CN116106432A - 一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物检测技术领域，特别是涉及一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法。包括以下步骤：1)供试品溶液的制备；2)对照溶液的制备；3)系统适应性对照品溶液的制备；4)检测。本发明采用优化条件的前处理和检测方法，能够使目标组分和干扰物有效分离，且确定了红霉素氧化杂质(干扰物H)，保证了红霉素药膏产品的质量，中国药典红霉素有关物质的杂质谱进行补充完善，使其质量标准得到提升。

Description

一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，特别是涉及一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定 方法。
背景技术
红霉素软膏是红霉素与适量基质均匀混合制成的半固体制剂，其原料药红霉素是由红霉 素链霉菌发酵产生，为大环内酯类抗生素。红霉素软膏的现行法定检测标准收载于《中国药 典》2020年版二部，标准中含性状、化学鉴别、装量、粒度、微生物限度检查、含量测定等 项目。然而仅根据法定检测标准，无法对红霉素软膏质量进行真正全面的比较，对于药物质 量而言，有关物质是一个重要的评价指标。但是，目前现有的红霉素软膏检验方法中无法对 红霉素软膏的有关物质进行快速、准确的测定(仅存在红霉素原料的有关物质检测方法，收 载于《中国药典》2020年版二部)，所以根据现有的红霉素软膏检测方法所得出的结果无法 反映出红霉素软膏的真实质量。
因此，急需开发出一种可以真实反映出红霉素软膏的真实质量的检测方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种红霉素药膏中主要物质及干 扰物的测定方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测 定方法，包括以下步骤：红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入石油醚溶解，并加入磷酸盐的醇溶液 萃取、静置分层，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入磷酸盐的醇溶液稀释并定容、摇匀作为对照 溶液；
3)系统适应性对照品溶液的制备：在系统适应性对照品加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定 容，摇匀，得到系统适应性对照品溶液；所述系统适应性对照品包括红霉素A、红霉素B、 红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H；
4)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适应性对照品溶液， 将获得的供试品溶液的液相色谱图，与系统适应性对照品溶液的液相色谱图进行比较，并根 据自身对照法获得相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中红霉素A、红霉素B、红 霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H的含 量。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤1)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与石 油醚加入的体积ml之比为4:12～4:15。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐 的醇溶液加入的体积ml之比为4：5～4：15。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，所述磷酸盐的醇溶液选自磷酸盐甲醇；优选 的，所述磷酸盐甲醇为含体积百分比为60％以上的磷酸盐的甲醇溶液，其中，所述磷酸盐的 pH为7.5～8.5。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，所述萃取的温度为20℃～30℃，萃取时间为 2min～10min。
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钾。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，所述系统适应性对照品加入的质量mg，与甲 醇加入的体积ml之比为25：2～25：5。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，所述系统适应性对照品加入的质量mg，与磷 酸盐加入的体积ml之比为25：3～25：7.5。
在本发明的一些实施方式中，步骤3)中，磷酸盐选自磷酸氢二钾，所述磷酸盐的pH为 7.9～8.1。
在本发明的一些实施方式中，步骤4)中，所述高效液相色谱法的色谱条件包括如下条 件的任一项或多项：
色谱柱：Waters XTERRA C18色谱柱，250mm×4.6mm，3.5μm；
检测波长：205～215nm；
流动相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈，其中，A相：水、磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比 为32～37：2～8：57～63；B相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈的体积比为47～53：2～8：42～48；
进样量为90～100μl；
流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：60～68℃；
分析时间：75min；
梯度洗脱。
在本发明的一些实施方式中，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-48min，A相：B相体积比为98：2～98：2；
48-50min，A相：B相体积比为98：2～0：100；
50-57min，A相：B相体积比为0：100～0：100；
57-58min，A相：B相体积比为0：100～98：2；
58-75min，A相：B相体积比为98：2～98：2。
本发明另一方面提供一种红霉素药膏中干扰物H的测定方法，包括以下步骤：
a)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入氧化剂氧化、甲醇溶解，并加入磷 酸盐溶液稀释定容后，得到供试品溶液；
b)干扰物H对照品溶液的制备：取干扰物H对照品，加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到干扰物H对照品溶液，其中，所述干扰物H对照品为氧化红霉素A；
c)检测：采用液相色谱-质谱联用分别测定供试品溶液、干扰物H对照品溶液，将获得的 供试品溶液的液相色谱图，与干扰物H对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时 间和色谱峰面积，确定供试品溶液中干扰物H的含量；并根据质谱测定干扰物H分子量。
在本发明的一些实施方式中，步骤a)中，所述氧化剂选自双氧水，优选的，所述红霉素 药膏样品加入的质量g，与双氧水加入的体积ml之比为20:1～20:3；更优选的，所述双氧水的 溶液浓度为8～15％。
在本发明的一些实施方式中，步骤a)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与甲醇加 入的体积ml之比为25:2～25:5。
在本发明的一些实施方式中，步骤a)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐加 入的体积ml之比为25:3～25:7.5。
在本发明的一些实施方式中，步骤a)和/或步骤b)中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钾，所 述磷酸氢二钾的pH值为7.9～8.1。
在本发明的一些实施方式中，步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与甲醇 加入的体积ml之比为25:2～25:5。
在本发明的一些实施方式中，步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与磷酸盐 加入的体积ml之比为25:3～25:7.5。
在本发明的一些实施方式中，所述干扰物H的分子量为749.93，结构式为：
Figure BDA0003350406680000041
在本发明的一些实施方式中，所述步骤c)中液相色谱-质谱联用的条件为包括如下条件 的任一项或多项：
检测器：紫外检测器，质谱检测器；
检测波长：205～215nm；
色谱柱型号：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相：乙腈-醋酸铵溶液，其中，乙腈：醋酸铵溶液的体积比为30～40：60～70；
柱温：35～50℃；
离子模式：正离子模式；
气体温度：320～340℃；
干燥气流速：8～11L/min；
雾化器表压：33～37psig；
扫描范围：300～1500m/z；
方法梯度：等度。
附图说明
图1为实施例2检测的红霉素A氮氧化物(干扰物H)MS谱图。
图2为红霉素A氮氧化物(干扰物H)定位色谱图。
图3为实施例1的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明的在红霉素及其软膏有关物质研究过程中，通过优化检测条件发现一干扰物在氧 化研究过程中会出现明显的增长且该干扰物为氧化降解干扰物中的主要干扰物，会严重影响 药品的质量，但在红霉素原料已知干扰物谱中并未对该干扰物进行准确的定性及定量。因此， 对于红霉素软膏质量判定而言，如何为红霉素软膏有关物质控制提供较为可靠的检测及萃取 方法是需要解决的主要问题；同时，在药品质控越来越严格的今天，对现有干扰物谱进行补 充、不断提升质量标准更是一件十分重要的事。且本发明经过研究明确该干扰物的结构(红 霉素氮氧化物化)，可增订至原料及制剂有关物质的已知干扰物谱中，对国内红霉素有关物质 已知干扰物谱进行补充，提升质量标准。
本发明一方面提供一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入石油醚溶解，并加入磷酸盐的醇溶液 萃取、静置分层，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入磷酸盐的醇溶液稀释并定容、摇匀作为对照 溶液；
3)系统适应性对照品溶液的制备：在系统适应性对照品加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定 容，摇匀，得到系统适应性对照品溶液；所述系统适应性对照品包括红霉素A、红霉素B、 红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H；
4)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适应性对照品溶液， 将获得的供试品溶液的液相色谱图，与系统适应性对照品溶液的液相色谱图进行比较，并根 据自身对照法获得相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中红霉素A、红霉素B、红 霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H的含 量。
本发明所提供的红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法中，步骤1)中是关于供试 品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入石油醚溶解，并加入磷酸盐的醇溶液萃取、静置 分层，取续滤液作为供试品溶液。
进一步的，步骤1)中，需要先将红霉素药膏样品加入一定量的石油醚溶解，在一实施 例中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与石油醚加入的体积ml之比为4:12～4:15。在一些 具体实施例中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与石油醚加入的体积ml之比也可以为 4:12～4:13、4:13～4:14、或4:14～4:15等。
进一步的，步骤1)中，溶解后的红霉素药膏样品需要加入一定量的萃取剂萃取，所述萃 取剂例如可以为磷酸盐的醇溶液。具体的，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐的 醇溶液加入的体积ml之比为4：5～4：15。在一些具体实施例中，所述红霉素药膏样品加入 的质量g，与磷酸盐的醇溶液加入的体积ml之比还可以为4：5～4：10、4：10～4：15、4：5～4：8、4：8～4：10、4：10～4：12、或4：12～4：15等，优选为4：10。
进一步的，步骤1)中，所述磷酸盐的醇溶液选自磷酸盐甲醇。优选的，所述磷酸盐甲 醇为含体积百分比为60％以上的磷酸盐的甲醇溶液，其中，所述磷酸盐的pH可以为7.5～8.5、 7.5～8.0、8.0～8.5、7.5～7.8、7.8～8.0、8.0～8.2、或8.2～8.5等。
进一步的，步骤1)中，所述萃取的温度可以为20℃～30℃、20℃～25℃、或25℃～30℃ 等。萃取时间可以为2min～10min、2min～5min、5min～8min、或8min～10min等。更具体的， 步骤1)中，所述磷酸盐的醇溶液是少量多次的精密加入，每次加入后均震荡萃取30～60s， 待萃取剂加完后，再次振荡2min，静置分层。
进一步的，步骤1)中，所述过滤为滤膜过滤(例如可以是尼龙)。所述滤膜过滤采用的滤 膜可以为0.22μm～0.45μm的滤膜，所述滤膜的孔径也可以为0.22μm～0.30μm、0.30μm～0.40μm、 或0.40μm～0.45μm等。优选地，步骤1)中，所述续滤液是指：过滤膜时，初滤液后的溶液 即为续滤液。
本发明所提供的红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法中，步骤2)是对照溶液的制 备：移取供试品溶液，加入磷酸盐的醇溶液稀释并定容、摇匀作为对照溶液。
进一步的，精密移取供试溶液1ml置于100ml量瓶中，加磷酸盐的醇溶液溶解并稀释至 刻度，摇匀，作为对照溶液。其中，磷酸盐的醇溶液的具体选择同步骤1)。
本发明所提供的红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法中，步骤3)中是系统适应 性对照品溶液的制备：在系统适应性对照品加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到 系统适应性对照品溶液。
进一步的，步骤3)中，所述系统适应性对照品包括红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H。系统适应性对照 品溶液可以是直接购买，例如红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰 物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F的混标可以自中国食品药品检定研究院购买对照品。 也可以是自行配置。自行配置例如可以将红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰 物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H的标准品混合后作为系统适应 性对照品使用。具体配置的方法是公知的。
进一步的，步骤3)中，需要先将系统适应性对照品加入一定的甲醇进行溶解，具体的， 所述系统适应性对照品加入的质量mg，与甲醇加入的体积ml之比可以为25：2～25：5、25： 2～25：3、25：4～25：4、或25：4～25：5等。优选为25：4。
进一步的，步骤3)中，溶解后的系统适应性对照品需要再加入磷酸盐稀释，所述系统适 应性对照品加入的质量mg，与磷酸盐加入的体积ml之比可以为25：3～25：7.5、25：3～25： 4、25：4～25：5、25：5～25：6、或25：6～25：7.5等。在一具体实施例中，步骤3)中，磷 酸盐选自磷酸氢二钾，所述磷酸盐的pH可以为7.9～8.1、7.9～8.0、或8.0～8.1等。在一具体实 施例中，通过磷酸盐稀释后，每1ml系统适应性对照品溶液中含有4mg的系统适应性对照品。
进一步的，步骤3)中，所述红霉素A的CAS号为114-07-8。所述红霉素A的分子式为C37H67NO13。所述红霉素B的CAS号为527-75-3。所述红霉素B的分子式为C37H67NO12。所 述红霉素C的CAS号为1675-02-1。所述红霉素C的分子式为C36H65NO13。
干扰物A是红霉素F，分子式为C37H67NO14；结构式为：
Figure BDA0003350406680000071
干扰物B为N-去甲基红霉素A，分子式为C36H65NO13；结构式为：
Figure BDA0003350406680000072
干扰物C为红霉素E，分子式C37H65NO14；结构式为：
Figure BDA0003350406680000081
干扰物D为脱水红霉素A，分子式为C37H65NO12；结构式为：
Figure BDA0003350406680000082
干扰物E为红霉素A烯醇醚，分子式为C37H65NO12；结构式为：
Figure BDA0003350406680000083
干扰物F为表红霉素A烯醇醚，分子式为C37H65NO12；结构式为：
Figure BDA0003350406680000091
干扰物H为氧化红霉素A，其结构式为：
Figure BDA0003350406680000092
进一步地，步骤3)中，所述系统适应性对照品溶液选自单一浓度的红霉素A、红霉素B、 红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H的混 合溶液或一系列不同浓度的红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、 干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H的混合溶液中的一种。进一步优选地，所述标准 品溶液为单一浓度的红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰 物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H的混合溶液。
