CN108693269B - 不同咖啡萃取方式特征标志物及其筛选方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及液相色谱‑质谱检测领域，具体而言，涉及不同咖啡萃取方式特征标志物及其筛选方法与应用。所述方法包括：1)按咖啡样品的萃取方式分组得到标准样品；2)对各组标准样品进行液相色谱‑质谱联用分析；3)对所得数据进行统计分析，得到各组标准样品中的差异物质；4)表征所述差异物质的结构。该特征标志物的筛选方法的优点是简单，快速，准确，稳定，并且是首次以基于超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间高分辨质谱技术的非靶向代谢组学技术应用于咖啡冲的鉴别；本发明所述的方法对于加强咖啡冲泡方式鉴别的研究，探索冲泡过程中咖啡组分的变化，提高咖啡品质，保证消费者的健康等具有重要的意义。

Description

不同咖啡萃取方式特征标志物及其筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及液相色谱-质谱检测领域，具体而言，涉及不同咖啡萃取方式特征标志物及其筛选方法与应用。

背景技术

“咖啡”一词源自希腊语“Kaweh”，意思是“力量与热情”。咖啡与茶叶、可可并称为世界三大饮料植物，全球人口每天会喝掉20多亿杯咖啡，是世界第二大大宗商品，仅次于原油。咖啡树是属茜草科常绿小乔木，日常饮用的咖啡是用咖啡豆配合各种不同的烹煮器具制作出来的，而咖啡豆就是指咖啡树果实里面的果仁用适当的方法烘焙而成的产品。

2016年度全球咖啡产量预计达到155697千包，同比增长率1.5％。产量方面，预计2016年全球咖啡产量前五国家(地区)分别是巴西、越南、哥伦比亚、印度尼西亚以及埃塞俄比亚，其中巴西预计年产量为55950千包；消费方面预计2016年全球咖啡消费前五国家(地区)依次是欧盟、美国、巴西、日本以及菲律宾，其中欧盟的消费量高达43900千包。

由于在中国传统文化中一直占据着垄断地位的茶文化，使咖啡文化在中国的发展极为缓慢。但随着人们消费观念的转变，西方的商品及消费习惯慢慢被接受，越来越多的人开始喜欢上咖啡饮品。在中国这个咖啡市场基数很小的人口大国，正在创造世界上最迅猛的涨势，平均每年消费增长超过25％，超过世界平均水平的10倍。同时，我国咖啡种植面积也在稳步增长。2013年我国咖啡种植面积达9.72万公顷，较上年同期增长3.3％。2013年种植面积为2001年种植面积的4倍。2014年我国咖啡种植面积约12.86万公顷。2015年我国咖啡种植面积达到了13万公顷。经过近十年的告诉发展，目前我国咖啡行业已经呈现了两大趋势：现磨咖啡的发展潜力大于速溶咖啡；咖啡消费渠道朝着多元化发展。随着消费者的咖啡消费品味越来越高，速溶咖啡已经远远不能代表咖啡行业了，消费者开始认知咖啡的品牌、风格和纯正度，并且希望享受咖啡带来的乐趣，办公、家庭咖啡机的普及，为消费者的咖啡豆消费提供了便利条件。在世界各地，人们越来越爱喝咖啡。无论在家里、还是在办公室、或是各种社交场合，人们都在品着咖啡、它逐渐与时尚、现代生活联系在一起。

不同品种、产地的咖啡豆，其外观色泽、气味以及内部化学成分存在很大差异，从而在风味、口味方面会产生差异，进一步反映在咖啡的价格上。同时，为了满足人们对差异化消费的需求，市场上不断涌现出不同冲泡方式的咖啡。相同品种的咖啡豆，因冲泡方式的不同也会对咖啡的风味和口感产生较大影响，价格也有较大差异，所以，对不同冲泡方式的咖啡进行鉴别对消费者具有重要意义。

