CN114591399A - 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用 - Google Patents

一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114591399A
CN114591399A CN202210300089.8A CN202210300089A CN114591399A CN 114591399 A CN114591399 A CN 114591399A CN 202210300089 A CN202210300089 A CN 202210300089A CN 114591399 A CN114591399 A CN 114591399A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
polypeptide
chinese medicine
traditional chinese
detected
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210300089.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114591399B (zh
Inventor
周倩倩
薛菲
汪冰
林永强
焦阳
尹雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Institute for Food and Drug Control
Original Assignee
Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Institute for Food and Drug Control filed Critical Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority to CN202210300089.8A priority Critical patent/CN114591399B/zh
Publication of CN114591399A publication Critical patent/CN114591399A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114591399B publication Critical patent/CN114591399B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用。本发明提供的特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：VDEVGAEALGR。本发明提供的特征多肽针对含有鹿源成分中药制剂中掺伪驯鹿鹿茸具有优异的专属性，特异性强，可用于检查含有鹿源成分中药制剂中是否掺伪驯鹿鹿茸，具有良好的应用前景。

Description

一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用。
背景技术
鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。梅花鹿为国家一级保护动物，马鹿为重点的国家二级保护动物，现已禁止非法捕猎与贸易，因此鹿茸价格昂贵，市场需求量较大，部分不法分子利用价格相对较低的驯鹿鹿茸、充当鹿茸投料生产含鹿茸中药制剂，加之相应的质量控制指标缺失，导致中成药质量难以保证。
发明内容
针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种筛查中药制剂中使用驯鹿鹿茸投料的特征多肽。
本发明还提供了上述特征多肽在检查定坤丹掺伪驯鹿鹿茸中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽，所述特征多肽如SEQ ID No.1所示：VDEVGAEALGR。
上述特征多肽的质荷比为558.29(z=2)。
本发明还提供了一种用于筛查驯鹿鹿茸投料的中药制剂的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1所述的特征多肽。
本发明还提供了一种利用上述特征多肽筛查驯鹿鹿茸投料的方法，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1的质谱图，当质谱图中出现肽段1的质谱图时，可判断待测样品为驯鹿鹿茸或掺伪驯鹿鹿茸。
进一步的，所述待测样品的前处理具体过程为：取相当于鹿茸添加量50mg的样品，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，离心（4000rpm，10min），弃去上层水液，如法清洗2次。所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
上述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
进一步的，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：液称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。
上述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；选择m/z（二电荷）558.29→673.37 558.29 →772.43作为检测离子对。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的特征多肽及检测方法，为掺伪驯鹿鹿茸的中药制剂的检查提供了解决方案。
（2）本发明提供的特征多肽针对掺伪驯鹿鹿茸的中药制剂具有优异的专属性和稳定性，特异性强，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为m/z（二电荷）558.29的二级质谱图及y离子、b离子归属。
图2 为 m/z（二电荷）558.29的专属性实验结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
（一）仪器和试剂：Thermo EASY-nLC 1000纳升液相，Thermo ScientificOrbitrap-Fusion高分辨质谱，AB Triple Quad 6500+高效液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。
用于进行实验的为鹿茸、定坤丹样品，由企业提供，经山东省农业科学院PCR实验检定鹿源。
实施例1
1、测定条件
1.1 液相-三重四极杆质谱测定条件
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。上述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；选择m/z（二电荷）558.29→673.37；558.29 →772.43作为检测离子对。液
2、供试品溶液的制备
样品：使用定坤丹样品进行测定。取本品大蜜丸适量，剪碎，取3.0g，精密称定；或取水蜜丸适量，研细，取2.0g，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，离心（4000rpm，10min），弃去上层水液，如法清洗2次。所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
阴性样品：根据不同厂家处方制备不含鹿茸的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
实验结果见表1，结果图片见图2。
表1 专属性实验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
对比例1
使用《中国药典》2020年版第一部鹿角胶项下鉴别离子对(m/z)765.5（二电荷）→554.1、(m/z)765.5（二电荷）→733.2对鹿茸样品进行测定，发现马鹿茸、梅花鹿茸、驯鹿茸、驼鹿茸均出现吸收峰，不具备专属性。
<110>山东省食品药品检验研究院
<120>一种含有鹿源成分的中药制剂中掺伪的筛查方法
<160>3
<210> 1
<211>16
<212>PRT
<222>（1）…（16）
<400>1
His His Gly Gly Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp Phe Gln Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211>7
<212>PRT
<222>（1）…（7）
<400>2
Met Leu Thr Ser Glu Glu Lys
1 5
<210> 3
<211>12
<212>PRT
<222>（1）…（12）
<400>3
Glu Phe Thr Pro Glu Leu Gln Ala Asp Tyr Gln Lys
1 5 10