本发明所提供的红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法中，步骤4)是检测：采用 高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适应性对照品溶液，将获得的供试品 溶液的液相色谱图，与系统适应性对照品溶液的液相色谱图进行比较，并根据自身对照法获 得相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、 干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H的含量。
进一步的，步骤4)中，所述高效液相色谱法的色谱条件包括：
色谱柱：Waters XTERRA C18色谱柱，250mm×4.6mm，3.5μm。
检测波长：205～215nm。在一些实施例中，检测波长也可以为205～210nm、或210～215nm 等。
流动相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈，其中，A相：水、磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为 32～37：2～8：57～63；优选为35：5：60。B相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈的体积比为47～53： 2～8：42～48；优选为50：5：45。
进样量为90～100μl。在一些实施例中，进样量例如可以为90～95μl、或95～100μl等。
流速：0.8～1.2ml/min。在一些实施例中，流速例如可以为0.8～1.0ml/min；或1.0～1.2ml/min 等。
柱温为60～68℃。在一些实施例中，柱温例如可以为60～65℃、或65～68℃。
分析时间：75min。
梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为(见表1)：
0-48min，A相：B相体积比为98：2～98：2；
48-50min，A相：B相体积比为98：2～0：100；
50-57min，A相：B相体积比为0：100～0：100；
57-58min，A相：B相体积比为0：100～98：2；
58-75min，A相：B相体积比为98：2～98：2。
表1.高效液相梯度表
时间(min) A(％) B(％)
0 98 2
48 98 2
50 0 100
57 0 100
58 98 2
75 98 2 
进一步的，步骤4)中，具体操作时，还需要主峰的标准品溶液的配置，目的是调节色 谱柱效，使得拖尾因子合格。其中主峰的标准品可以购买，里面含有红霉素A、红霉素B和红霉素C。将其加入4ml甲醇溶解后，用pH为7.9～8.1的磷酸盐(磷酸氢二钾)定量稀释制 成每1ml主峰的标准品溶液含有4mg的主峰标准品。
步骤4)中，还包括灵敏度溶液的配置，将对照品溶液进一步的采用步骤1)中的磷酸盐 的醇溶液稀释定容制成每1ml灵敏度溶液中约含4μg的红霉素药膏样品。
进样时，先将对照溶液在高效液相色谱法中进样，获得主峰(红霉素A、红霉素B和红 霉素C的液相色谱图)，作为采用自身计算法后续峰面积计算的分母。再将灵敏度溶液在高 效液相色谱法中进样，排除特别小的干扰物峰，不参与计算。再将供试品溶液在高效液相色 谱法中进样，获得红霉素A、红霉素B和红霉素C的干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰 物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H液相色谱图。并根据自身对照法获得相对保留时间和 色谱峰面积。
其中自身对照法计算的公式为
Figure BDA0003350406680000111
其中：
A样—供试品溶液中干扰物峰面积；
A对—对照溶液中主峰面积；可得到相应红霉素药膏及其他干扰物的含量。
期间，记录色谱图，与红霉素系统适用性对照品的标准图谱一致，红霉素A峰的保留时 间约为23分钟，当前实验人员选定检验的物质：干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物H和干扰物F的相对保留时间分别约为0.4、0.5、0.9、1.6、2.3、0.3和1.8，红霉素B和红霉素C的相对保留时间分别约为1.7和0.55，干扰物B峰和红霉素C峰、红霉 素B峰和干扰物F峰之间的分离度应不小于1.2，干扰物C峰和红霉素A峰之间的分离度应 符合要求。
名称 限度 备注
干扰物A ≤2.0％ 校正因子：1.00
干扰物B ≤2.0％ 校正因子：1.00
干扰物C ≤3.0％ 校正因子：1.00
干扰物D ≤2.0％ 校正因子：2.00
干扰物E ≤2.0％ 校正因子：0.08
干扰物F ≤2.0％ 校正因子：0.08
干扰物H ≤3.0％ 校正因子：1.00
未知单杂 ≤2.0％ 校正因子：1.00
总杂 ≤7.0％ N/A 
本发明另一方面提供了一种红霉素药膏中干扰物H的测定方法，包括以下步骤：
a)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入氧化剂氧化、甲醇溶解，并加入磷酸 盐溶液稀释定容，得到供试品溶液；
b)干扰物H对照品溶液的制备：取干扰物H对照品，加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到干扰物溶液，其中，所述干扰物H为氧化红霉素A；
c)检测：采用液相色谱-质谱联用分别测定供试品溶液、干扰物H对照品溶液，将获得 的供试品溶液的液相色谱图，与干扰物H对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留 时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中干扰物H的含量；并根据质谱测定干扰物H分子量。
本发明所提供的红霉素药膏中干扰物H的测定方法中，所述步骤a)是供试品溶液的制 备：称取红霉素药膏样品，加入氧化剂氧化、甲醇溶解，并加入稀释定容后，得到供试品溶 液。本发明中通过氧化剂对样品氧化强降解，过度氧化降解后得到较高纯度的干扰物。
进一步的，步骤a)中，在氧化剂氧化步骤中，所述氧化剂例如可以选自双氧水等。优 选的，所述红霉素药膏样品加入的质量mg，与双氧水加入的体积ml之比可以为20:1～20:3、 20:1～20:2、或20:2～20:3等。更优选的，所述双氧水的溶液浓度可以为8～15％、8～10％、或 10～15％等。通常情况下，氧化后需要放置一定的时间，放置的时间没有特殊限定，例如可以 是2h。
进一步的，步骤a)中，需要加入一定量的甲醇对红霉素药膏样品进行溶解。具体的， 所述红霉素药膏样品加入的质量g，与甲醇加入的体积ml之比可以为25:2～25:5、25:2～25:3、 25:3～25:4、或25:4～25:5等。
进一步的，步骤a)中，需要加入一定量的磷酸盐作为稀释剂对溶解后的样品进行稀释定 容。所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐加入的体积ml之比可以为25:3～25:7.5、25： 3～25：4、25：4～25：5、25：5～25：6、或25：6～25：7.5等。优选的，磷酸盐选自磷酸氢二 钾，所述磷酸氢二钾的pH值可以为7.9～8.1、7.9～8.0、或8.0～8.1等。在一具体实施例中，采 用磷酸盐(例如磷酸氢二钾)定量稀释制成每1ml供试品溶液中约含4mg红霉素药膏样品。
本发明所提供的红霉素药膏中干扰物H的测定方法中，步骤b)中是取干扰物H对照品， 加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到干扰物H对照品溶液。其中，所述干扰物H对照品为氧化红霉素A。
进一步的，步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与甲醇加入的体积ml之比可以为25:2～25:5、25:2～25:3、25:3～25:4、或25:4～25:5等。
进一步的，步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与磷酸盐加入的体积ml之 比为25:3～25:7.5、25：3～25：4、25：4～25：5、25：5～25：6、或25：6～25：7.5等。
进一步的，步骤b)中，磷酸盐选自磷酸氢二钾，所述磷酸氢二钾的pH值可以为7.9～8.1、 7.9～8.0、或8.0～8.1等。
进一步的，干扰物H对照品CAS号：992-65-4。
本发明所提供的红霉素药膏中干扰物H的测定方法中，步骤c)是检测：采用液相色谱- 质谱联用分别测定供试品溶液、干扰物H对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图， 与干扰物H对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试 品溶液中干扰物H的含量；并根据质谱测定干扰物H分子量。
记录色谱图，UV检测器下氧化干扰物H的峰保留时间约为7分钟。质谱检测器下测得 所述干扰物H的分子量为749.93。
干扰物H的结构式为：
Figure BDA0003350406680000131
进一步的，所述步骤c)中液相色谱-质谱联用的条件包括：
检测器：紫外检测器，质谱检测器。
检测波长：205～215nm。在一些实施例中，检测波长也可以为205～210nm、或210～215nm 等。
色谱柱型号：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
流动相：乙腈-醋酸铵溶液，其中，乙腈：醋酸铵溶液的体积比为30～40：60～70。在一 些实施例中，乙腈：醋酸铵溶液的体积比例如可以为30～35：60～65、35～40：65～70。优选为 35:65。
柱温：35～50℃。在一些实施例中，柱温例如可以为35～40℃、40～50℃等。优选为40℃。
离子模式：正离子模式。
Gas Temp气体温度：320～340℃。在一些实施例中，气体温度例如可以为320～330℃、或 330～340℃等。
Drying Gas Flow干燥气流速：8～11L/min。在一些实施例中，干燥气流速例如可以为 8～10L/min、或10～11L/min等。
Nebulizer雾化器表压：33～37psig。在一些实施例中，雾化器表压例如可以为33～35psig、 或35～37psig等。
Range扫描范围：300～1500m/z。在一些实施例中，扫描范围例如可以为300～500m/z、 500～1000m/z、或1000～1500m/z等。
方法梯度：等度。
如上所述，本发明提供的红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法，及红霉素药膏中干 扰物H的测定方法中：
1、为红霉素软膏有关物质控制提供较为可靠的检测方法，尝试不同状态下的多根同型号 色谱柱，最后将梯度的变化时间定为固定值，经过方法耐用性及验证方法合理可靠。
2、提供较为可靠的红霉素软膏提取方法。找到合适的红霉素软膏有关物质萃取剂，能将 所有的干扰物及有效成分萃取而出。
3、研究氧化降解的主要干扰物，对其进行定性、定量研究，对中国药典中现有的已知干 扰物谱进行补充。对样品进行氧化强降解，过度氧化降解后得到较高纯度的干扰物，采用 LC-MS确定该干扰物的分子量，根据分子量初步判断干扰物是红霉素A氮氧化物，购置EP 相应的纯品对照干扰物H，使用对照、样品、空白进行干扰物定位，得到的保留时间、相对保留时间基本一致，可确证红霉素氧化干扰物(干扰物H)就是红霉素A氮氧化物，根据研 究将其限度定为≤3.0％。该研究不仅能确定氧化干扰物的具体结构，还能为中国药典红霉素有关物质的干扰物谱进行补充完善，使其质量标准得到提升。
综上，本发明提供的方法，使干扰物和目标组分分离，有效地对红霉素药膏中主要成分 及干扰物进行测定，实现了对红霉素药膏中红霉素药膏产品中含量和有关物质的控制，保证 了红霉素药膏产品的质量，并有利于产品质量监控。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
如无特殊说明，本发明中使用的试剂均可通过商用购买。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