目前针对咖啡的鉴别主要集中在咖啡品种、产地及烘焙度的鉴别。一般地，人们通过观察咖啡豆的外观、色泽等，或利用化学方法来检测咖啡豆品质的变化。已有的鉴别不同品种和产地的咖啡(豆)技术包括传统的液相色谱、气相色谱、电子鼻、电子舌等，同样也包括结合化学计量学的光谱技术、核磁共振技术以及新兴的组学技术。现有的咖啡鉴别方法主要基于某一类化合物的基础上，将某一个目标物在作为潜在的标志物。但是，咖啡是一种天然的并且组分极其复杂的产品，根据品种和产地不同而具有多种大量的化合物，且加上不同冲泡方式的影响。因此，根据原先主观假设的一类化合物寻找出某一种可靠的标志物鉴别其冲泡方式是十分困难也不科学的。采用非靶向比较代谢组学探索特定的标记物可以解决这个问题。非靶向代谢组学通过分析数据集中的全部信息尽可能多的获得一个复杂样品中的全部代谢产物。这同时就需要借助化学计量学来分析这庞大的数据特别是复杂数据的大样本集，并建立可靠模型。最近，液相色谱串联质谱在非靶向分析确定代谢物中得到广泛应用，因为该技术能够在前端的分离系统中将各种化学组分在复杂的混合物中分离出来，并在后端的质谱系统中获得准确的质量信息。本发明就是一种借助液相色谱串联质谱对咖啡中代谢物的研究，筛选出用于鉴别咖啡冲泡方式标志物的方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是针对现有存在的需求，提供一种筛选用于鉴别咖啡冲泡方式标志物的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种不同咖啡萃取方式特征标志物的筛选方法，包括如下步骤：

1)按咖啡样品的萃取方式分组得到标准样品；

2)对各组标准样品进行液相色谱-质谱联用分析；

3)对所得数据进行统计分析，得到各组标准样品中的差异物质；

4)表征所述差异物质的结构。

本发明所述的特征标志物的筛选方法是从大量的数据中筛查和识别标志物，特征标志物的确定更加客观精准，因此，采用该方法确定得到的特征标志物进行咖啡萃取方式的鉴别也更加的准确。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述方法，或所述方法筛选得到的特征标志物在鉴别咖啡萃取方式中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)该特征标志物的筛选方法的优点是简单，快速，准确，稳定，并且是首次以基于超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间高分辨质谱技术的非靶向代谢组学技术应用于不同萃取方式咖啡的鉴别；

(2)本发明所述的方法将不同萃取方式咖啡的超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间高分辨质谱非靶向组学数据与化学计量学方法相结合，获得用于鉴别不同萃取方式咖啡的特征标志物，为咖啡萃取方式的鉴别研究、品质评价及质量控制提供了科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中冷萃咖啡的TIC谱图；

图2为本发明一个实施例中手冲咖啡的TIC谱图；

图3为本发明一个实施例中两种咖啡的代谢组学得分图。

具体实施方式

本发明涉及一种不同咖啡萃取方式特征标志物的筛选方法，包括如下步骤：

1)按咖啡样品的萃取方式分组得到标准样品；

2)对各组标准样品进行液相色谱-质谱联用分析；

3)对所得数据进行统计分析，得到各组标准样品中的差异物质；

4)表征所述差异物质的结构。

其中，为保证实验的一致性，在进行分组时，各组样品除了萃取方式不同外，其余参数，如咖啡种类、稀释时(如果需要)所用溶剂的种类均一致。

优选的，如上所述的方法，在步骤1)中，每组标准样品中含有多个不同产地的咖啡粉。

本发明中无任何复杂的样品前处理过程，保证了化合物信息的完整性，减少由于前处理过程而导致的化合物信息丢失，进而避免了潜在的特征标志物信息丢失。

为使得筛选得到的标志物更具有代表性，而非由于咖啡种类所导致，本申请进一步采用不同产地的咖啡粉进行混合得到标准样品。

作为一种优选方案，本发明步骤1)咖啡分组后，所述标准样品经液氮速冻后放入-80℃超低温冰箱保存待用。

优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，所述为高效液相色谱；

进行所述高效液相色谱时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；

正离子模式流动相A为0.15v/v％～0.25v/v％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；

