CN108072729A - 一种测定奥贝胆酸片溶出度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定奥贝胆酸片溶出度的方法。该检测方法包括以下步骤：步骤一，溶液制备；步骤二，提取奥贝胆酸干品；步骤三，衍生化反应；步骤四，用高效液相色谱‑荧光检测器进行检测，步骤五，计算得出待测样品中奥贝胆酸的含量。本方法合理选择高效液相色谱测定参数和测试步骤，选择荧光检测器并用外标法定量，实现了奥贝胆酸片溶出度的精密测定。该方法具有经济有效、专属性强、精密度高、抗干扰能力强和灵敏度的特点。

Description

一种测定奥贝胆酸片溶出度的方法

技术领域

本发明属于药品检测分析领域，具体涉及一种奥贝胆酸片溶出度的检测方法。

背景技术

奥贝胆酸片是胆酸家族中的新成员，规格小，其溶出度检查难度大，而奥贝胆酸及杂质溶出情况与体内作用相关性高，可以利用溶出度进行生物利用度控制。所以奥贝胆酸片溶出度的检测分析具有重要现实意义。然而有研究表明奥贝胆酸片的溶出度检测使用HPLC-UV无法检出，示差折光检测法检测灵敏度低，HPLC-MS/MS法检测成本高。选择合适的衍生试剂以及简单的前处理方法，开发不依赖于昂贵仪器，分析成本低，易于普及的分析检测方法是重要研究方向之一。本发明的目的是针对现有技术存在的不足和缺陷，借助于柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测法实现的，旨在解决现有方法灵敏度低、依赖于高端分析检测仪器，检测成本高，方法难以普及应用的问题。本方法通过合理选择高效液相色谱参数和测试步骤，采用荧光检测器检测，外标法定量，可以实现奥贝胆酸片溶出度中奥贝胆酸及其低于0.01%的杂质溶出量的准确测定，利于研究其杂质对生物利用度的影响。具有经济有效、精密度高，回收率好、检测限低、抗干扰能力强和能同时监控杂质溶出量的特点。目前为止，国内外采用柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测器测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法尚未见文献和专利报道。

发明内容

1本发明的目的是提供一种奥贝胆酸片溶出度的检测方法，旨在解决奥贝胆酸片溶出度样品含量低，检测灵敏度不足的问题，该检测方法灵敏、准确可靠、重现性好。

本发明所提供了一种测定奥贝胆酸片溶出度的方法，其基于柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测器，包括以下步骤：

步骤一，溶液制备

供试品溶液的制备：取奥贝胆酸片1-12个单位，采用中国药典2015年版四部中溶出度测定法第二法，以0.1mol/l盐酸、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或水为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，在不同时间取样，例如在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟分别取溶液3-5ml，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密量取对照品适量，加对应的溶出介质制成分别每1ml中约含奥贝胆酸0.1-30微克的溶液作为对照品溶液；

步骤二，提取奥贝胆酸干品

分别精密量取供试品溶液、对照品溶液1~5ml置于玻璃离心管中，加入内标物的三氯甲烷溶液1~10ml置于涡旋仪中涡旋5-10分钟后，离心分相，精密移取下层清液1~5ml挥干得试样干品；

步骤三，衍生化反应

向试样干品中加入0.5~5ml HEA混合衍生化试剂溶液，加盖密封后，于50℃~70℃下反应1~3小时，衍生反应结束后冷却至室温；置于通风橱中，根据奥贝胆酸的含量情况加无水乙腈稀释1~10倍，经0.22μm或0.45μm等有机滤膜过滤至样品瓶中，得待测样液；

所述HEA混合衍生试剂由HEA溶液、DMAP溶液、EDC溶液按2.5:1:1比例混合，临用新制，其中，HEA溶液：精密称取5mgHEA，加入10ml量瓶中，用无水乙腈溶解并稀释至刻度，0.5mg/ml；DMAP溶液：称取0.4gDMAP于10ml量瓶中用无水乙腈溶解并稀释至刻度，40mg/ml；EDC溶液：称取0.1gEDC于10ml量瓶中用无水乙腈溶解并稀释至刻度，10mg/ml；

所述HEA为 9-（2-羟乙基）-吖啶酮的简称，DMAP：4-二甲氨基吡啶，EDC：1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳酰二亚胺；

