CN110658281B - 血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法 - Google Patents

血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血浆中硝酸异山梨酯、5‑单硝酸异山梨酯和2‑单硝酸异山梨酯的检测分析方法，该方法通过采取一步有机溶液萃取、选取合适的色谱柱长、以及用醋酸根加合离子作为母离子来建立检测通道，优化了参数组合，最终成功制定出能同时测定硝酸异山梨酯、2‑单硝酸异山梨酯和5‑单硝酸异山梨酯的LC‑MS/MS方法。本发明所述检测分析方法具有快速、准确、灵敏度高、操作简便等优点，实现硝酸异山梨酯、5‑单硝酸异山梨酯和2‑单硝酸异山梨酯的血药浓度同时测定。

Description

血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨 酯的检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及人血浆中硝酸异山梨酯(XSYSLZ)、5-单硝酸异山梨酯(5-DXSYSLZ)和2-单硝酸异山梨酯(2-DXSYSLZ)的LC-MS/MS检测方法。
背景技术
硝酸异山梨酯(Isosorbide dinitrate)为血管扩张药，主要药理作用是松弛血管平滑肌。总的效应是使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解。临床可用于治疗各种类型冠心病心绞痛和预防发作。静脉滴注可用于治疗充血性心衰，各种类型的高血压急症和手术前高血压的控制。
硝酸异山梨酯(ISDN)主要药理作用是松弛血管平滑肌。ISDN在体内代谢生成单硝酸异山梨酯(ISMN)，后者释放一氧化氮(NO)，NO与内皮舒张因子相同，激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内的环鸟苷酸(cGMP)增多，从而松弛血管平滑肌，使外周动脉和静脉扩张，对静脉的扩张作用更强。静脉扩张使血液潴留在外周，回心血量减少，左室舒张末压和和肺毛细血管楔嵌压(前负荷)减低。动脉扩张使外周血管阻力、收缩期动脉压和平均动脉压(后负荷)减低。冠状动脉扩张，使冠脉灌注量增加。总的效应是使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解。
目前，还没有一种检测方法，能将原形药硝酸异山梨酯和两个代谢物5-单硝酸异山梨酯(isosorbide mononitrate)及2-单硝酸异山梨酯(Isosorbide 2-nitrate)同时检测。主要是因为这三个检测对象均为保留弱、信号响应差的化合物；在检测时所用的离子对完全一样，5-单硝酸异山梨酯及2-单硝酸异山梨酯需要实现完全的液相分离，更加增加了检测难度。此外，由于原形药及代谢物2-单硝酸异山梨酯在体内的浓度较低，检测灵敏度不高问题更为突出。而临床大批量样品需要分析，如果能同时检测这三种物质，将极大地提升检测效率。
因此，亟待开发一种方法，用于解决原形药硝酸异山梨酯和两个代谢物5-单硝酸异山梨酯及2-单硝酸异山梨酯保留弱、信号响应差的问题；5-单硝酸异山梨酯及2-单硝酸异山梨酯需要实现完全的液相分离问题；原形药及代谢物2-单硝酸异山梨酯在体内的浓度较低，检测灵敏度问题，准确的测定血浆中硝酸异山梨酯和两个代谢物5-单硝酸异山梨酯及2-单硝酸异山梨酯浓度。
发明内容
本发明目的之一是提供一种血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的LC-MS/MS(高效液相色谱-串联质谱)检测分析方法；该方法满足了临床大批量样品分析的需求、操作简单、检测定量线低和3个待测物能同时检测等特点。
实现上述目的的技术方案如下。
一种血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，采用高效液相色谱-串联质谱检测，包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：
得到以K2EDTA为抗凝剂的血浆，
在血浆样本中加入硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作液，涡旋混匀后加入乙酸乙酯，离心；取上层清液至深孔板中，氮吹吹干；加入乙腈-水复溶，涡旋混匀；得到待测样品；
(2)试样测定：
取待测样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰，得到血浆样品中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯浓度；
色谱条件：
色谱柱：C18，粒径1.7μm，柱内径2.1mm，柱长150mm；色谱柱温：30±1℃；流动相A：30±1％甲醇-乙腈(体积)；流动相B：0.5±0.01mM乙酸铵-水；
质谱条件：
离子源为电喷雾离子源；用醋酸根加合离子作为母离子，离子对：硝酸异山梨酯295→59；2-单硝酸异山梨酯250→59，5-单硝酸异山梨酯250→59为检测通道；负离子方式检测。
在其中一些实施例中，液相色谱条件中：自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.25mL/min；进样量为20uL；分析时间为13min。
在其中一些实施例中，质谱条件中：喷雾电压为-4500V，雾化温度为450℃，雾化气压力为45Psi；和/或辅助加热气压力为45Psi；气帘气压力为35Psi；碰撞室入口电压为-10eV；碰撞室出口电压为-7eV。
在其中一些实施例中，所述硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作液的浓度分别为：500±1ng/uL；和/或300uL的血浆样品中加入10±1uL的内标工作液。
在其中一些实施例中，色谱条件：进样器温度：6℃，色谱柱温：30℃；进样量：20.00μL，流速0.250mL/min，洗针液：强洗液：10％水-乙腈；弱洗液：10％乙腈-水。
在其中一些实施例中，采用内标法，以硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的浓度。
在其中一些实施例中，所述标准曲线方程的建立，包括以下步骤：取285uL空白血浆8份置于EP管中，以待测物工作溶液的形式分别添加15uL浓度分别为3ng/mL、20ng/mL、20ng/mL，6ng/mL、40ng/mL、40ng/mL，12ng/mL、80ng/mL、80ng/mL，24ng/mL、160ng/mL、160ng/mL，96ng/mL、640ng/mL、640ng/mL，192ng/mL、1280ng/mL、1280ng/mL，576ng/mL、3840ng/mL、3840ng/mL，720ng/mL、4800ng/mL、4800ng/mL的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯配置成最低定量下限标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限标样8；涡旋混匀后加入10uL的500ng/uL、500ng/uL、500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液；取300uL空白血浆2份，一份加入500ng/uL、500ng/uL、500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液10uL，一份加入10uL 20％乙腈-水；另取300uL超纯水加入10uL 20％乙腈-水，涡旋混匀后分别向11份样本中加入1250uL乙酸乙酯；涡旋15min，离心；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；后分别作为11份标准样品待检测；
分别取20uL标准样品注入LC-MS/MS中，检测样品中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯的浓度。
本发明所述检测方法的血浆标准曲线线性范围：硝酸异山梨酯0.15～36ng/mL，5-单硝酸异山梨酯1～240ng/mL，2-单硝酸异山梨酯1～240ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。
本发明通过采取一步有机溶液萃取、选取合适的色谱柱长(增加保留程度及分离度)、以及用醋酸根加合离子作为母离子来建立检测通道(可以极大地增加质谱信号)，优化了参数组合，最终成功制定出能同时测定硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的LC-MS/MS方法；并以有机相为30％甲醇-乙腈，进一步提高了待测物的分离度与信号响应。
本发明具有以下效果：
a所述检测方法的预处理简便，一步有机溶液萃取，萃取效率好，且可以适用临床大批量样品的常规测定。
b专属性强：在所述检测方法的所采用的色谱条件下，硝酸异山梨酯保留时间可为8.91min左右，5-单硝酸异山梨酯保留时间为可4.33min左右，2-单硝酸异山梨酯保留时间可为3.68min左右和内标硝酸异山梨酯-13C6保留时间在8.90min左右，5-单硝酸异山梨酯-13C6保留时间在4.31min左右，5-单硝酸异山梨酯-13C6保留时间在3.67min左右。硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰的峰形良好，无杂峰干扰测定。
c灵敏度高：硝酸异山梨酯血浆最低定量限可为0.15ng/mL，5-单硝酸异山梨酯血浆最低定量限可为1ng/mL，2-单硝酸异山梨酯血浆最低定量限可为1ng/mL，能准确测定血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的浓度，灵敏度高，特异性强。
d本发明所述检测方法具有快速、准确、灵敏度高、操作简便等优点，为实现硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的血药浓度同步测定提供依据。
附图说明
图1-1、图1-2和图1-3为LC-MS/MS法测得的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯在人血浆中的标准曲线图谱。
图2-1、图2-2和图2-3为人空白血浆的LC-MS/MS图谱。
图3-1、图3-2和图3-3为人血浆中定量下限待测物和内标的LC-MS/MS图谱。
图4-1、图4-2和图4-3为健康受试者口服硝酸异山梨酯药物后血浆样品再加入内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的LC-MS/MS图谱。
图5-1、图5-2和图5-3为色谱柱柱长75mm时硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的LC-MS/MS图谱。
图6-1、图6-2和图6-3为色谱柱柱长100mm时硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的LC-MS/MS图谱。
图7-1、图7-2和图7-3为色谱柱柱长150mm时硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的LC-MS/MS图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：人类K2EDTA血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的浓度的测定
一、实验材料与分析设备
硝酸异山梨酯(分析物)、5-单硝酸异山梨酯(分析物)、2-单硝酸异山梨酯(分析物)：中国食品药品检定研究院。
硝酸异山梨酯-13C6(内标)、5-单硝酸异山梨酯-13C6(内标)、2-单硝酸异山梨酯-13C6(内标)：Toronto Research Chemicals。
使用试剂见下表1：
表1试剂
Figure BDA0002250827120000051
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂
使用仪器设备见下表2：
表2仪器设备
Figure BDA0002250827120000052
Figure BDA0002250827120000061