红霉素药膏(上海正大通用药业股份有限公司)；包含红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E和干扰物F的系统适应性对照品(中 检所)、主峰的标准品(中检所)；干扰物H对照品(上海源叶生物)。
2、仪器
高效液相色谱仪(安捷伦)；LC-MS(Waters)
实施例1
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：称取约4.0g红霉素软膏样品数份，置于125mL分液漏斗中，于瓶 中分别加入12～15mL石油醚将基质溶解后，少量多次精密加入60％pH7.5～8.5磷酸盐甲醇 10ml每次加入后震荡萃取30～60s，经0.45μm滤膜萃取溶剂，待萃取剂加完后，再次振荡2min， 静置分层，取下层滤过作为供试品溶液。
对照溶液的制备：精密移取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，加pH7.5～8.5磷酸盐甲 醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
灵敏度溶液的制备：精密对照品溶液适量，用萃取剂稀释定容制成每1ml中约含4μg的 溶液作为灵敏度溶液。
系统适应性对照品溶液的制备：在系统适应性对照品加入4ml甲醇溶解、用pH为7.5～8.5 磷酸盐稀释定容，摇匀，每1ml中约含4mg的溶液作为系统适应性对照品溶液。所述系统适 应性对照品包括红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、 干扰物E、干扰物F、干扰物H。
主峰的标准品溶液的制备：在主峰的标准品中加入4ml甲醇溶解、用pH为7.5～8.5磷酸 盐稀释定容，摇匀，每1ml中约含4mg的溶液作为主峰的标准品溶液。
1.2色谱条件
表2
Figure BDA0003350406680000161
梯度洗脱的具体程序为(见表1)：
0-48min，A相：B相体积比为98：2～98：2；
48-50min，A相：B相体积比为98：2～0：100；
50-57min，A相：B相体积比为0：100～0：100；
57-58min，A相：B相体积比为0：100～98：2；
58-75min，A相：B相体积比为98：2～98：2。
1.3测定
采用自身对照法：进样时，先将对照溶液在高效液相色谱法中进样，获得主峰(红霉素 A、红霉素B和红霉素C的液相色谱图)，作为采用自身计算法后续峰面积计算的分母。再将 灵敏度溶液在高效液相色谱法中进样，排除特别小的干扰物峰，不参与计算。再将供试品溶 液在高效液相色谱法中进样，获得红霉素A、红霉素B和红霉素C的干扰物A、干扰物B、 干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H液相色谱图。并根据自身对照法获得 相对保留时间和色谱峰面积。
红霉素A、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物H和干扰物F 的相对保留时间、峰面积、含量详见表3。
表3
Figure BDA0003350406680000162
Figure BDA0003350406680000171
实施例2
1、供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品3～5g，加入1ml10.0％双氧水、放置2h后， 加入4ml甲醇溶解，并加入pH7.9～8.1磷酸氢二钾溶液稀释定容稀释制成每1ml中约含4mg 的溶液；
2、干扰物H对照品溶液的制备：取干扰物H对照品，加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到干扰物溶液，其中，所述干扰物H为氧化红霉素A；
3、检测：采用液相色谱-质谱联用分别测定供试品溶液、干扰物H对照品溶液，将获得 的供试品溶液的液相色谱图，与干扰物H对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留 时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中干扰物H的含量；并根据质谱测定干扰物H分子量。
在研究过程中，在7.280min左右处出现了一个未知的氧化干扰物，降解后经LC-MS检 测确定其分子量约为750，详细见图1。
由氧化降解结果及LC-MS检测结果初步该红霉素软膏的主要氧化干扰物为红霉素A氮 氧化物干扰物，其分子量为749.93，在EP红霉素有关物质方法中命名为干扰物H，采购相应 的EP对照，进行定位，详见图2。
氧化降解结果表4：
表4
Figure BDA0003350406680000172
Figure BDA0003350406680000181
备注：*红霉素A、红霉素B以及红霉素C均为有效成分。
实施例3
对样品进行加速试验研究考察，具体操作如下：
1、取0天样品按实例1中所述的方法检测其有关物质。
2、取足量的样品置于40℃，75％RH的稳定性条件下，分别于1个月、2个月、3个月及6个月时取样，按实例1中所述的方法检测其有关物质。与干扰物H相关的具体检测 结果如表5所示：
表5
Figure BDA0003350406680000182
Figure BDA0003350406680000191
参考Ch.P及EP原料药相关标准、ICH干扰物相关指导原则以及表5中，本品稳定性研究的实际结果，最终将干扰物H的限度定为≤3.0％。
3、结果与讨论：
3.1方法耐用性
通过色谱柱变化、柱温变化、流速变化对方法耐用性进行研究，详见表6。
表6
Figure BDA0003350406680000192
    
Figure BDA0003350406680000201
3.2有关物质方法验证结果
3.2.1专属性
取系统适应性溶液、空白软膏溶液(200512批)、供试品溶液1(200509批)进样，空白样品对测定无干扰，主峰与杂峰间的分离度良好。本品与可能存在的干扰物均能分离。
3.2.2系统适用性
(1)精密称取红霉素系统适用性对照品40mg，置10mL棕色量瓶中，加4mL甲醇使溶解，用pH8.0磷酸盐溶液稀释至刻度，摇匀作为系统适用性溶液。
(2)精密称取红霉素标准品40mg，置10mL棕色量瓶中，加4mL甲醇使溶解，用pH8.0磷酸盐溶液稀释至刻度，摇匀作为标准品溶液。
