CN115754049A

CN115754049A - 一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法

Info

Publication number: CN115754049A
Application number: CN202211397711.8A
Authority: CN
Inventors: 刘刈; 刘于嘉; 冉毅; 龙玲; 陈佳
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，包含如下步骤：1)样品前处理：采用有机溶剂沉淀法处理沼液以净化样品并提取目标物；2)检测：通过高效液相色谱‑串联质谱联用仪，采用正离子模式扫描，在多反应监测(MRM)模式下对样品中的氨基酸进行检测；3)定量分析：采用外标法进行定量，计算得到样品中各氨基酸的含量。该方法分离效果好，灵敏度高，能适用于各种沼液中氨基酸含量的测定，具有一定的指导意义和应用价值。

Description

一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法

技术领域

本发明涉及一种测定沼液中氨基酸含量的方法，具体涉及一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法。

背景技术

沼液利用难是制约沼气技术高效推广最重要的因素，是限制沼气工程发挥绿色循环和碳减排效益的最大阻碍。沼液市场化推广难的一大制约因素是营养物质和风险因子标准化困难，检测方法缺失。目前，沼液中氮、磷、钾、有机质等常规营养物质关注较多，方法较成熟，而沼液中氨基酸关注较少，标准缺失，检测方法未建立。

沼液中含有丰富的氨基酸如缬氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸等，不同发酵原料、不同发酵工艺的沼液中氨基酸组成成分及含量有所不同，对不同类型沼液中氨基酸种类及含量准确分析有利于沼液肥资源化利用。

常见的氨基酸检测仪器有高效液相色谱仪、离子交换色谱仪、全自动氨基酸分析仪。其中全自动氨基酸分析仪检出限较高，离子交换色谱仪、高效液相色谱仪都需要柱前衍生，衍生剂成本较高且具有一定毒性，检测时靠保留时间定量，受色谱柱分离度的影响大，检测时间较长，精密度低，不利于大批量样品的检测。LC-MS-MS仪测定氨基酸样品前处理简单，提取剂对人体危害较小，且可以同时测多种氨基酸，具有检出限低、准确度高、精密度高等优点。开发一种基于LC-MS-MS法检测沼液中氨基酸，为精确分析沼液中氨基酸组分提供技术手段。

目前一些学者对沼液中的氨基酸的研究受限于标准方法的缺失，仅针对沼液中总氨基酸含量和游离氨基酸含量进行了测定，而对不同原料沼液中具体氨基酸的种类及含量分析较少。氨基酸测定方法较多，有薄层层析法、离子色谱法、液相色谱法和气相色谱法等，但由于色谱法检测时仅靠保留时间定量，检测效率和精确度受限于色谱柱分离度和流动相，一般仅适用于分析比较洁净的样品。而沼液呈黑色，有许多细小固体悬浮物，离心分离很难得到上清液和沉淀，加上干扰组分较多，用一般的方法测定其中的氨基酸比较困难。

因此，有必要建立一种新的处理方法，结合仪器方法的优化，实现对沼液基质中多种氨基酸的高通量定量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种沼液中氨基酸的检测方法，通过对沼液的预处理，结合液质联用进行检测，为解决沼液中的干扰组分较多而导致沼液中的氨基酸含量检测困难的问题，能适用于测定氨基酸种类复杂多样的沼液样品。

为了达到上述目的，本发明提供了一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，包含如下：

1)样品前处理：取沼液，吸取乙腈添加到待测沼液样品中用于沉淀待测沼液样品中的蛋白质，将所得混合溶液震荡并超声，在4℃、5000rpm条件下低温离心获得上清液；将离心所得沉淀按上述步骤重复提取2次，合并所得上清液，并30℃水浴中旋转蒸干；加入体积分数为0.1％甲酸的20％甲醇水，涡旋溶解，再加入正己烷涡旋，离心后取下层水相过0.22μm滤膜后制得待测样品；

2)检测：配制氨基酸标准品，采用高效液相色谱-串联质谱联用仪对配制的氨基酸标准品进行氨基酸检测，用峰面积对浓度制作标准曲线，并对步骤1)中制备的的待测样品进行氨基酸检测；