注：亦可使用相同级别或更高级别仪器设备。
二、液质条件
2.1、液相色谱条件见下表3：
表3色谱条件
Figure BDA0002250827120000062
Figure BDA0002250827120000071
2.2、质谱条件见下表4：
表4质谱条件
Figure BDA0002250827120000072
采用醋酸根加合离子作为母离子(离子对：硝酸异山梨酯295→59；2-单硝酸异山梨酯250→59，5-单硝酸异山梨酯250→59。)
三、实验过程
3.1、人的血浆样品预处理：取300μL人血浆样品，加入10μL硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作溶液；涡旋混匀后，加入1250μL乙酸乙酯萃取剂，涡旋15min并15700g条件下离心10min离心后；移取900μL上清液至96孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；得到待测样品。
所述硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作液的浓度分别为：500ng/uL。
待测物储备液配制见下表5-1、5-2和5-3：
表5-1硝酸异山梨酯储备液配
Figure BDA0002250827120000081
表5-2 5-单硝酸异山梨酯
Figure BDA0002250827120000082
表5-3 2-单硝酸异山梨酯
Figure BDA0002250827120000083
3.2标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制:
分别精密吸取12μL硝酸异山梨酯储备液(XSYSLZ-SS1/SS2)、40μL 5-单硝酸异山梨酯储备液(5-DXSYSLZ-SS1/SS2)和40μL 2-单硝酸异山梨酯储备液(2-DXSYSLZ-SS1/SS2)至1.5mLEP管中，加入908mL 20％乙腈-水配制成浓度为6000/40000/40000ng/mL(XSYSLZ/5-DXSYSLZ/2-DXSYSLZ)的标准曲线工作溶液W-9和质控工作溶液QW-6。再用20％乙腈-水配制成不同浓度的标准曲线工作溶液和质控工作溶液。下表6举例说明了标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制方法，必要时可等比例改变配制体积，标准曲线工作溶液和质控工作溶液不使用时储存于塑料容器及冰箱(4℃)保存。
表6标准曲线工作溶液和质控工作溶液的配制
Figure BDA0002250827120000091
3.3标准曲线样品和质控样品配制：
下表7举例说明了标准曲线样品的配制方法，必要时可按比例改变标准曲线样品的配制体积。
表7标准曲线样品和质控样品配制
Figure BDA0002250827120000092
Figure BDA0002250827120000101
3.4、内标储备液的配制见下表8-1、8-2和8-3：
表8-1硝酸异山梨酯-13C6内标储备液的配制
Figure BDA0002250827120000102
表8-2 5-单硝酸异山梨酯-13C6内标储备液的配制
Figure BDA0002250827120000103
表8-3 2-单硝酸异山梨酯-13C6内标储备液的配制
Figure BDA0002250827120000111
3.5、内标工作溶液的配制见下表9：
表9内标工作溶液的配制
Figure BDA0002250827120000112
注：内标工作溶液不使用时储存于塑料容器及冰箱(4℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
3.6、线性试验
将表7所得的300μL标样，涡旋混匀后加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液；取300uL空白血浆2份，一份加入500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液10uL，一份加入10uL 20％乙腈-水；另取300uL超纯水加入10uL20％乙腈-水，混匀后分别向11份样本中加入1250uL乙酸乙酯；涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；后分别作为11份标准样品待检测。
3.7样品测定：
取20uL待测样品注入LC-MS/MS中，检测样品中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰，计算待测物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)，以峰面积比值Y对血药浓度X作回归计算得到血浆样品中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯浓度。结果见表10-1、表10-2、表10-3。按该方法测得的硝酸异山梨酯\5-单硝酸异山梨酯\2-单硝酸异山梨酯的血药浓度的最低定量限为：0.15\1\1ng/mL。
表10-1 LC-MS/MS法测得的硝酸异山梨酯在人血浆中的标准曲线
Figure BDA0002250827120000121
表10-2 LC-MS/MS法测得的5-单硝酸异山梨酯在人血浆中的标准曲线
Figure BDA0002250827120000131
表10-3 LC-MS/MS法测得的2-单硝酸异山梨酯在人血浆中的标准曲线
Figure BDA0002250827120000132
Figure BDA0002250827120000141
3.8、准确度和精密度：
