CN111198235A - 一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法 - Google Patents

一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法，属于药物分析领域。本发明建立了一种基于沉淀法和液质联用技术的血浆中异橙黄酮检测方法，可用于检测生物体内的异橙黄酮浓度，为临床和基础研究提供可靠的分析手段，本发明使用蛋白质沉淀法处理含异橙黄酮的血浆样品，通过一步沉淀反应去除杂质和内源性干扰物，在高效液相色谱的分离过程中，向流动相中加入了一定的甲酸，使异橙黄酮在电离后形成更多的加氢的准分子离子峰，对应的特征性碎片离子的丰度随之升高，提高了检测得灵敏度；在定量的过程中，以石吊兰素为内标物，通过准分子离子峰→子离子的特异性的、高灵敏度的监测实现对异橙黄酮的定量检测。

Description

一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法。
背景技术
异橙黄酮是一种多甲氧基黄酮，广泛存在于多种柑橘类植物中，具有多种生物活性。分子式为C20H20O7，分子量为372.1。异橙黄酮具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗增殖和抗氧化作用。此外，异橙黄酮与其他药物之间还可能存在药物相互作用，同时服用时能够提高一些药物的血浆药物浓度。对于以异橙黄酮为代表的多甲氧基黄酮的研究正日益增多，测定其在生物体内的血浆药物浓度对于评价药物疗效和分析药理作用等方面具有很重要的作用。据研究报道，液相色谱、紫外光谱、核磁和液质联用等手段已经用于柑橘提取物中异橙黄酮的检测，但这些方法无法定量检测生物样本中的异橙黄酮。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法。本发明提基于沉淀法和液质联用技术进行血浆中异橙黄酮检测，可用于检测生物体内的异橙黄酮浓度，提供了一种快速、准确、稳定的检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法，包括以下步骤：
将含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中异橙黄酮的含量，所述标准曲线以异橙黄酮的浓度为横坐标，以异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标；
所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为安捷伦ZORBAX EclipsePlus C18 RRHD色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1vol％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱程序为0～0.5分钟，流动相B的体积百分含量从95％下降到5％；0.5～1.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％；1.5～1.6分钟，流动相B的体积百分含量从5％上升到95％；1.6～3.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％，流速为0.6mL/min，柱温为20℃，进样量为2μL；
所述液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，采用多反应监测扫描模式，所述异橙黄酮的离子对为373.1→343.1和373.1→153.1，所述离子对373.1→343.1为定量离子对，所述离子对373.1→153.1为定性离子对，所述石吊兰素的离子对为345.1→315.1，所述异橙黄酮的碰撞能量为29eV，所述石吊兰素的碰撞能量为28eV，干燥气流速为10L/h，干燥气温度为350℃，雾化气压力为45psi。
优选地，所述含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈的体积比为30:3:500，所述石吊兰素的甲醇溶液的浓度为2.5μg/mL。
优选地，所述沉淀反应后还包括将所得沉淀反应产物在14000g条件下离心10分钟。
优选地，所述标准曲线由包括以下步骤的方法制得：称量1mg异橙黄酮，用甲醇溶解得到1mg/mL的异橙黄酮母液，用甲醇将所述异橙黄酮母液稀释成10、40、150、600、2500、5000和10000ng/mL的标准曲线工作液，分别将3μL所述标准曲线工作液加到微型离心管中，然后通入氮气将溶剂挥干，接着使用30μL空白血浆复溶异橙黄酮，得到1、4、15、60、250、500和1000ng/mL的标准曲线样品，将所述标准曲线样品、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以异橙黄酮的浓度为横坐标，异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述标准曲线。
本发明提供了一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法，包括以下步骤：
将含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中异橙黄酮的含量，所述标准曲线以异橙黄酮的浓度为横坐标，以异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标，所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1vol％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱程序为0～0.5分钟，流动相B的体积百分含量从95％下降到5％；0.5～1.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％；1.5～1.6分钟，流动相B的体积百分含量从5％上升到95％；1.6～3.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％，流速为0.6mL/min，柱温为20℃，进样量为2μL；所述液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，采用多反应监测扫描模式，所述异橙黄酮的离子对为373.1→343.1和373.1→153.1，所述离子对373.1→343.1为定量离子对，所述离子对373.1→153.1为定性离子对，所述石吊兰素的离子对为345.1→315.1，所述异橙黄酮的碰撞能量为29eV，所述石吊兰素的碰撞能量为28eV，干燥气流速为10L/h，干燥气温度为350℃，雾化气压力为45psi。本发明建立了一种基于沉淀法和液质联用技术的血浆中异橙黄酮检测方法，可用于检测生物体内的异橙黄酮浓度，为临床和基础研究提供可靠的分析手段，本发明使用蛋白质沉淀法处理含异橙黄酮的血浆样品，通过一步沉淀反应去除杂质和内源性干扰物，在高效液相色谱的分离过程中，向流动相中加入了一定的甲酸，使异橙黄酮在电离后形成更多的加氢的准分子离子峰，对应的特征性碎片离子的丰度随之升高，提高了检测得灵敏度；在定量的过程中，以石吊兰素为内标物，通过准分子离子峰→子离子的特异性的、高灵敏度的监测实现对异橙黄酮的定量检测。本发明的检测方法具有样品用量少、操作简便、灵敏度高和回收率稳定的特点，且能够实现快速检测，适合用于生物样本中异橙黄酮的检测。