3)定量分析：将上述待测样品的各待测成分峰面积与其对应的标准曲线相比较，计算得到待测样品中各待测成分的浓度，即得待测沼液样品中各待测成分的含量。

优选地，上述检测方法中的步骤1)样品前处理中添加的乙腈与沼液的质量体积比为沼液:乙腈＝1:4。

优选地，上述检测方法中的步骤2)检测中的氨基酸标准品分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品，每种氨基酸分别配制1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的浓度。

优选地，上述检测方法中的步骤2)中的氨基酸检测的条件包含如下：

其液相色谱条件为：色谱柱为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.6mL/min，进样量为10μL。

质谱条件为：采用正离子模式扫描，在多反应监测模式下对目标物进行定量分析。

优选地，上述的梯度洗脱的条件设置为如下所示：

0min时，流动相A的体积百分数为5％，流动相B的体积百分数为95％，流速为0.6mL/min；

2～3min时，流动相A为95％，流动相B为5％，流速为0.6mL/min；

4～10min时，流动相A为5％，流动相B为95％，流速为0.6mL/min。

优选地，上述检测方法中的色谱柱的柱温为40℃。

优选地，上述检测方法中的质谱条件，其电喷雾离子源条件为：喷雾电压为正离子3500V、负离子2500V，离子源温度为400℃，鞘气压力35Arb，辅气压力为10Arb，离子吹扫气体压力为0Arb。

本发明提供的上述任意一种液质联用检测方法均可被用于沼液中氨基酸的含量测定。

本发明的一种沼液中氨基酸的检测方法，解决了沼液中的干扰组分较多而导致沼液中的氨基酸含量检测困难的问题，具有以下优点：

本发明的检测方法首次建立了沼液样品中氨基酸液相色谱串联质谱检测法，能够有效检出沼液样品中的赖氨酸、亮氨酸、酪氨酸等多种氨基酸，分离效果好，灵敏度高，选择性强，准确性好。

本发明的检测方法采用蛋白质有机溶剂沉淀法对沼液样品进行前处理，可有效的消除沼液中复杂基质的干扰，基线平稳，不发生漂移，复溶后加入正己烷能除去脂肪的干扰，而未经净化的沼液样品存在极强的干扰成分使目标成分无法检出。

本发明的检测方法检测时间短，只需10min即可完成检测过程，大大提高了检测效率，适合高通量筛选。

本发明的检测方法具有良好的线性关系，R²>0.997，定量检测的准确度高，重现性好，具有良好的精密度。

附图说明

图1为本发明中的精氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图2为本发明中的赖氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图3为本发明中的谷氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图4为本发明中的亮氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图5为本发明中的酪氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图6为本发明中的色氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图7为本发明中的脯氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图8为本发明中的天冬氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图9为本发明中的苯丙氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图10为本发明中的异亮氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图11为本发明中的丙氨酸标准品的LC-MS-MS图。

图12为本发明中赖氨酸标准品的线性回归结果。

图13为本发明中脯氨酸标准品的线性回归结果。

图14为本发明中酪氨酸标准品的线性回归结果。

图15为本发明中天冬氨酸标准品的线性回归结果。

图16为本发明中亮氨酸标准品的线性回归结果。

图17为本发明中异亮氨酸标准品的线性回归结果。

图18为本发明中苯丙氨酸标准品的线性回归结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：本发明中所用到的试剂未具体说明的均为常规试剂，所用到的方法未具体说明的均为常规方法。

实施例

实验例1沼液样品处理

试验材料：甲酸、乙腈、甲醇、氨基酸混合标准溶液，试验用水均为Mili-Q Plus去离子水。

仪器设备：三重四极杆LC/MS/MS高效液相色谱-质谱联用仪，电子天平，超纯水器，旋涡混合仪，超声波清洗仪，超低温冰箱，低温高速离心机，旋转蒸发仪。

针对沼液样品的前处理，采用蛋白质有机溶剂沉淀法进行。称取沼液2g，按照沼液:乙腈＝1:4(m/v)的比例，精密吸取有机试剂乙腈(ACN)添加到沼液样品中以沉淀蛋白。将溶液涡旋混合震荡1min，超声辅助提取10min，并在4℃、4000rpm条件下低温离心5min，取上清液。重复上述步骤，加入乙腈进行2次提取，合并上清液于鸡心瓶中。放入30℃水浴中旋转蒸发至干后，加入1mL 20％甲醇水(含0.1％甲酸)，涡旋1min溶解，再加入2mL正己烷涡旋1min除去脂肪等杂质，放入4℃、4000rpm条件下低温离心5min，取下层水相过0.22μm滤膜后，放入液相质谱自动进样器内进行氨基酸检测分析。