步骤四用高效液相色谱-荧光检测器进行测定

检测条件如下：

a色谱柱：苯基色谱柱、C4色谱柱、C8色谱柱中的一种

b色谱柱温度：20℃~40℃

c荧光检测器：激发波长384nm~404nm，发射波长421nm~440nm

d流动相：乙腈-水=55:45 或者乙腈-甲醇-水=50:5:45

e流速：0.8~1.2ml/min

f进样量：10μl~50μl；

步骤五，按下式计算样品中奥贝胆酸的溶出度，用外标法绘制标准曲线，

X= C*V*f/m

X—溶出度；

C—由标准曲线得到的样液中奥贝胆酸的浓度，单位为μg/ml；

V—溶出介质体积，单位为L；

f —检测液的最终稀释比；

m—奥贝胆酸片规格mg；

同时按步骤一、二、三、四、五检测空白样品。

优选的，所述的内标物为鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸、胆酸中的一种，浓度范围为1μg ~25μg。

优选的，步骤二中所述的挥干方法为20℃～40℃平缓氮气吹干或者20℃～40℃真空烤箱中抽干。

优选的，步骤二中所述的挥干方法为30℃真空烤箱中抽干。

优选的，步骤三中所述的衍生反应在烤箱中进行。

优选的，步骤四中色谱柱为苯基柱，激发波长384nm，发射波长421nm。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

本发明筛选确定了合适的内标物三氯甲烷及其加量，得到良好的线性关系和灵敏度。

采用离心分相解决了甲醇和水混溶不能萃取分离的问题。

真空烤箱中抽干比常见的吹干更环保，便于成批操作。

烤箱中进行衍生化反应，避免了水浴须绝对密封完整否则影响酯化反应的问题，成功率高，线性好，试管能重复利用。

选择苯基柱，比C18柱有明显更好的检测效果。

对非已知化合物奥贝胆酸通过扫描确定了合适的波长，检测灵敏度高。

采用等度洗脱，非梯度洗脱，无平衡时间，10几分钟完成，可连续进行。

综合以上技术改进，本发明提供了一种奥贝胆酸片溶出度检测方法，该检测方法解决了目前没有奥贝胆酸片溶出度检测方法的现状。该检测方法专属性强，灵敏度高，本发明能检出溶出量低到0.005ug/ml，反应条件简单易行，能够排除溶出介质中加入SDS时对检测的干扰。

附图说明

图1 是奥贝胆酸溶出曲线（系列1即片1，其余同）

图2是奥贝胆酸片不同溶出时间的各样品的色谱图叠加

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

实施例一奥贝胆酸片的溶出度检测的方法学验证

1 测定波长的选择

仪器与试剂： Waters 2695 液相色谱仪，天大天发RCZ-8m溶出试验仪， aglent苯基色谱柱（4.6*250mm，5μm）；乙腈-甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

制备供试品溶液，用激发波长420nm扫吸收波长440 nm，得最大值，再用得到的值返回去扫激发波长，之后再用新得到的激发波长扫吸收波长，得到适合的检测波长范围：激发波长384nm~404nm，发射波长421nm~440nm，其中最灵敏的波长：激发波长384nm，发射波长421nm。

2 检测限：取奥贝胆酸标准品适量，逐步稀释制成一定浓度的溶液，再按所述制备供试品溶液的方法制备供试品溶液，然后在上述色谱条件下，进样测试。当主成分峰的峰高为基线噪音的3倍时，计算得检测限为0.005ug/ml，结果表明该方法的检测灵敏度高，可以满足测定要求。

3 线性关系试验：取奥贝胆酸标准品适量，制成一系列浓度的溶液，再按所述制备供试品溶液的方法制备供试品溶液，分别精密量取10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。以样品浓度对峰面积比（奥贝胆酸峰面积与内标物峰面积的比）作线性回归分析，结果表明，在样品浓度0.05-50ug/ml范围内，峰面积比与其呈良好的线性关系，线性方程为y=0.32x+0.0067，相关系数为r=0.9997。

4 精密度试验：按上述色谱条件，取奥贝胆酸标准品（5 ug/ml），按所述方法制备供试品溶液, 制备6次，分别上样测定，计算峰面积比的相对标准偏差为1.5%，表明精密度试验结果良好。

5 回收率验证：按本品处方比例，称取空白辅料9份，再分别加入按处方量80%、100%、120%的奥贝胆酸对照品，精密称定，溶解并稀释至刻度，制成奥贝胆酸3个不同浓度的样品溶液各3份，按所述方法制备供试品溶液。另精密称取奥贝胆酸标准品适量，精密称定，溶解并定量稀释制成1ml中含5ug的溶液，作为对照品溶液。按上述色谱条件，取两种溶液各10ul, 注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积比计算奥贝胆酸的回收率。结果见表1。

表1 溶出度测定的回收率试验结果

6 溶液稳定性试验：取溶出液制备供试品溶液，再放置24小时，分别在0，2，4，6，8，10，12……至24小时取样，分别进样测定，以峰面积比的变化率考察样品溶液的稳定性，面积比的标准偏差RSD 为1.98%，说明在此条件下，样品溶液稳定性好。

实施例二测定奥贝胆酸片磷酸盐缓冲液中溶出曲线

步骤一，溶液制备

供试品溶液的制备：取奥贝胆酸片（规格5μg）6个单位，采用溶出度测定法（中国药典2015年版四部）第二法装置，以pH6.8磷酸盐缓冲液900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟分别取溶液5ml，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密量取对照品适量，加对应的溶出介质制成分别每1ml中约含奥贝胆酸1μg、2μg、5μg、7μg、10μg的溶液作为系列对照品溶液。

步骤二，提取奥贝胆酸干品

分别精密量取供试品溶液、对照品溶液3ml置于玻璃离心管中，加入鹅去氧胆酸的三氯甲烷溶液3ml置于涡旋仪中涡旋5分钟后，离心分相，精密移取下层清液2ml挥干得试样干品；

步骤三，衍生化反应

向试样干品中加入1ml HEA 混合衍生化试剂加盖密封后，于60℃下反应2小时，衍生反应结束后冷却至室温。置于通风,橱中，加无水乙腈稀释至10ml，经0.45μm有机滤膜过滤至样品瓶中，得待测样液；

步骤四用高效液相色谱-荧光检测器进行测定

检测条件如下：

a色谱柱： aglent SB-Phenyl（苯基）4.6*250mm，5μm

b色谱柱温度：20℃

c荧光检测器：激发波长384nm，发射波长421nm；

d流动相：乙腈-水=55:45

e流速：1.0ml/min

f进样量：10μl

步骤五，用外标法绘制标准曲线，计算样品中奥贝胆酸的溶出度；同时按步骤一、二、三、四、五检测空白样品。

按下式计算样品中奥贝胆酸的溶出度：

X= C*V*f/m；

X—溶出度；

C—由标准曲线得到的样液中奥贝胆酸的浓度，单位为μg/ml；

V—溶出介质体积，单位为L；

f —检测液的最终稀释比；

m—奥贝胆酸片规格mg；

奥贝胆酸溶出度均一性试验数据见表2，在上述条件下所得的溶出曲线见图1：

表2 奥贝胆酸溶出度均一性试验数据

实施例三：测定奥贝胆酸片水中溶出度

1溶液制备

供试品溶液的制备：取奥贝胆酸片6个单位，采用溶出度测定法（中国药典2015年版四部）第二法装置，以900ml水为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟分别取溶液5ml，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液。

2对照品溶液的制备：精密量取对照品适量，加对应的溶出介质制成每1ml中约含奥贝胆酸3微克的溶液作为对照品溶液。

3萃取挥干：分别精密量取供试品溶液、对照品溶液5ml置于玻璃离心管中，加入熊去氧胆酸三氯甲烷溶液5ml置于涡旋仪中涡旋5分钟后，离心分相，精密移取下层清液1ml挥干得奥贝胆酸干品；

4奥贝胆酸干品，加入5ml 混合衍生化试剂，加盖密封后，于70℃下反应2小时，衍生反应结束后冷却至室温。置于通风,橱中，经0.45μm有机滤膜过滤至样品瓶中，得待测样液；

5用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；

参数条件如下：

a色谱柱：苯基色谱柱（4.6*250mm，5μm）；

b色谱柱温度：40℃

c荧光检测器：激发波长384nm，发射波长421nm

d流动相：乙腈-甲醇-水=56:44

e流速：1.0ml/min

f进样量：10μl；

6同时按上述步骤检测空白样品；

7计算样品中奥贝胆酸的溶出度，结果显示水介质中溶出度较低，但样品浓度也落在线性范围内，也有很好的检测结果。

表3 奥贝胆酸在水中的溶出度数据

实施例四 奥贝胆酸片溶出样品的杂质峰检测

1 供试品溶液的制备：取奥贝胆酸片1个单位，采用溶出度测定法（中国药典2015年版四部）第二法装置，以ph6.2磷酸盐缓冲液900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，在5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟分别取溶液5ml，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液。