附图说明
图1为空白血浆中异橙黄酮的色谱图；
图2为空白血浆中内标物质的色谱图；
图3为加入内标后的含1ng/mL(定量限)异橙黄酮的血浆中异橙黄酮的色谱图；
图4为加入内标后的含1ng/mL(定量限)异橙黄酮的血浆中内标物质的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法，包括以下步骤：
将含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中异橙黄酮的含量，所述标准曲线以异橙黄酮的浓度为横坐标，以异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标；
所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为安捷伦ZORBAX EclipsePlus C18 RRHD色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1vol％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱程序为0～0.5分钟，流动相B的体积百分含量从95％下降到5％；0.5～1.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％；1.5～1.6分钟，流动相B的体积百分含量从5％上升到95％；1.6～3.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％，流速为0.6mL/min，柱温为20℃，进样量为2μL；
所述液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，采用多反应监测扫描模式，所述异橙黄酮的离子对为373.1→343.1和373.1→153.1，所述离子对373.1→343.1为定量离子对，所述离子对373.1→153.1为定性离子对，所述石吊兰素的离子对为345.1→315.1，所述异橙黄酮的碰撞能量为29eV，所述石吊兰素的碰撞能量为28eV，干燥气流速为10L/h，干燥气温度为350℃，雾化气压力为45psi。
在本发明中，所述含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈的体积比优选为30:3:500，所述石吊兰素的甲醇溶液的浓度优选为2.5μg/mL。在本发明中，所述石吊兰素为内标物，所述乙腈为沉淀剂。
在本发明中，所述沉淀反应后优选还包括将所得沉淀反应产物在14000g条件下离心10分钟。
在本发明中，所述标准曲线优选由包括以下步骤的方法制得：称量1mg异橙黄酮，用甲醇溶解得到1mg/mL的异橙黄酮母液，用甲醇将所述异橙黄酮母液稀释成10、40、150、600、2500、5000和10000ng/mL的标准曲线工作液，分别将3μL所述标准曲线工作液加到微型离心管(EP管)中，然后通入氮气将溶剂挥干，接着使用30μL空白血浆复溶异橙黄酮，得到1、4、15、60、250、500和1000ng/mL的标准曲线样品，将所述标准曲线样品、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以异橙黄酮的浓度为横坐标，异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述标准曲线。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的血浆中异橙黄酮含量的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.仪器和试药
1)分析仪器
液质联用仪为安捷伦1290UHPLC-6420三重四级杆质谱仪系统，配有1290四元泵、1290自动进样器、1260柱温箱、电喷雾离子源和MassHunter工作站。色谱柱为安捷伦ZORBAXEclipse Plus C18 RRHD色谱柱。
2)试剂
异橙黄酮和石吊兰素由成都曼思特生物科技有限公司提供，含量均大于99％；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，其他试剂为分析纯，水由Millipore纯水机制备。
2.实验方法与结果
1)溶液配制
标准品溶液配制：精密称量约1mg异橙黄酮标准品，用一定量的甲醇溶解得到1mg/mL的异橙黄酮母液。用甲醇将母液稀释成10、40、150、600、2500、5000和10000ng/mL的标准曲线工作液。
内标工作液配制：精密称量约1mg石吊兰素标准品，用一定量的甲醇溶解，配成1mg/mL的内标母液。用甲醇进一步将内标母液稀释为2500ng/mL的内标工作液。
2)含异橙黄酮的血浆样品预处理
精确吸取30μL含异橙黄酮的血浆，加入3μL含2.5μg/mL石吊兰素的甲醇溶液后涡旋混匀，混匀后加入500μL沉淀剂乙腈，混匀后放入高速离心机，在14000g条件下离心10分钟。离心后可见无色透明的上清液，将上清液加到插有内插管的进样瓶中，启动液质联用仪检测程序对异橙黄酮进行检测。
3)高效液相色谱条件
高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD色谱柱；流动相为含0.1vol％甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0～0.5分钟，流动相B的体积百分含量从95％下降到5％；0.5～1.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％；1.5～1.6分钟，流动相B的体积百分含量从5％上升到95％；1.6～3.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％，流速不变，为0.6mL/min；色谱柱温度设置为20℃；进样量设置为2μL。