负离子模式流动相A为1.5mM～2.5mM的乙酸铵，流动相B为0.15v/v％～0.25v/v％的甲酸水溶液；

更优选的，正离子模式流动相A为0.2v/v％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；

负离子模式流动相A为2mM的乙酸铵，流动相B为0.20v/v％的甲酸水溶液。

本发明的流动相水相中加入甲酸，甲酸的存在为待测物提供酸性环境，可提高离子化效率。负离子模式中加入了乙酸铵，可以增加离子检测的信号。

优选的，如上所述的方法，所述梯度洗脱的程序为：

0～8min时，流动相B 0v/v％～40v/v％；此时流动相A为100v/v％～60v/v％；

8～12min时，流动相B 40v/v％～100v/v％；此时流动相A为60v/v％～0v/v％；

12.1min时，0％B；此时流动相A为100v/v；而后以此条件运行1.5～2.5min；

优选的，所述梯度洗脱的流速为0.2～0.4mL/min；更优选为0.3mL/min；

优选的，色谱柱：Agilent C₁₈(2.1mm×100mm,1.8μm)；

优选的，柱温为35～45℃，也可以选择38℃、40℃或42℃；

优选的，进样量为15.0μL～25.0μL，也可选择18.0μL、22.0μL或20.0μL。

优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，所述质谱为四级杆/飞行时间高分辨率质谱；

所述四级杆/飞行时间高分辨率质谱的条件选自条件①～④中的至少一个：

①正离子模式和负离子模式的毛细管电压分别为3000v和3500v，喷嘴电压分别为1500v和200v；

②正模式和负模式的干燥气和鞘流气温度和流速分别为250℃，7L/min和325℃，11L/min，Nebulizer压力为35psig；

③全扫描质量轴范围为100–1700Da，Acquisition Rate 2 spectra/s，Acquisition Time 5000ms/spectrum；

④所有提取的质量数窗口设置为15.0ppm，保留时间窗口设置为0.15min，噪音设置为300counts；

其中上述条件①～④中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10％。

本发明所使用的超高效液相色谱-四级杆/飞行时间高分辨率质谱是以超高效液相色谱作为分离系统，四极杆/飞行时间质谱作为检测系统，经简单处理后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图，结合了超高液相色谱对复杂样品的高分离能力和高分辨质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。

四级杆/飞行时间高分辨率质谱仪在对特征标志物及其碎片结构解析过程中所有离子的偏差均小于1.0ppm，所以对化合物的结构信息解析的也更准确。

作为本发明实施例的一种优化方案，可采用Agilent超高效液相色谱-四级杆/飞行时间高分辨率质谱仪器配套软件Agilent Profinder对不同冲泡方式咖啡样品的数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐，并导出cef文件。随后将cef文件倒入然后导入MPP(MassProfiler Professional)软件中，计算每组样品和所述质量控制样品中初步特征标志物的RSD和绝对峰面积，进一步从所述初步特征标志物中筛选潜在特征标志物。

优选的，如上所述的方法，在步骤3)中，所述统计分析的方法包括：

a)对所有的数据进行色谱峰提取和峰对齐，得到每个标准样品的总离子流色谱图；

b)对所述总离子流色谱图中的绝对峰面积进行下列分析：

b1)T-test检验，选出P-Value＜0.05的组份；

b2)变化倍数分析，筛选出FC≥2的差异组分；

b3)绘制各组所述潜在特征标志物的变量重要性投影图，筛选VIP＞1的差异物质；和/或；绘制各组所述潜在特征标志物的维恩图，得到各组非交集的差异物质。

优选的，如上所述的方法，在步骤a)之后，b)之前还包括：

采用主成分分析方法对每组标准样品的所述初步特征标志物的质核比数据进行分析以初步判断不同萃取方式是否存在差异特征标志物；

进一步的，若每组的数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，则初步判断存在区分不同冲泡方式咖啡的特征标志物；