2对照品溶液的制备：精密量取对照品适量，加对应的溶出介质制成每1ml中约含奥贝胆酸5微克的溶液作为对照品溶液。

3 萃取挥干：分别精密量取供试品溶液、对照品溶液5ml置于玻璃离心管中，加入胆酸三氯甲烷溶液10ml置于涡旋仪中涡旋10分钟后，离心分相，精密移取下层清液5ml挥干得奥贝胆酸干品；

4 奥贝胆酸干品，加入0.5ml 混合衍生化试剂，加盖密封后，于50℃下反应2小时，衍生反应结束后冷却至室温。置于通风,橱中，加无水乙腈稀释10倍，经0.45μm有机滤膜过滤至样品瓶中，得待测样液；

5 用高效液相色谱-荧光检测器进行测定；

参数条件如下：

a色谱柱：苯基色谱柱（4.6*250mm，5μm）；

b色谱柱温度：30℃

c荧光检测器：激发波长384nm，发射波长421nm

d流动相：乙腈-甲醇-水=50:5：45

e流速：1.0ml/min

f进样量：10μl；

对奥贝胆酸片不同溶出时间的样品进行检测所得色谱图如图2，结果显示，溶出进行的前45分钟，随着溶出时间的增加，样品的主峰增高（中间位置的是主峰），其它杂峰也在变化，说明本方法可以比较有效地检测出杂质峰的情况，能够同时反应杂质溶出特性，也不影响对主峰的检测，方法专属性好。

Claims (7)

1.一种测定奥贝胆酸片溶出度的方法，其特征在于所述奥贝胆酸片溶出度的测定方法包括以下步骤：

步骤一，溶液制备

供试品溶液的制备：取奥贝胆酸片1-12个单位，采用中国药典2015年版四部中溶出度测定法第二法，以0.1mol/l盐酸、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或水为溶出介质，转速为每分钟50-100转，依法操作，在不同时间取样，分别取溶液3-5ml，滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：精密量取对照品适量，加对应的溶出介质制成每1ml中含奥贝胆酸0.1-30微克的溶液作为对照品溶液；

步骤二，提取奥贝胆酸干品

分别精密量取供试品溶液、对照品溶液1~5ml置于玻璃离心管中，加入内标物的三氯甲烷溶液1~10ml置于涡旋仪中涡旋5-10分钟后，离心分相，精密移取下层清液1~5ml挥干得试样干品；

步骤三，衍生化反应

向试样干品中加入0.5~5ml HEA混合衍生化试剂溶液，加盖密封后，于50℃~70℃下衍生反应1~3小时，衍生反应结束后冷却至室温；置于通风橱中，根据奥贝胆酸的含量情况加无水乙腈稀释1~10倍，经有机滤膜过滤至样品瓶中，得待测样液；

所述HEA混合衍生试剂由HEA溶液、DMAP溶液、EDC溶液按2.5:1:1比例混合，临用新制，其中，HEA溶液：精密称取5mgHEA，加入10ml量瓶中，用无水乙腈溶解并稀释至刻度，0.5mg/ml；DMAP溶液：称取0.4gDMAP于10ml量瓶中用无水乙腈溶解并稀释至刻度，40mg/ml；EDC溶液：称取0.1gEDC于10ml量瓶中用无水乙腈溶解并稀释至刻度，10mg/ml；

步骤四 用高效液相色谱-荧光检测器进行测定

检测条件如下：

a色谱柱：苯基色谱柱、C4色谱柱或C8色谱柱中的一种，

b色谱柱温度：20℃~40℃，

c荧光检测器：激发波长384nm~404nm，发射波长421nm~440nm，

d流动相：乙腈-水=55:45 或者乙腈-甲醇-水=50:5:45，

e流速：0.8~1.2ml/min，

f进样量：10μl~50μl；

步骤五，计算样品中奥贝胆酸的溶出度；

同时按步骤一、二、三、四、五检测空白样品。

2.根据权利要求1所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，步骤一中所述在不同时间取样，为5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟分别取样。

3.根据权利要求1或2所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，其特征在于所述的内标物为鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸、胆酸中的一种，浓度范围为1μg ~25μg。

4.根据权利要求1或2所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，其特征在于步骤二中所述的挥干方法为20℃～40℃平缓氮气吹干或者20℃～40℃真空烤箱中抽干。

5.根据权利要求1或2所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，其特征在于步骤二中所述的挥干方法为30℃真空烤箱中抽干。

6.根据权利要求1或2所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，其特征在于步骤三中所述的衍生反应在烤箱中进行。

7.根据权利要求1或2所述的一种测定奥贝胆酸片溶出度的检测方法，其特征在于色谱柱为苯基柱，激发波长384nm，发射波长421nm。