表1液相梯度洗脱程序
Figure BDA0002364556990000061
4)三重四级杆质谱检测条件
离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下运行；干燥气流速设置为10L/h；干燥气温度设置为350℃；雾化气压力设置为45psi；采用多反应监测(MRM)扫描模式；异橙黄酮的离子对为373.1→343.1和373.1→153.1，其中前者为定量离子对，后者为定性离子对；内标石吊兰素的离子对为345.1→315.1。
5)标准曲线的建立
将3μL不同浓度的标准曲线工作液分别加到空EP管中，氮气吹干后加入30μL空白血浆复溶，获得最终浓度为1、4、15、60、250、500和1000ng/mL的标准曲线样品。向以上样品中分别加入3μL内标工作液，混匀后加入500μL沉淀剂乙腈，混匀后在14000g条件下离心10分钟，取上清液进样检测。获得峰面积数据后，使用masshunter工作站对数据进行分析，求得标准曲线为y＝3.946281*x+0.021343，线性范围是1～1000ng，相关系数r2为0.995，定量下线为1ng/mL。
取6只大鼠的空白血浆各30μL，按“含异橙黄酮的血浆样品预处理”项操作，但不加入3μL内标溶液，而加入3μL甲醇，异橙黄酮和内标物质的代表性色谱图分别为图1和图2；图3和图4分别为定量限(1ng/mL)下异橙黄酮和内标物质的色谱图。结果表明，血浆中的内源性物质不会干扰异橙黄酮的定量检测，该方法特异性强，灵敏度高。
6)精密度和准确度考察
按标准曲线样品的配制方法，分别配制含2、400、800ng/mL异橙黄酮的质控样品，每个浓度独立配制6个样本，连续检测3天。根据当天配制的标准曲线，计算质控样品的浓度，进而计算日间、日内精密度和准确度，结果如表2和表3所示。从表2和表3的数据可以看出，本发明公开的方法的日内、日间准确度和精密度均在±15％范围以内，说明该方法准确且可重复，适合推广。
表2精密度实验结果
浓度(ng/mL) 日内精密度(RSD％) 日间精密度(RSD％)
2 11.1 11.0
400 5.0 8.6
800 6.4 9.1
表3准确度实验结果
浓度(ng/mL) 日内准确度(％) 日间准确度(％)
2 107.3 102.6
400 102.7 98.0
800 90.1 92.2
7)提取回收率和基质效应考察
将质控样品按“含异橙黄酮的血浆样品预处理”项处理，得峰面积A；取30μL空白血浆，加入500μL沉淀剂，混匀离心后取上清液到新的EP管，加入3μL相应的标准品及内标，混匀后进样检测，得峰面积B；取30μL纯水，依次加入3μL标准品、3μL内标和500μL沉淀剂，混匀检测后得峰面积C。峰面积A与B的比值为回收率，而峰面积B与C的比值则为基质效应，结果如表4所示。表4说明各浓度的异橙黄酮的提取回收率较稳定，在83～88％范围内，基质效应在105～109％范围内，说明本方法回收率高且稳定，不存在明显的离子促进或抑制现象。内标的回收率和基质效应和异橙黄酮相似，说明石吊兰素适合作为异橙黄酮定量检测的内标。
表4提取回收率和基质效应
Figure BDA0002364556990000081
从以上结果可以看出，本发明公开的基于沉淀法和液质联用技术的血浆中异橙黄酮定量检测法能够快速、稳定地检测生物样本中异橙黄酮的浓度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种血浆中异橙黄酮含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中异橙黄酮的含量，所述标准曲线以异橙黄酮的浓度为横坐标，以异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标；
所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse PlusC18 RRHD色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1vol％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，洗脱程序为0～0.5分钟，流动相B的体积百分含量从95％下降到5％；0.5～1.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％；1.5～1.6分钟，流动相B的体积百分含量从5％上升到95％；1.6～3.5分钟，流动相B的体积百分含量保持为95％，流速为0.6mL/min，柱温为20℃，进样量为2μL；
所述液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，采用多反应监测扫描模式，所述异橙黄酮的离子对为373.1→343.1和373.1→153.1，所述离子对373.1→343.1为定量离子对，所述离子对373.1→153.1为定性离子对，所述石吊兰素的离子对为345.1→315.1，所述异橙黄酮的碰撞能量为29eV，所述石吊兰素的碰撞能量为28eV，干燥气流速为10L/h，干燥气温度为350℃，雾化气压力为45psi。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含异橙黄酮的血浆、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈的体积比为30:3:500，所述石吊兰素的甲醇溶液的浓度为2.5μg/mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述沉淀反应后还包括将所得沉淀反应产物在14000g条件下离心10分钟。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线由包括以下步骤的方法制得：称量1mg异橙黄酮，用甲醇溶解得到1mg/mL的异橙黄酮母液，用甲醇将所述异橙黄酮母液稀释成10、40、150、600、2500、5000和10000ng/mL的标准曲线工作液，分别将3μL所述标准曲线工作液加到微型离心管中，然后通入氮气将溶剂挥干，接着使用30μL空白血浆复溶异橙黄酮，得到1、4、15、60、250、500和1000ng/mL的标准曲线样品，将所述标准曲线样品、石吊兰素的甲醇溶液以及乙腈混合进行沉淀反应，将所得上清液进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以异橙黄酮的浓度为横坐标，异橙黄酮和石吊兰素的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述标准曲线。
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