在每次序列的开始考察系统适用性，空白溶液无干扰峰；根据标准图谱及实际检测的色 谱图对比，红霉素A的保留时间约21分钟，干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E和干扰物F的相对保留时间分别约为0.4、0.5、0.9、1.6、2.3和1.8，红霉素B和红霉 素C的相对保留时间分别约为1.7和0.55，各个色谱峰间的分离度应不小于1.2；标准品溶液中，主峰红霉素A的拖尾因子应不大于2.0；灵敏度溶液的主成份色谱峰高的信噪比应大于10。对照品溶液连续进样3次，红霉素A峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％。
3.2.3定量限与检测限
取红霉素标准品溶液，将此溶液不断稀释，定量限以信噪比为S/N≥10，测定红霉素A 的定量限浓度为2.70μg/mL，检测灵敏度足够满足分析测试要求。再取红霉素标准品溶液， 将此溶液不断稀释，检测限以信噪比为S/N≥3，测定红霉素A的检测限浓度为0.67μg/mL。
3.2.4线性及范围
精密称取红霉素标准品40mg，置10mL棕色容量瓶中，加入4mL甲醇溶解后，用pH8.0的磷酸氢二钾缓冲液稀释至刻度，摇匀，得到4mg/mL的红霉素标准品溶液，置于4℃冷藏 备用。
(1)精密量取2mL标准曲线溶液3，置10mL量瓶中，用(pH8.0磷酸氢二钾盐-甲醇＝3： 2)稀释至刻度，摇匀作为标准曲线1溶液(约0.013mg/mL)；
(2)精密量取5mL标准曲线溶液3，置10mL量瓶中，用(pH8.0磷酸氢二钾盐-甲醇＝3： 2)稀释至刻度，摇匀作为标准曲线2溶液(约0.02mg/mL)；
(3)精密量取1mL红霉素标准品溶液，置100mL量瓶中，用(pH8.0磷酸氢二钾盐- 甲醇＝3：2)稀释至刻度，摇匀作为标准曲线3溶液(约0.04mg/mL)；
(4)精密量取1mL红霉素标准品溶液，置10mL量瓶中，用(pH8.0磷酸氢二钾盐-甲醇＝3：2)稀释至刻度，摇匀作为标准曲线4溶液(约0.4mg/mL)；
(5)精密量取2mL红霉素标准品溶液，置10mL量瓶中，用(pH8.0磷酸氢二钾盐-甲醇＝3：2)稀释至刻度，摇匀作为标准曲线5溶液(约0.8mg/mL)。浓度范围见表7。
取上述溶液100μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以样品浓度(X)与样品峰面积之比(Y)进行加权最小二乘法计算标准曲线，线性拟合，权重1/X。结果显示，红 霉素A在13～800μg/mL的浓度范围内，线性关系良好，线性方程为Y＝3770X-2.3395，相关 系数r为1.0000。
3.2.5准确度(回收率)
准确度可通过检测平行6份含原料药100％浓度水平的软膏判断其浓度结果是否准确。
具体操作如下：
供试溶液：分别称取6份含原料药100％浓度水平的软膏，每份4.0g，置于125mL分液 漏斗中，于瓶中分别加入石油醚12mL，振摇溶解后，精密加入10mL萃取剂(pH8.0磷酸氢二钾盐-甲醇＝3：2)，振摇5min后静置，取下层清液经0.45μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液进样检测。
对照溶液：精密移取1mL供试品溶液置100mL量瓶中，用pH8.0磷酸氢二钾：甲醇＝3： 2作为稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得对照溶液。
进样记录峰面积，按自身对照法计算回收率。红霉素A测定平均回收率(n＝6)为103.74％， RSD为0.54％。依据中国药典2020版4部9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求， 待测成分含量在10mg/g时，回收率限度要求为92-105％，结果符合要求。证实了该方法具有 良好的准确度。
3.2.6重复性
取红霉素软膏(批号：200708)，照“供试品溶液制备”项下制备六份样品，测定六次。 结果显示，供试品溶液中红霉素A峰面积的RSD为0.71％，总杂占比的RSD为1.63％。
3.2.7溶液稳定性
按照有关物质检查的分析方法，配制对照品溶液、2份供试品溶液，将对照溶液置4℃及 室温下贮存，将供试品溶液置室温下贮存，于0～12H观察该溶液中各主成分红霉素A的含 量变化，研究溶液的稳定性，见下表7结果表明：
(1)对照品溶液在室温条件下放置12小时，红霉素A峰面积未见明显变化，峰面积RSD ≤0.57％；
(2)对照溶液在4℃条件下贮存11天，峰面积也未见明显变化，峰面积RSD≤1.78％。
(3)供试品溶液在室温下放置12小时，红霉素A峰面积未见明显变化，峰面积RSD≤0.66％。结果表明干扰物未发生明显变化，12小时内溶液稳定性良好。
表7
Figure BDA0003350406680000221
3.3样品检测结果
表8
Figure BDA0003350406680000231
Figure BDA0003350406680000241
表8为两批实验室自制产品的检测结果。从结果来看，样品本身及检测方法的稳定性、 平行性均良好，且检测方法能有效合理地将样品中的干扰物检出，四份样品中的干扰物H也 均能被有效地检出，该方法在实际检测应用中可靠有效。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种红霉素药膏中主要物质及干扰物的测定方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入石油醚溶解，并加入磷酸盐的醇溶液萃取、静置分层，取续滤液作为供试品溶液；
2)对照溶液的制备：移取供试品溶液，加入磷酸盐的醇溶液稀释并定容、摇匀作为对照溶液；
3)系统适应性对照品溶液的制备：在系统适应性对照品加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到系统适应性对照品溶液；所述系统适应性对照品包括红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F、干扰物H；