将表7中所得的标准曲线样品(C-1～8)和质控样品(LLOQ、QCL、QCM、QCH)，平行转移3份300uL含药血浆质控样品及一条随行标准曲线，加入10μL内标工作溶液；涡旋混匀后加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液；取300uL空白血浆2份，一份加入500ng/uL、500ng/uL、500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液，一份加入10uL 20％乙腈-水；另取300uL超纯水加入10uL 20％乙腈-水，混匀后分别向11份样本中加入1250uL乙酸乙酯，涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；后分别作为11份标准样品和准确度和精密度样品待检测；每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3天，共三批，每个浓度分别做3份样品，计算待测物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表11-1、11-2、11-3。结果表明，硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯血浆样品批内、批间精密度、准确度均小于±15％符合要求。
表11-1 LC-MS/MS法测定血浆中硝酸异山梨酯的批内、批间精密度和准确度
Figure BDA0002250827120000151
Figure BDA0002250827120000161
表11-2 LC-MS/MS法测定血浆中5-单硝酸异山梨酯的批内、批间精密度和准确度
Figure BDA0002250827120000162
Figure BDA0002250827120000171
表11-3 LC-MS/MS法测定血浆中2-单硝酸异山梨酯的批内、批间精密度和准确度
Figure BDA0002250827120000172
Figure BDA0002250827120000181
Figure BDA0002250827120000191
3.9、干扰性
考察6个不同个体来源的空白基质配制的空白样品以及6个不同个体来源空白基质配制的LLOQ(最低定量限)样品，以考察内源性物质对待测物和内标的干扰。
计算公式：干扰％＝空白基质峰面积/LLOQ待测物(内标)样品峰面积X100％
6个不同个体来源的空白基质配制的空白样品，待测物保留时间处干扰峰峰面积低于相同个体来源空白基质配制LLOQ样品待测物峰面积的20.0％，且内标保留时间处干扰峰面积低于相同个体来源空白基质配制LLOQ样品内标峰面积的5.0％。结果见表12-1、12-2、12-3。
表12-1硝酸异山梨酯的干扰性
Figure BDA0002250827120000192
表12-2 5-单硝酸异山梨酯的干扰性
Figure BDA0002250827120000193
Figure BDA0002250827120000201
表12-3 2-单硝酸异山梨酯的干扰性
Figure BDA0002250827120000202
从表12-1、12-2和12-3中结果表明，不同人体的空白血浆对硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测结果没有造成干扰。该分析方法对硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的分析具有专属性。
4.0、基质效应
通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入待测物和内标测得，即基质效应样品)，与不含基质的相应峰面积(待测物和内标的纯溶液，即对照样品)比值，计算每一待测物和内标的基质因子，进一步通过待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。在生物样品测试过程中，应至少考察低、中、高3浓度水平，每个浓度水平应考察6个不同个体来源空白基质样品的基质效应，不应使用合并的基质。不含基质的对照样品(待测物和内标的纯溶液)每个浓度水平平行制备6份。按照以下公式计算基质效应：
Figure BDA0002250827120000203
Figure BDA0002250827120000211
Figure BDA0002250827120000212
结果见表13-1、13-2、13-3。结果表明，硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯血浆样品，每个浓度水平经内标归一化的基质因子的变异系数不大于15％；各浓度水平内标归一化的基质因子总体变异系数不大于15％，符合相关要求。
表13-1硝酸异山梨酯的基质效应
Figure BDA0002250827120000213
Figure BDA0002250827120000221
表13-2 5-单硝酸异山梨酯的基质效应
Figure BDA0002250827120000222
Figure BDA0002250827120000231
表13-3 2-单硝酸异山梨酯的基质效应
Figure BDA0002250827120000232
Figure BDA0002250827120000241
4.1、提取回收率
提取后样品：由空白基质分别配制含低、中、高3个浓度水平待测物和内标样品，每个浓度水平平行6份。将以上样品进行液液萃取，氮吹后，补以合适体积的溶剂复溶后待进样。
未提取样品：将空白基质进行液液萃取，氮吹后加入含待测物和内标的溶剂复溶后待进样，每个待测物浓度水平平行6份。
提取后样品与未提取样品的最终进样溶液中成份应相同。
按照以下公式计算待测物回收率：
Figure BDA0002250827120000251
按照以下公式计算内标回收率：
Figure BDA0002250827120000252
待测物各浓度水平的回收率结果应一致、精密、重现性好，各单一浓度水平的峰面积％RSD≤15％，且待测物各浓度水平回收率的总体变异系数％RSD≤15％。内标的内标峰面积％RSD≤15％，符合相关规定。结果见表14-1、14-2、14-3、14-4、14-5、14-6。
表14-1硝酸异山梨酯的待测物提取回收率
Figure BDA0002250827120000253
Figure BDA0002250827120000261
表14-2硝酸异山梨酯的内标提取回收率
Figure BDA0002250827120000262
表14-3 5-单硝酸异山梨酯的待测物提取回收率
Figure BDA0002250827120000271
表14-4 5-单硝酸异山梨酯的内标提取回收率
Figure BDA0002250827120000272