若每组的数据不能聚集在各自的95％置信限椭圆图内，和/或，数据之间不能够完全分离，则初步判断不同冲泡方式的咖啡不存在特征标志物。

优选的，如上所述的方法，在步骤4)中，表征所述差异物质的结构的方法为质谱法，质谱条件同如上所述的步骤2)。

具体可选的，采用Target模式对步骤3)获得的标志物进行结构二级质谱结构确证，质谱条件同步骤2)，二级质谱碰撞能量分别为10eV、20eV和40eV.接着利用PCDL软件与Metlin小分子代谢物数据库进行匹配，以及利用Masshunter定性软件对精确m/z值进行分子式匹配，对离子进行推断性鉴别；然后进行MS/MS分析，对得到的MS2碎片与Metlin数据库以及在线网络数据库Metlin(http://metlin.scripps.edu/)中的碎片信息进行比对，从而确证化合物。确定差异标志物。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述方法，或所述方法筛选得到的特征标志物在鉴别咖啡萃取方式中的应用。

优选的，如上所述的应用，所述特征标志物包括Norharman(CAS 244-63-3)，其在冷萃咖啡中无检出，仅存在于传统手冲咖啡中。

Norharman(CAS 244-63-3)的结构式如下所示：

优选的，如上所述的应用，所述咖啡萃取方式包括：

煮制咖啡、冰镇咖啡、冷萃咖啡、冰滴咖啡、手冲咖啡；或上述方法中的两种或多种萃取方法的组合。

其中，各种咖啡萃取方式优选可采用下列方法制得：

煮制咖啡又称热咖啡Hot Coffee

最常见的咖啡制作方法是利用92℃左右的热水，在两分多钟的时间内缓缓地、均匀地注入咖啡粉中。热水进入咖啡粉的空隙，并将蕴含在其中的风味萃取出来，透过滤纸滴到玻璃壶当中。

冰镇咖啡Iced Coffee

冰镇咖啡通常指用热水快速萃取咖啡粉、然后加冰块或急速降温后的冷饮咖啡，故属于热萃取法。

冷萃咖啡Cold Brew Coffee

通常指用低于5℃的冷水长时间低温浸泡咖啡粉，等待发酵，大约需要8-12小时，后将咖啡渣滤净。

冰滴咖啡Ice Drip Coffee

冰滴咖啡，又名荷兰式咖啡或者京都市咖啡，通常是采用冰块自然化水、冰水混合物或者冷水一滴一滴，滴出来的咖啡，与冷泡咖啡的“水浸泡咖啡”不同。

手冲咖啡Pour Over Coffee

手冲咖啡一般不再是通过浸泡的原则来制作咖啡，而是通过滤杯和滤纸，水通过咖啡粉而产生的。制作手冲咖啡必要的器具通常有磨豆机、手冲壶、滤杯和滤纸。

上述咖啡的萃取方法为本领域常见方法，在本申请的一些具体的实施方式中，可采用下述方式萃取咖啡：

手冲咖啡：取2g咖啡粉样品于咖啡滤纸中并置于漏斗上，取60ml煮沸的纯水倒入，取2min内滤液即为手冲咖啡样品；煮制咖啡：取2g咖啡粉样品和60ml煮沸纯水混合于烧杯中，并置于沸水中，保温5min，即为煮制咖啡样品；冷萃咖啡：取2g咖啡粉样品和60ml常温纯水，混合置于瓶中，4℃保温12h即为冷萃咖啡样品。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一种基于代谢组学鉴别手冲咖啡和冷萃咖啡的方法，所述方法包括如下步骤：

