7:佛手柑内酯,峰8:欧前胡素,峰9:蛇床子素,峰10:佛手柑素。
(2)通过高分辨质谱定性以及与蛇床子总香豆素原料特征图谱共有特征峰进行比对,并选用多个对照品定位指认,确定蛇床子总香豆素原料特征图谱中峰 1:花椒毒酚,峰2:橙皮内酯水合物,峰3:花椒毒素,峰4:异茴芹素,峰5:橙皮内酯,峰6:佛手柑内酯,峰7:欧前胡素,峰8:蛇床子素,峰9:佛手柑素。
(3)通过高分辨质谱定性以及与蛇床子总香豆素软膏特征图谱共有特征峰进行比对,并选用多个对照品定位指认,确定蛇床子总香豆素软膏特征图谱中峰 1:花椒毒酚,峰2:橙皮内酯水合物,峰3:花椒毒素,峰4:异茴芹素,峰5:橙皮内酯,峰6:佛手柑内酯,峰7:欧前胡素,峰8:蛇床子素,峰9:佛手柑素。
(4)通过高分辨质谱定性以及与蛇床子药材特征图谱共有特征峰进行比对,对保留时间为86.49分钟的10号未知色谱峰进行了鉴定。其UV色谱图中,取其相应的一级质谱图与提取离子流图,如图11及图12所示。该色谱峰一级质谱质荷比为361.14060、339.15885和203.03382,其中339和361离子分别为该化合物[M+H]和[M+Na]离子,203为其主要碎片离子。计算该化合物分子式为 C21H22O4。其质谱图见11。提取相应化合物的二级质谱图,见图12。
将该二级图谱与标准数据库比较,10号未知物(保留时间86.49分钟)的二级质谱与佛手柑素的标准二级图谱一致。标准数据库中佛手柑素的图谱链接及标准图谱,见图13。因此推测该化合物为佛手柑素,其结构式见图14。
佛手柑素化合物的信息如下:
中文名:佛手柑素
英文名:Bergamottin
分子式:C21H22O4
分子量:338.40
CAS号:7380-40-7。
(5)通过以上高分辨质谱定性以及与蛇床子药材、蛇床子总香豆素及蛇床子总香豆素软膏的特征图谱共有特征峰进行比对,确认蛇床子药材中10号峰、蛇床子总香豆素9号峰及蛇床子总香豆素软膏9号峰为佛手柑素。这也是首次在蛇床子药材中鉴定出佛手柑素成分的存在。
实施例4
蛇床子始载于《神农本草经》,列为上品,味苦辛、性温、归脾肾两经。功能主治温肾壮阳,燥湿,祛风,杀虫。临床常用于阳痿,宫冷不孕,寒湿带下,湿痹腰痛;外治外阴湿疹、皮肤瘙痒、妇女阴痒、滴虫性阴道炎等。据近代药理研究,蛇床子具有抗组织胺、抗真菌、抗肿瘤等作用。
以下通过临床试验来说明本申请实施例2中的蛇床子总香豆素软膏对于带状疱疹、银屑病、特应性皮炎的治疗效果:
患者1,男,64岁,2021年1月26日主诉左大腿(L3单个皮肤区域)内侧局部皮肤疼痛(压扁)、瘙痒、烧灼感5天,红疹、水疱2天。
体查:左L3单个皮肤区域红或暗红色丘疱疹,部分水疱集簇、脐凹、结痂形成。局部皮肤压扁,左腹股沟2个淋巴结肿大,表面光滑无粘连,轻压痛。
临床诊断:带状疱疹。
治疗:自用皮康霜2天,继用皮炎平3天,症状未见缓解,甚至加重。经过外用蛇床子总香豆素软膏局部治疗3天,每日两次,症状明显缓解;继续用药:每日一次4天;隔日一次8天。
愈后至今未见复发(详见图15)。治疗过程中无不良反应。
患者2,男,54岁,患银屑病长达23年,多种方法治疗获效甚微。经蛇床子总香豆素软膏外用治疗愈后至今未见复发(详见图16-17,其中图16为腹部,图17为背部)。治疗过程中无不良反应。
患者3,女,5岁,患特应性皮炎3年。经蛇床子总香豆素软膏外用治疗愈后至今未见复发(详见图18-19,其中图18为膝盖窝,图19为耳朵)。治疗过程中无不良反应。
此外,本申请中含有佛手柑素的蛇床子总香豆素以及蛇床子总香豆素制剂具有显著的抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂作用;能明显增加大鼠尾部皮肤鳞片中有颗粒层形成的鳞片数;对大鼠被动皮肤过敏反应具有较强的抑制作用;具有显著抑制由巴豆油引致的小鼠耳肿胀作用或由鸡蛋清引致的大鼠足肿胀作用;能显著提高由磷酸组织胺对豚鼠的致痒阈,表明具有显著的止痒作用(其效果可参阅发明人早期申请专利200410079250.5、02114903.8),进一步说明了本申请中的含有佛手柑素的蛇床子总香豆素以及蛇床子总香豆素制剂具有普通蛇床子总提取物的功效,对于过敏变态反应性皮肤病(包括湿疹、特应性皮炎等)、银屑病、带状疱疹病理机制特点作用,改变此类疾病的病理变化,改善临床症状,起效快、疗效高、不良反应少,同时具有对人体的局部调整作用。
综上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等,都涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛇床子总提取物,其特征是:含有佛手柑素。
2.根据权利要求1所述的蛇床子总提取物,其特征是:还含有花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物和橙皮内酯。
3.权利要求1或2所述的蛇床子总提取物在制备具有预防和/或治疗过敏变态反应性皮肤病、银屑病或带状疱疹的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述过敏变态反应性皮肤病包括变态反应性接触性皮炎、特应性皮炎、湿疹、荨麻疹和药疹。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述药物包括蛇床子总提取物加上药学上可接受的载体或辅料制成。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征是:所述药物为含有蛇床子总提取物的蛇床子软膏、蛇床子喷雾或蛇床子液体剂。
7.一种蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法,其特征是包括以下步骤:
(1)混合对照品溶液制备:取对香豆酸、蛇床子素、异茴芹素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素对照品,用乙醇溶解,得混合对照品溶液;
(2)供试品溶液制备:取蛇床子总提取物,加入乙醇,超声处理后,用乙醇补足减失质量,混匀,过滤,取滤液,得供试品溶液;
(3)取混合对照品溶液、供试品溶液,进样,采用液相色谱-高分辨质谱全扫描分析,使用软件对供试品特征图谱进行共有峰标识,对特征组分进行提取与确认,对蛇床子的特有化学成分进行结构的解析、归属指认和确证,获得蛇床子的化学成分,建立蛇床子总提取物的标准指纹图谱。
8.根据权利要求7所述蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法,其特征是:步骤(2)中所述乙醇的体积百分含量为70%,所述总蛇床子提取物与乙醇的用量关系为0.05g:50mL,超声处理时间为60min。
9.根据权利要求7所述蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法,其特征是:步骤(3)中液相色谱的参数如下:色谱条件:C18色谱柱;流速:0.5mL/min;柱温:40℃;波长:310nm;进样体积:10μL;流动相A:0.1%(体积百分含量)乙酸水溶液;流动相B:甲醇,梯度洗脱条件如下:
。
10.根据权利要求7所述蛇床子总提取物指纹图谱的构建方法,其特征是:步骤(3)中蛇床子提取物的标准指纹图谱包括以下化合物:花椒毒酚、花椒毒素、异茴芹素、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、橙皮内酯水合物、橙皮内酯和佛手柑素。
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