4)检测：采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液、对照溶液、系统适应性对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与系统适应性对照品溶液的液相色谱图进行比较，并根据自身对照法获得相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中红霉素A、红霉素B、红霉素C、干扰物A、干扰物B、干扰物C、干扰物D、干扰物E、干扰物F和干扰物H的含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1)中，还包括以下条件中的任一项或多项：
A1)步骤1)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与石油醚加入的体积ml之比为4:12～4:15；
A2)步骤1)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐的醇溶液加入的体积ml之比为4：5～4：15；
A3)步骤1)中，所述磷酸盐的醇溶液选自磷酸盐甲醇；优选的，所述磷酸盐甲醇为含体积百分比为60％以上的磷酸盐的甲醇溶液，其中，所述磷酸盐的pH为7.5～8.5；
A4)步骤1)中，所述萃取的温度为20℃～30℃，萃取时间为2min～10min。
3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述磷酸盐选自磷酸氢二钾。
4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于，步骤3)中，还包括以下条件中的任一项或多项：
B1)步骤3)中，所述系统适应性对照品加入的质量mg，与甲醇加入的体积ml之比为25：2～25：5；
B2)步骤3)中，所述系统适应性对照品加入的质量mg，与磷酸盐加入的体积ml之比为25：3～25：7.5；
B3)步骤3)中，磷酸盐选自磷酸氢二钾，所述磷酸盐的pH为7.9～8.1。
5.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于，步骤4)中，所述高效液相色谱法的色谱条件包括如下条件的任一项或多项：
C1)色谱柱：Waters XTERRA C18色谱柱，250mm×4.6mm，3.5μm；
C2)检测波长：205～215nm；
C3)流动相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈，其中，A相：水、磷酸氢二钾溶液与乙腈的体积比为32～37：2～8：57～63；B相：水-磷酸氢二钾溶液-乙腈的体积比为47～53：2～8：42～48；
C4)进样量为90～100μl；
C5)流速：0.8～1.2ml/min；
C6)柱温：60～68℃；
C7)分析时间：75min；
C8)梯度洗脱。
6.如权利要求5所述的测试方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-48min，A相：B相体积比为98：2～98：2；
48-50min，A相：B相体积比为98：2～0：100；
50-57min，A相：B相体积比为0：100～0：100；
57-58min，A相：B相体积比为0：100～98：2；
58-75min，A相：B相体积比为98：2～98：2。
7.一种红霉素药膏中干扰物H的测定方法，包括以下步骤：
a)供试品溶液的制备：称取红霉素药膏样品，加入氧化剂氧化、甲醇溶解，并加入磷酸盐溶液稀释定容后，得到供试品溶液；
b)干扰物H对照品溶液的制备：取干扰物H对照品，加入甲醇溶解、用磷酸盐稀释定容，摇匀，得到干扰物H对照品溶液，其中，所述干扰物H对照品为氧化红霉素A；
c)检测：采用液相色谱-质谱联用分别测定供试品溶液、干扰物H对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与干扰物H对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间和色谱峰面积，确定供试品溶液中干扰物H的含量；并根据质谱测定干扰物H分子量。
8.如权利要求7所述的红霉素药膏中干扰物H的测定方法，其特征在于，还包括如下条件的任一项或多项：
D1)步骤a)中，所述氧化剂选自双氧水，优选的，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与双氧水加入的体积ml之比为20:1～20:3；更优选的，所述双氧水的溶液浓度为8～15％；
D2)步骤a)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与甲醇加入的体积ml之比为25:2～25:5；
D3)步骤a)中，所述红霉素药膏样品加入的质量g，与磷酸盐加入的体积ml之比为25:3～25:7.5；
D4)步骤a)和/或步骤b)中，所述磷酸盐选自磷酸氢二钾，所述磷酸氢二钾的pH值为7.9～8.1；
D5)步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与甲醇加入的体积ml之比为25:2～25:5；
D6)步骤b)中，所述干扰物H对照品加入的质量mg，与磷酸盐加入的体积ml之比为25:3～25:7.5。
9.如权利要求7所述的红霉素药膏中干扰物H的测定方法，其特征在于，所述干扰物H的分子量为749.93，结构式为
Figure FDA0003350406670000031
10.如权利要求7所述的红霉素药膏中干扰物H的测定方法，其特征在于，所述步骤c)中液相色谱-质谱联用的条件为包括如下条件的任一项或多项：
E1)检测器：紫外检测器，质谱检测器；
E2)检测波长：205～215nm；
E3)色谱柱型号：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
E4)流动相：乙腈-醋酸铵溶液，其中，乙腈：醋酸铵溶液的体积比为30～40：60～70；
E5)柱温：35～50℃；
E6)离子模式：正离子模式；
E7)气体温度：320～340℃；
E8)干燥气流速：8～11L/min；
E9)雾化器表压：33～37psig；
E10)扫描范围：300～1500m/z；
E11)方法梯度：等度。
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