1.咖啡样品制备

1.1从埃塞俄比亚、哥伦比亚和云南产区采集经水洗及深度烘焙的阿拉比卡咖啡豆样品，经研磨机研磨后，咖啡粉样品贮藏在4℃通风良好避光的样品贮藏室内；

1.2称取每个咖啡粉样品每份2.0±0.001g按照质量比1:30的料液比，分别制备不同冲泡方式的咖啡样品。手冲咖啡：取2g咖啡粉样品于咖啡滤纸中并置于漏斗上，取60ml煮制的纯水倒入，取2min内滤液即为手冲咖啡样品；冷萃咖啡：取2g咖啡粉样品和60ml常温纯水，混合置于瓶中，4℃保温12h即为冷萃咖啡样品。咖啡样品经0.45μm滤膜过滤即得待测标准样品；

2.代谢组学实验

取步骤1.2制备得到的所有标准样品，分别进行超高效液相色谱-四级杆/飞行时间高分辨率质谱(Agilent 1290 Infinity HPLC和Agilent 6545 Q-TOF/MS系统)分析，具体分析条件为：

2.1高效液相色谱条件：

正离子模式以0.2％的甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，负离子模式以2mM乙酸铵和0.2％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。本发明的流动相水相中加入甲酸，甲酸的存在为待测物提供酸性环境，可提高离子化效率。负离子模式中加入了乙酸铵，可以增加离子检测的信号。梯度洗脱条件：0-8.0min，0％-40％B；8.0-12.0min，40％-100％B；12.1min，0％B；后运行时间2min。色谱柱：Agilent C18(2.1mm×100mm,1.8μm)色谱柱；柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为20.0μL。

2.2质谱条件：

正模式和负模式的毛细管电压分别为3000v和3500v，喷嘴电压分别为1500v和200v；正模式和负模式的干燥气和鞘流气温度和流速分别为250℃，7L/min和325℃，11L/min，Nebulizer压力为35psig；全扫描质量轴范围为100–1700Da，Acquisition Rate2spectra/s，Acquisition Time 5000ms/spectrum；所有提取的质量数窗口设置为15.0ppm，保留时间窗口设置为0.15min，噪音设置为300counts；二级质谱碰撞能量分别为10eV、20eV和40eV。

3.数据分析与特征差异物筛选

3.1采用超高效液相色谱-四级杆/飞行时间高分辨率质谱仪器配套软件AgilentProfinder对不同冲泡方式咖啡样品的数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐，得到总离子流色谱图(参考图1、2)。根据总离子流色谱图(TIC)图谱可知，冷萃咖啡和手冲咖啡存在较明显差异。

3.2利用主成分分析(PCA)对各个咖啡样品的总离子流色谱图数据进行分析，结果显示(参考图3)：冷萃咖啡和手冲咖啡可以得到完全的分离，也证实了不同冲泡方式确实引起了咖啡中的特征代谢物变化。

3.3冷萃咖啡和手冲咖啡相比，第一步：用T-test计算其中P-Value＜0.05的具有显著差异组分进行分析；第二步：筛选出FC≥2的差异组分；第三步：通过计算变量重要性投影中的VIP，筛选VIP>1的物质；第四步：绘制两组的维恩图，得到两组特有的物质；第五步：将第三步和第四步中得到的物质进行二级质谱谱图采集；第六步：如检出其差异物在不同碰撞能下的二级谱图中出现与谱库中相同碰撞能下离子丰度较高的2～3个碎片离子与谱库中的碎片离子质量数偏差小于10ppm相同的2～3个碎片离子，则可判定该咖啡中存在该物质；第七步：该化合物在手冲咖啡中检出，在冷萃咖啡中无检出，则可作为鉴别手冲咖啡。