Figure BDA0002250827120000281
表14-5 2-单硝酸异山梨酯的待测物提取回收率
Figure BDA0002250827120000282
Figure BDA0002250827120000291
表14-6 2-单硝酸异山梨酯的内标提取回收率
Figure BDA0002250827120000292
4.2、人血浆样品的检测
4.2.1取表7所得的300μL标样(C-1～C-8)，加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液，涡旋混匀后分别向8份样本中加入1250uL乙酸乙酯；涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；取20uL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图1-1、图1-2和图1-3所示。
4.2.2取300uL空白血浆加入10uL 20％乙腈-水，涡旋混匀后向样本中加入1250uL乙酸乙酯；涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；取20uL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图2-1、图2-2和图2-3所示。
4.2.3、取表7所得的300μL标样1(C-1)，加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液，涡旋混匀后向样本中加入1250uL乙酸乙酯，涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；取20uL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图3-1、图3-2和图3-3所示。
4.2.4取采集健康受试者口服硝酸异山梨酯药物后的血浆样本300μL，加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液；涡旋混匀后向样本中加入1250uL乙酸乙酯；涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；取20uL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图4-1、图4-2和图4-3所示。
由上述分析可知，在本实验所采用的色谱条件下，硝酸异山梨酯保留时间为8.91min左右，5-单硝酸异山梨酯保留时间为4.33min左右，2-单硝酸异山梨酯保留时间为3.68min左右和内标硝酸异山梨酯-13C6保留时间在8.90min左右，5-单硝酸异山梨酯-13C6保留时间在4.31min左右，5-单硝酸异山梨酯-13C6保留时间在3.67min左右。待测物和内标的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本发明所述检测方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限硝酸异山梨酯为0.15ng/mL、5-单硝酸异山梨酯为1ng/mL、2-单硝酸异山梨酯为1ng/mL；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的血药浓度测定提供依据。本发明所述检测方法的血浆标准曲线线性范围硝酸异山梨酯为0.15～36ng/mL，5-单硝酸异山梨酯为1～240ng/mL，2-单硝酸异山梨酯为1～240ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。
实施例2
以实施例1的方法取表7所得的300μL质控样品(QCM)，加入10uL的500/500/500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液，涡旋混匀后向样本中加入1250uL乙酸乙酯，涡旋15min，于15700g条件下离心10min；取上层清液900uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100μL 10％乙腈-水复溶，涡旋10min；取20uL样品对硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯进行分析检测，可知采用不同柱长的色谱柱对该方法影响较大。
当采用色谱柱柱长75mm时，如图5-1、图5-2，图5-3所示，2-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯的色谱峰和干扰峰尚未完全分离，影响积分，达不到所要完成生物定量分析方法的定量下限。
当色谱柱柱长为100mm时，如图6-1、图6-2，图6-3所示，5-单硝酸异山梨酯的色谱峰和干扰峰尚未完全分离，影响积分，达不到所要完成生物定量分析方法的定量下限
色谱柱150mm，如图7-1、图7-2，图7-3所示，硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯的色谱峰和干扰峰完全分离，积分正常，能够达到所要完成生物定量分析方法的定量下限。
对比例1
硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯都是小分子化合物，易断裂形成较小的产物，在正常的质谱条件下没有分子离子峰。
本对比例，还曾分别按照采用加合甲酸根、氢离子等离子用于替代醋酸根加合离子，使用本发明的方法进行检查，但是都无法满足同时检测出这三种物质的需求，更不用说具有较好的灵敏度。
本发明如实施例1所述，采用醋酸根加合离子作为母离子(离子对：硝酸异山梨酯295→59；2-/5-单硝酸异山梨酯250→59)来建立检测通道，极大地增加质谱信号，满足了该方法所要求的灵敏度：硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯定量下限分别为0.15ng/mL、1ng/mL、1ng/m L。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱-串联质谱检测，包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：