实验例2色谱条件与质谱参数的设定

色谱条件如下所示：

色谱柱：岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ(100mm×2.1mm，1.9μm)；

流动相A为甲醇；流动相B为0.1％甲酸-水溶液；

柱温：40℃；

流速：0.6mL/min；

进样量：10μL；

采用梯度洗脱，程序见下表1所示：

表1HPLC洗脱程序

质谱条件如下所示：

采用正离子扫描，在多反应监测(MRM)模式下对目标物进行定量分析。电喷雾离子源条件如下：

a)喷雾电压(IS)：正离子3500V，负离子2500V；

b)离子源温度：400℃；

c)鞘气压力：35Arb；

d)辅气压力：10Arb；

e)离子吹扫气体压力：0Arb。

质谱中氨基酸的主要质谱采集参数如下表2所示：

表2氨基酸的主要质谱采集参数

实验例3标准曲线的测定

配制一系列浓度梯度的氨基酸标准品溶液，各氨基酸标准品分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品，每种氨基酸分别配制1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的浓度。样品处理方法同上述实验例1，色谱条件和质谱参数同上述实验例2。氨基酸标准品的LC-MS-MS结果如图1～11所示，其中，图1～11分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品的LC-MS-MS图。采用外标法定量，以理论浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，制得标准曲线，部分氨基酸标准品的线性回归标准曲线如图12～18所示，其中，图12～18分别为赖氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸标准品的标准曲线。

实验例4沼液样品检测结果

对沼气工程中取回的8份沼液样品进行氨基酸种类及含量检测，所得结果如下表3所示：

表3沼液样品检测结果

检测的8种沼液均为从各大沼气工程取回的样品，原料为猪粪、猪粪与鸡粪的混合物，根据表3的结果可知，沼液中的赖氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸均被检出，表明本发明提供的液质联用检测方法可靠，可以被用于沼液中氨基酸的含量测定。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种沼液中氨基酸的液质联用检测方法，其特征在于，包含：

1)样品前处理：取沼液，吸取乙腈添加到待测沼液样品中，将所得混合溶液震荡并超声，离心后取上清液；将上清液于30℃水浴中旋转蒸干；加入体积分数为0.1％甲酸的20％甲醇水，涡旋溶解，再加入正己烷涡旋，离心后取下层水相过0.22μm滤膜后制得待测样品；

2)检测：配制氨基酸标准品，采用高效液相色谱-串联质谱联用仪对配制的氨基酸标准品进行氨基酸检测，用峰面积对浓度制作标准曲线，并对步骤1)中所述的待测样品进行氨基酸检测；

3)定量分析：将步骤2)所述待测样品的各待测成分峰面积与其对应的标准曲线相比较，计算得到待测样品中各待测成分的浓度，即得待测沼液样品中各待测成分的含量。

2.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤1)样品前处理中添加的乙腈与沼液的质量体积比为沼液:乙腈＝1:4。

3.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤1)采用乙腈沉淀待测沼液样品中的蛋白质，在4℃、5000rpm条件下低温离心获得所述上清液。

4.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤2)检测中的氨基酸标准品分别为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和丙氨酸标准品_，每种氨基酸分别配制1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的浓度。

5.根据权利要求1所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述步骤2)中的氨基酸检测的条件包含：

液相色谱条件为：色谱柱为岛津Shim-pack GIST-HP C18-AQ，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.6mL/min，进样量为10μL；

6.根据权利要求5所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件设置为：

2～3min时，流动相A的体积百分数为95％，流动相B的体积百分数为5％，流速为0.6mL/min；

4～10min时，流动相A的体积百分数为5％，流动相B的体积百分数为95％，流速为0.6mL/min。

7.根据权利要求5所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为40℃。

8.根据权利要求5所述的液质联用检测方法，其特征在于，所述质谱条件中，电喷雾离子源条件为：喷雾电压为正离子3500V、负离子2500V，离子源温度为400℃，鞘气压力35Arb，辅气压力为10Arb，离子吹扫气体压力为0Arb。