3.4所述标志物为Norharman(CAS 244-63-3)，其在冷萃咖啡中无检出，仅存在于传统手冲咖啡中。

实施例2

一种筛选用于鉴别煮制咖啡和冷萃咖啡特征标志物的方法，所述方法包括如下步骤：

1.咖啡样品制备

1.1从埃塞俄比亚、哥伦比亚和云南产区采集经水洗及深度烘焙的阿拉比卡咖啡豆样品，经研磨机研磨后，咖啡粉样品贮藏在4℃通风良好避光的样品贮藏室内；

1.2称取每个咖啡粉样品每份2.0±0.001g按照质量比1:30的料液比，分别制备不同冲泡方式的咖啡样品。煮制咖啡：取2g咖啡粉样品和60ml煮制纯水混合于烧杯中，并置于沸水中，保温5min，即为煮制咖啡样品；冷萃咖啡：取2g咖啡粉样品和60ml常温纯水，混合置于瓶中，4℃保温12h即为冷萃咖啡样品。咖啡样品经0.22和0.45μm滤膜过滤即得待测标准样品。

2.代谢组学实验

同实施例1。

3.数据分析与特征差异物筛选

3.1～3.3同实施例1。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.不同咖啡萃取方式特征标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）按咖啡样品的萃取方式分组得到标准样品；

2）对各组标准样品进行液相色谱-质谱联用分析；

3）对所得数据进行统计分析，得到各组标准样品中的差异物质；

4）表征所述差异物质的结构；

步骤1）中，称取每个咖啡粉样品每份2.0±0.001 g按照质量比1:30的料液比，分别制备不同冲泡方式的咖啡样品，咖啡样品经0.45 μm滤膜过滤即得待测标准样品；

在步骤2）中，所述液相色谱为超高效液相色谱；进行所述超高效液相色谱时，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；正离子模式流动相A为0.15 v/v％~0.25 v/v％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；负离子模式流动相A为1.5mM~2.5mM的乙酸铵，流动相B为0.15 v/v％~0.25v/v％的甲酸水溶液；所述梯度洗脱的程序为：0~8min 时，流动相B 0 v/v %~40 v/v %；8~12min时，流动相B 40 v/v %~100 v/v %；12.1min时，0％B；而后以此条件运行1.5~2.5min；所述梯度洗脱的流速为0.2~0.4 mL/min；

在步骤2）中，所述质谱为四级杆/飞行时间高分辨率质谱；

所述四级杆/飞行时间高分辨率质谱的条件选自条件①～④中的至少一个：

①正离子模式和负离子模式的毛细管电压分别为3000v和3500v，喷嘴电压分别为1500v和200v；

②正模式和负模式的干燥气和鞘流气温度和流速分别为250℃，7L/min和325℃，11L/min，Nebulizer压力为35psig；

③全扫描质量轴范围为100–1700Da，Acquisition Rate 2 spectra/s，AcquisitionTime 5000 ms/spectrum；

④所有提取的质量数窗口设置为15.0ppm，保留时间窗口设置为0.15min，噪音设置为300 counts；

其中上述条件①～④中涉及的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±10％；

在步骤3）中，所述统计分析的方法包括：

a）对所有的数据进行色谱峰提取和峰对齐，得到每个标准样品的总离子流色谱图；

b）对所述总离子流色谱图中的绝对峰面积进行下列分析：

b1）T-test检验，选出P-Value＜0.05的组份；

b2）变化倍数分析，筛选出FC≥2的差异组分；

b3）绘制各组潜在特征标志物的变量重要性投影图，筛选VIP＞1的差异物质；和/或；绘制各组所述潜在特征标志物的维恩图，得到各组非交集的差异物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，每组标准样品中含有多个不同产地的咖啡粉。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤a）之后，b）之前还包括：

采用主成分分析方法对每组标准样品的初步特征标志物的质核比数据进行分析以初步判断不同萃取方式是否存在差异特征标志物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，表征所述差异物质的结构的方法为质谱法，质谱条件同权利要求1的步骤2）。

5.权利要求1~4任一项所述方法筛选得到的特征标志物在鉴别咖啡萃取方式中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述咖啡萃取方式包括：

煮制咖啡、冰镇咖啡、冷萃咖啡、冰滴咖啡、手冲咖啡；或上述方法中的两种或多种萃取方法的组合。

Images