得到以K2EDTA为抗凝剂的血浆样本，
在血浆样本中加入硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作液，涡旋混匀后加入乙酸乙酯，离心；取上层清液至深孔板中，氮吹吹干；加入乙腈-水复溶，涡旋混匀，得到待测样品；
(2)试样测定：
取待测样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰，得到血浆样品中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯浓度；
色谱条件：
色谱柱：C18，粒径1.7 μm，柱内径2.1 mm，柱长150 mm；色谱柱温：30±1℃；流动相A：30%甲醇-乙腈；流动相B：0.5mM乙酸铵-水；
质谱条件：
离子源为电喷雾离子源；用醋酸根加合离子作为母离子，离子对：硝酸异山梨酯295→59；2-单硝酸异山梨酯250→59，5-单硝酸异山梨酯250→59为检测通道；负离子方式检测；
采用梯度洗脱，流速为0 .25mL/min，所述梯度洗脱的程序如下表：
Figure 748527DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，液相色谱条件中：自动进样器温度为6℃；进样量为20uL；分析时间为13min。
3.根据权利要求1所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，质谱条件中：喷雾电压为-4500V，雾化温度为450℃，雾化气压力为45Psi；和/或辅助加热气压力为45 Psi；气帘气压力为35 Psi；碰撞室入口电压为-10eV；碰撞室出口电压为-7eV。
4.根据权利要求1所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，所述硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作液的浓度分别为：500±1ng/uL；和/或300 uL的血浆样品中加入10±1 uL的内标工作液。
5.根据权利要求1所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，色谱条件：进样器温度：6℃， 色谱柱温：30℃；进样量：20.00 μL，流速0.250 mL/min，洗针液：强洗液：10%水-乙腈；弱洗液：10%乙腈-水。
6.根据权利要求1-5任一项所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，色谱柱温：30℃；流动相A：30%甲醇-乙腈；流动相B：0.5mM乙酸铵-水。
7.根据权利要求4所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，血浆样品预处理：取300 µL血浆样品，加入10 µL硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的内标工作溶液；涡旋混匀后，加入1250 µL乙酸乙酯萃取剂，涡旋15 min并15700 g条件下离心10 min离心后；移取900 µL上清液至96孔板中，氮吹吹干；加入100 µL 10%乙腈-水复溶，涡旋10 min；得到待测样品。
8.根据权利要求1所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，还包括建立标准曲线方程，包括以下步骤：取285 uL空白血浆8份置于EP管中，以待测物工作溶液的形式分别添加15uL浓度分别为3 ng/mL、20 ng/mL、20ng/mL，6 ng/mL、40 ng/mL、40 ng/mL，12 ng/mL、80 ng/mL、80 ng/mL，24 ng/mL、160 ng/mL、160 ng/mL，96 ng/mL、640 ng/mL、640 ng/mL，192 ng/mL、1280 ng/mL、1280 ng/mL，576ng/mL、3840 ng/mL、3840 ng/mL，720 ng/mL、4800 ng/mL、4800 ng/mL的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯配置成最低定量下限标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限标样8；涡旋混匀后加入10 uL的500ng/uL、500ng/uL、500ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液；取300 uL空白血浆2份，一份加入500ng/uL、500ng/uL、500 ng/uL的内标硝酸异山梨酯-13C6/5-单硝酸异山梨酯-13C6/2-单硝酸异山梨酯-13C6工作溶液10 uL，一份加入10 uL 20%乙腈-水；另取300 uL超纯水加入10 uL 20%乙腈-水，涡旋混匀后分别向11份样本中加入1250 uL乙酸乙酯；涡旋15 min，离心；取上层清液900 uL至96深孔板中，氮吹吹干；加入100µL 10%乙腈-水复溶，涡旋10 min；后分别作为11份标准样品待检测；
分别取20 uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯的浓度。
9.根据权利要求8所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，采用内标法，以硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6和2-单硝酸异山梨酯-13C6的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的浓度。
10.根据权利要求1-5任一项所述的血浆中硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的检测方法，其特征在于，所述血浆为人的血浆。
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