Claims (10)

1.一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽如SEQID No.1所示：VDEVGAEALGR。
2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的质荷比为558.29(z=2)。
3.一种用于筛查驯鹿鹿茸投料的中药制剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的特征多肽。
4.一种利用如权利要求1或2所述的特征多肽筛查驯鹿鹿茸投料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1的质谱图，当质谱图中出现肽段1的质谱图时，可判断待测样品中掺伪了驯鹿鹿茸成分。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理具体过程为：取相当于鹿茸添加量50mg的样品，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，离心（4000rpm，10min），弃去上层水液，如法清洗2次。所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的方法，所述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；选择m/z（二电荷）558.29→673.37 558.29 →772.43作为检测离子对。
CN202210300089.8A 2022-03-25 2022-03-25 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用 Active CN114591399B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210300089.8A CN114591399B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210300089.8A CN114591399B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114591399A true CN114591399A (zh) 2022-06-07
CN114591399B CN114591399B (zh) 2023-05-09

Family

ID=81811322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210300089.8A Active CN114591399B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114591399B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007134117A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Indiana University Research And Technology Corporation Detecting single amino acid polymorphisms by isotopic labeling and mass spectrometry
CN113307846A (zh) * 2021-06-23 2021-08-27 山东省食品药品检验研究院 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用
WO2022048048A1 (zh) * 2020-09-01 2022-03-10 南京中医药大学 一种鹿源特征肽段及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007134117A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Indiana University Research And Technology Corporation Detecting single amino acid polymorphisms by isotopic labeling and mass spectrometry
WO2022048048A1 (zh) * 2020-09-01 2022-03-10 南京中医药大学 一种鹿源特征肽段及其检测方法
CN113307846A (zh) * 2021-06-23 2021-08-27 山东省食品药品检验研究院 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOZEF ČAPLA, ET AL.: "PROCEDURES FOR THE IDENTIFICATION AND DETECTION OF ADULTERATION OF FISH AND MEAT PRODUCTS" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114591399B (zh) 2023-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113307846A (zh) 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿茸鹿角的特征多肽及其应用
CN113480599A (zh) 一种鉴别梅花鹿或马鹿鹿角胶的特征多肽及其应用
CN114539360B (zh) 一种驼鹿源特征多肽及其应用
CN110596262A (zh) 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂mrjp1蛋白含量的方法
Blankenship et al. High-sensitivity amino acid analysis by derivatization with O-phthalaldehyde and 9-fluorenylmethyl chloroformate using fluorescence detection: Applications in protein structure determination
CN111896651B (zh) 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用
US11692186B2 (en) Snake venom thrombin-like enzyme marker peptide of Agkistrodon halys pallas and its application in the species identification of hemocoagulase for injection
CN110850001B (zh) 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp3的方法
CN114591421B (zh) 一种鉴别驯鹿源的特征多肽及其应用
CN110850000A (zh) 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp2的方法
CN106749600A (zh) 一种酪蛋白磷酸肽的标签肽及其应用
CN110736802A (zh) 一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法
CN117069801B (zh) 一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽及其筛选方法
CN114591399A (zh) 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用
CN110850002B (zh) 液相色谱串联质谱定量中蜂蜜mrjp2的方法
Caldas et al. Electrospray ionization mass spectrometry of sphinganine analog mycotoxins
CN114720592B (zh) 一种含有鹿源成分的中药制剂中掺伪的筛查方法
CN113502279B (zh) 一种蝮蛇蛇毒磷脂酶a2特征多肽及其应用
CN115572322A (zh) 一种麋鹿角特征肽段及其检测方法
CN107884467A (zh) 改善质谱检测糖基结晶的方法及产品
Colgrave Primary structural analysis of cyclotides
CN110007023B (zh) 鱼体内磺胺类药物的高分辨质谱筛查方法及其与蛋白大分子相互作用的分析方法
CN112326816B (zh) 一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法
CN117164671B (zh) 一种天南星特征肽段及其检测方法和应用
CN116106554B (zh) 一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant