CN114814059B - 沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱、构建方法及应用，所述构建方法包括：沉香舒郁片气相指纹图谱的测定和相似性比较判定步骤。本发明通过尝试多种程序升温条件，最终确定了沉香舒郁片的气相指纹图谱分析的色谱条件，考察确定了26个共有峰的对照气相指纹图谱，具有方法简便、速度快、重现性号等特点。所建立的标准气相指纹图谱经方法学验证满足相关要求，适应性强，能够更全面的反映产品质量状况，为质量控制及制定标准提供了重要证据。

Description

沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱、构建方法及应用

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱、构建方法及应用。

背景技术

沉香舒郁片是一种中药复方制剂，国药准字为Z20063687，其主治功能为，舒气开胃，化瘀止痛，用于胸腹胀满，胃部疼痛，呕吐酸水，消化不良，食欲不振，郁闷不舒等症状。

其主要中药成分包括沉香、木香、厚朴、枳壳、延胡索、豆蔻、陈皮、砂仁、香附、青皮、柴胡、姜黄等13味中药。其中沉香、木香、厚朴等对肠平滑肌有解痉作用，青皮有促进消化液分泌和排除肠内积气作用，延胡索、香附有镇痛、镇静作用，香附、厚朴、陈皮等有抗菌、抗炎作用，厚朴等有抗溃疡作用。该经验方收录于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第十、十五册，为国家基本药物。

由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量稳定性，中药指纹图谱的建立可以全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。

沉香舒郁片虽然被《卫生部药品标准·中药成方制剂》收录，但该标准中并未涉及任何针对药味的定性或定量控制，目前也没有对沉香舒郁片进行指纹图谱研究的报道，缺乏对沉香舒郁片应当采取何种指纹图谱，如何构建对应指纹图谱的指导。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱的构建方法，以及利用该构建方法构建得到的沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱，并提供了该指纹图谱在沉香舒郁片质量控制中的应用，用以弥补目前中药制剂标准中缺少对于沉香舒郁片质量检测评价方法的技术空白。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱的构建方法，所述建立方法包括：

不同批次沉香舒郁片经有机溶剂回流提取得到供试品溶液，采用气相色谱仪对供试品溶液检测得到气相色谱，选择不同批次沉香舒郁片气相指纹图谱中的共有峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，确定沉香舒郁片对照指纹图谱；

所述气相色谱的色谱条件为：

以5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定相，柱温为60℃～300℃，保持时间为12～30min；进样口温度为300℃～320℃；检测器温度为320℃～350℃；采取分流进样的进样方式，分流比10～50：1。

在可选的实施方式中，所述柱温的初始温度为60℃，以3～8℃/min的速率升温至150～300℃，再保持12～30min。

在可选的实施方式中，所述柱温经过至少两次分段升温。

在可选的实施方式中，所述柱温经过两次分段升温，第一次分段升温过程为：柱温初始温度为60℃，以5℃/min的速率升温至150℃，第二次分段升温过程为：以8℃/min的速率升温至300℃。

在可选的实施方式中，气相色谱的色谱条件为：以5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定相，柱温初始温度为60℃，以5℃/min的速率升温至150℃，再以8℃/min的速率升温至300℃，而后保持23.25min，进样口温度为300℃，检测器温度为320℃，分流比为10:1。

优选地，所述色谱柱为DB-5色谱柱。

在可选的实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括，沉香舒郁片研磨后加入至有机溶剂中，回流提取15～60min后，过滤取滤液，向滤液中补加有机溶剂至滤液质量与回流前等重，即得到供试品溶液。

优选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮或无水乙醇。

优选地，沉香舒郁片研磨后加入至有机溶剂过程中，每克沉香舒郁片对应的有机溶剂的体积为20～100ml。

在可选的实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括：

沉香舒郁片研磨后加入至无水乙醇中，称重记为质量A，回流提取30min后，过滤取滤液，向滤液中补加无水乙醇至滤液质量为质量A，即得到供试品溶液；

其中，每克述沉香舒郁片对应的有机溶剂的体积为20ml。

在可选的实施方式中，所述共有峰的获取方法包括：

以沉香舒郁片的有效成分为参考制备标准对照品溶液，对不同批次沉香舒郁片得到的供试品溶液与标准对照品溶液同时进行气相色谱检测，得到以有效成分为参考的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰；

所述对照指纹图谱的获取方法包括，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对得到的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰进行拟合，确定沉香舒郁片对照气相指纹图谱。

优选地，所述沉香舒郁片的有效成分包括去氢木香内酯、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯或百秋李醇中至少一种。

优选地，所述去氢木香内酯浓度为0.9950mg/ml。

优选地，所述厚朴酚浓度为0.5080mg/ml。

优选地，所述木香烃内酯浓度为0.6444mg/ml。

优选地，所述百秋李醇浓度为0.4970mg/ml。

第二方面，本发明提供采用根据前述实施方式任一项所述的构建方法构建得到的沉香舒郁片对照气相指纹图谱，以木香烃内酯参考制备标准对照品溶液，不同批次沉香舒郁片得到的对照气相指纹图谱包括26个共有峰，所述共有峰的保留时间分别为：3.154min、3.363min、8.354min、14.442min、21.162min、22.731min、24.729min、26.189min、26.273min、26.547min、26.892min、28.639min、29.111min、29.35min、30.554min、30.704min、32.129min、33.257min、33.689min、34.142min、35.342min、35.652min、35.9min、38.311min、39.928min和40.437min。

第三方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述的构建方法构建得到的沉香舒郁片对照气相指纹图谱或前述实施方式所述的沉香舒郁片对照气相指纹图谱在沉香舒郁片质量控制中的应用。

本发明提供了沉香舒郁片的气相指纹图谱的构建方法，提供了可行的气相色谱条件，并按照国家药典委员会培训的《中国药典》2015年版中药指纹图谱技术应用和国家药品标准工作手册(第四版)中药指纹图谱技术的内容的指导，对提供的沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱的构建方法的稳定性、精密度、重复性与耐用性等性能进行了方法学考察，结果证明该构建方法符合要求，即该构建方法以及使用该构建方法构建得到的气相指纹图谱能够用于沉香舒郁片的质量控制中，具有可信度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1～3色谱检测结果；

图2为本发明实施例3～5色谱检测的局部放大结果；

图3为本发明实施例3、6和7色谱检测的局部放大结果；

图4为本发明实施例6、8和9色谱检测的局部放大结果；

图5为本发明实施例8、10和11色谱检测结果；

图6为本发明实施例12和13色谱检测结果；

图7为本发明实施例14～17色谱检测结果；

图8为本发明实施例18～20色谱检测结果；

图9为本发明用于与实施例28～32对比的沉香舒郁片气相指纹图谱；

图10为本发明实施例28色谱检测结果；

图11为本发明实施例29色谱检测结果；

图12为本发明实施例30色谱检测结果；

图13为本发明实施例31色谱检测结果；

图14为本发明实施例32色谱检测结果；

图15为本发明实施例33色谱检测结果；

图16为本发明实施例34色谱检测结果；

图17为实施例35中1号样品指纹图谱；

图18为实施例35中2号样品指纹图谱；

图19为实施例35中3号样品指纹图谱；

图20为实施例35中4号样品指纹图谱；

图21为实施例35中5号样品指纹图谱；

图22为实施例35中6号样品指纹图谱；

图23为实施例36中1号样品指纹图谱；

图24为实施例36中2号样品指纹图谱；

图25为实施例36中3号样品指纹图谱；

图26为实施例36中4号样品指纹图谱；

图27为实施例36中5号样品指纹图谱；

图28为实施例36中6号样品指纹图谱；

图29为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存0小时后检测的气相色谱图；

图30为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存2小时后检测的气相色谱图；

图31为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存4小时后检测的气相色谱图；

图32为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存8小时后检测的气相色谱图；

图33为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存20小时后检测的气相色谱图；

图34为本发明实施例37中400009批次供试品溶液室温保存24小时后检测的气相色谱图；

图35为本发明实施例38中应用不同流速对400009批次供试品检测的气相色谱图；

图36为本发明实施例39中应用安捷伦公司(DB-5)、菲罗门公司(ZB-5)和赛默飞世尔公司(TR-5)的气相毛细管色谱柱对400009批次供试品检测的气相色谱图；

图37为本发明实施例41中6个批次供试品气相色谱图；

图38为本发明实施例41中400009批次供试品气相色谱图；

图39为本发明实施例41中400010批次供试品气相色谱图；

图40为本发明实施例41中FJ40007批次供试品气相色谱图；

图41为本发明实施例41中FJ40008批次供试品气相色谱图；

图42为本发明实施例41中GA40009批次供试品气相色谱图；

图43为本发明实施例41中GA40010批次供试品气相色谱图；

图44为本发明实施例43中得到的沉香舒郁片气相色谱对照指纹图谱；

图45为实施方式六中甘草药材色谱检测结果；

图46为实施方式六中陈皮药材色谱检测结果；

图47为实施方式六中柴胡药材色谱检测结果；

图48为实施方式六中沉香药材色谱检测结果；

图49为实施方式六中砂仁药材色谱检测结果；

图50为实施方式六中木香药材色谱检测结果；

图51为实施方式六中厚朴药材色谱检测结果；

图52为实施方式六中枳壳药材色谱检测结果；

图53为实施方式六中香附药材色谱检测结果；

图54为实施方式六中延胡索药材色谱检测结果；

图55为实施方式六中姜黄药材色谱检测结果；

图56为实施方式六中青皮药材色谱检测结果；

图57为实施方式六中豆蔻药材色谱检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在某次具体的实施方式中，本发明提供一种沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱的构建方法，所述建立方法包括：

不同批次沉香舒郁片经有机溶剂回流提取得到供试品溶液，采用气相色谱仪对供试品溶液检测得到气相色谱，选择不同批次沉香舒郁片气相指纹图谱中的共有峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，确定沉香舒郁片对照指纹图谱；

所述气相色谱的色谱条件为：

以5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定相，柱温为60℃～300℃，保持时间为12～30min；进样口温度为300℃～320℃；检测器温度为320℃～350℃；采取分流进样的进样方式，分流比10～50：1。

在可选的实施方式中，所述柱温的初始温度为60℃，以3～8℃/min的速率升温至150～300℃，再保持12～30min。

在可选的实施方式中，所述柱温经过至少两次分段升温。

在可选的实施方式中，所述柱温经过两次分段升温，第一次分段升温过程为：柱温初始温度为60℃，以5℃/min的速率升温至150℃，第二次分段升温过程为：以8℃/min的速率升温至300℃。

在可选的实施方式中，气相色谱的色谱条件为：以5％苯基-95％甲基聚硅氧烷为固定相，柱温初始温度为60℃，以5℃/min的速率升温至150℃，再以8℃/min的速率升温至300℃，而后保持23.25min，进样口温度为300℃，检测器温度为320℃，分流比为10:1。

优选地，所述色谱柱为DB-5色谱柱。

在可选的实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括，沉香舒郁片研磨后加入至有机溶剂中，回流提取15～60min后，过滤取滤液，向滤液中补加有机溶剂至滤液质量与回流前等重，即得到供试品溶液。

优选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮或无水乙醇。

优选地，沉香舒郁片研磨后加入至有机溶剂过程中，每克沉香舒郁片对应的有机溶剂的体积为20～100ml。

在可选的实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括：

沉香舒郁片研磨后加入至无水乙醇中，称重记为质量A，回流提取30min后，过滤取滤液，向滤液中补加无水乙醇至滤液质量为质量A，即得到供试品溶液；

其中，每克述沉香舒郁片对应的有机溶剂的体积为20ml。

在可选的实施方式中，所述共有峰的获取方法包括：

以沉香舒郁片的有效成分为参考制备标准对照品溶液，对不同批次沉香舒郁片得到的供试品溶液与标准对照品溶液同时进行气相色谱检测，得到以有效成分为参考的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰；

所述对照指纹图谱的获取方法包括，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对得到的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰进行拟合，确定沉香舒郁片对照气相指纹图谱。

优选地，所述沉香舒郁片的有效成分包括去氢木香内酯、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯或百秋李醇中至少一种。

优选地，所述去氢木香内酯浓度为0.9950mg/ml。

优选地，所述厚朴酚浓度为0.5080mg/ml。

优选地，所述木香烃内酯浓度为0.6444mg/ml。

优选地，所述百秋李醇浓度为0.4970mg/ml。

在某次具体实施方式中，本发明提供一种沉香舒郁片对照气相指纹图谱，该指纹图谱以木香烃内酯参考制备标准对照品溶液，对不同批次沉香舒郁片进行气相色谱检测得到，共包括26个共有峰，所述共有峰的保留时间分别为：3.154min、3.363min、8.354min、14.442min、21.162min、22.731min、24.729min、26.189min、26.273min、26.547min、26.892min、28.639min、29.111min、29.35min、30.554min、30.704min、32.129min、33.257min、33.689min、34.142min、35.342min、35.652min、35.9min、38.311min、39.928min和40.437min。

在某次具体实施方式中，本发明提供采用沉香舒郁片对照气相指纹图谱对不同批次沉香舒郁片质量稳定性进行评价。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下实施例使用仪器设备如下：

安捷伦气相色谱仪(GC-7890B型)，OpenLAB CDS工作站，美国安捷伦公司生产；

AL204IC型万分之一电子天平，德国METTLER公司生产；

MS105型十万分之一电子天平，德国METTLER公司生产；

MS303s型千分之一电子天平，德国METTLER公司生产；

HY-2A型数显多用调速振荡器，金坛市医疗仪器厂；

DK-98-II型水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；

KQ-400VDE型双频数控超声仪，昆山市超声仪器厂；

色谱柱：DB-1柱(30m×0.25mm×0.25μm)，Agilent Technologies公司；

DB-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)，Agilent Technologies公司；

ZB-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)，phenomenex公司；

TR-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)，Thermo Scientific公司。

以下实施例使用的药品试剂包括：

沉香舒郁片(批号400009(用于方法学实验)、400010、GA40009、GA40010、FJ40007、FJ40008)，由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂提供；

乙酸乙酯(批号：20200306)，国药集团化学试剂有限公司；

三氯甲烷(批号：20200409)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

丙酮(批号：20180120)，天津市科密欧化学试剂有限公司；

无水乙醇(批号：20200909)，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

去氢木香内酯(批号111525-201912)，含量以99.5％计，购自中国食品药品检定研究院；

厚朴酚(批号110729-201714)，购自中国食品药品检定研究院；

和厚朴酚(批号110730-201915)，含量以99.8％计，购自中国食品药品检定研究院；

乙酸龙脑酯(批号110759-201806)，含量以99.7％计，购自中国食品药品检定研究院；

α-香附酮(批号110748-201111)，含量以99.3％计，购自中国食品药品检定研究院；

木香烃内酯(批号111524-201911)，含量以99.9％计，购自中国食品药品检定研究院；

百秋李醇(批号110772-201909)，购自中国食品药品检定研究院；

柠檬稀(批号110470-201503)，含量以96.0％计，购自中国食品药品检定研究院；

左旋龙脑(批号111749-201702)，含量以99.9％计，购自中国食品药品检定研究院；

α-松油醇(批号111859-201804)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

甘草(批号120904-201620)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

陈皮(批号120969-201109)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

柴胡(北柴胡)(批号120992-201509)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

沉香(批号121222-201203)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

砂仁(阳春砂)(批号120985-201406)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

木香(批号120921-201309)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

厚朴(批号121285-201303)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

枳壳(批号120981-201605)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

香附(批号121059-201407)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

青皮(批号121155-201704)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

姜黄(批号12188-201605)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

延胡索(批号120928-201609)，供鉴别用，购自中国食品药品检定研究院；

豆蔻(批号Y2004083)，由天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂提供。

实施方式一

本组实施方式以批号为400009的沉香舒郁片为实验药品，考察色谱条件对于沉香舒郁片中各组分峰位的分离效果。

取沉香舒郁片(批号400009)，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，而后使用色谱柱进行气相色谱检测。

实施例1～11

本组实施例采用DB-5色谱柱按照表1所示的色谱条件对得到的供试品溶液进行气相色谱检测。

表1色谱条件优化方案

上述实施例1～3的气相色谱结果如图1所示，由图1可以看出，改变进样口与检测器温度不会对色谱峰的数量、峰分离度等有影响，为节约仪器能源，因此选择进样口300℃、检测器320℃。

上述实施例3～5的气相色谱检测结果如图2所示，由图2可以看出，初始温度越低，保留时间靠前的色谱峰(虚线位置)分离效果越好，即实施例3分离出更多小的色谱峰，实施例5把色谱峰都包成一个色谱峰，因此选择60℃作为初始温度。

上述实施例3、6、7的气相色谱检测结果的局部放大结果如图3所示，对比实施例3和6可以看出，降低升温速率有利于保留时间靠前的色谱峰的分离(虚线位置)，对比实施例6和7可以看出，实施例7相对实施例6增加了初始保留时间2min，但其对色谱峰分离没有影响。

实施例6、8和9的气相色谱检测结果的局部放大结果如图4所示，由图4可以看出，实施例8和9的色谱峰分离度优于实施例6(虚线位置)，鉴于实施例9的出峰时间较晚，因此选择实施例8的升温程序。

实施例8、10和11的气相色谱检测结果的局部放大结果如图5所示，由图5可以看出，分流比越大，色谱峰响应越好，基线越平稳，因此选择分流比10:1。

综上，确定的色谱条件为：以(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱(柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm)；柱温为程序升温：初始温度为60℃，以每分钟5℃的速率升温至150℃，再以每分钟8℃的速率升温至300℃，保持23.25分钟；进样口温度为300℃；检测器温度为320℃；分流进样，分流比10：1。

实施例12和13

实施例12和13的色谱条件为：初始温度60℃，以每分钟8℃的速率升温至300℃，保持30分钟，进样口温度为300℃；检测器温度为320℃；分流进样，分流比20：1。区别在于，实施例12使用的色谱柱为DB-1，实施例13使用的色谱柱为DB-5，色谱检测结果如图6所示。结果表明，色谱柱DB-5所分离出的峰多于DB-1，且色谱峰分离情况更好，基线更加平稳，最终确认DB-5柱为实验用色谱柱。

实施方式二

本组实施方式以批号为400009的沉香舒郁片为实验药品，按照实施例方式一得到的色谱条件，考察供试品溶液的制备参数对于沉香舒郁片中各组分峰位的分离效果。

实施例14～17

本组实施例取沉香舒郁片(批号400009)，研细，称取0.5g，精密称定，平行4份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同的有机溶剂10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用对应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照实施方式一得到的色谱条件进行测定。实施例14～17的区别在于，所用的有机溶剂分别为乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮和无水乙醇，气相色谱检测结果如图7所示，实验结果表明无水乙醇提取出的色谱峰最多且大，其他三种溶剂的提取效果基本一致，因此选择无水乙醇作为提取溶剂。

实施例18～20

本组实施例取沉香舒郁片(批号400009)，研细，称取0.5g，精密称定，称取3份，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，分别以不同的方式提取沉香舒郁片，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照实施方式一得到的色谱条件进行测定。实施例18的提取方式为回流提取，实施例19的提取方式为超声处理(功率500W，频率40kHz)，实施例20的提取方式为振荡30分钟，气相色谱检测结果如图8所示，实验结果表明，回流提取出的色谱峰多于超声提取和振荡提取，因此选择回流提取作为提取方式。

实施例21～23

本组实施例取沉香舒郁片(批号400009)，研细，称取0.5g，精密称定，称取3份，置具塞锥形瓶中，实施例21～23分别精密加入无水乙醇10ml、20ml和50ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照实施方式一得到的色谱条件进行测定，检测结果如表2所示。

表2沉香舒郁片不同提取体积各峰面积对比表

由表中数据可见，提取体积为20ml和50ml时，浓度较低，部分色谱峰响应不佳，导致没有积分出色谱峰，因此选择10ml作为提取体积。

实施例24～27

取沉香舒郁片(批号400009)，研细，称取0.5g，平行4份，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，实施例24～27分别回流提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照实施方式一得到的色谱条件进行测定，检测结果如表3所示。

表3沉香舒郁片不同提取时间各峰面积对比表

表中数据可见，不同提取时间下，大部分色谱峰的峰面积基本一致，但是有部分色谱峰(如峰1、3、4、6)是提取时间越长峰面积越大，部分色谱峰(如峰2、29、33)是提取时间越短峰面积越大，考虑到色谱峰的整体性，选择中间的提取时间30分钟作为提取时间。

综上，确定的供试品溶液制备方法为：取本品适量，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施方式三

本组实施方式对不同参考品的选择进行了考察。

实施例28～32分别使用无水乙醇作为溶剂配置去氢木香内酯(浓度0.9950mg/ml)、厚朴酚(浓度0.5080mg/ml)、和厚朴酚(浓度0.5100mg/ml)、木香烃内酯(浓度0.6444mg/ml)、百秋李醇(浓度0.4970mg/ml)对照品溶液，对沉香舒郁片气相指纹图谱的主要色谱峰进行指认，结果见图9～14，其中图9为沉香舒郁片气相指纹图谱，图10～14分别为百秋李醇气、木香烃内酯、去氢木香内酯、厚朴酚和和厚朴酚的气相指纹图谱。经过对比，为准确描述本品中色谱峰的位置，设定峰面积较大，分离度较好的去氢木香内酯为参照物峰。

实施方式四

本组实施例对气相色谱法检测沉香舒郁片的合理性进行考察。

实施例33指纹图谱完整性的考察

取本品供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，照拟定方法检测，记录2小时的色谱图，显示60分钟以后无色谱峰流出，结果见图15，因此确定色谱图记录时间为60分钟。

实施例34阴性干扰试验

取供试品制备中所用批号的无水乙醇，按照拟定的色谱条件进行测定，并与供试品溶液进行对比，结果见图16，实验结果表明，溶剂空白对样品检测没有影响。

实施例35精密度试验

取本品(批号400009)适量，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，连续测定6次，相似度结果见表4及图17～22。

表4沉香舒郁片指纹图谱考察精密度试验(相似度)

结果表明，沉香舒郁片供试品溶液相似度均＞0.95，精密度试验符合要求。

实施例36重复性试验

取本品(批号400009)适量，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，相似度结果见表5，图23～28。

表5沉香舒郁片指纹图谱考察重复性试验(相似度)

结果表明，沉香舒郁片供试品溶液之间相似度均＞0.95，重复性试验符合要求。

实施例37稳定性试验

取本品(批号为400009)供试品溶液在室温下保存，分别于0、2、4、8、20、24小时测定，相似度结果见表6，图29～34。

表6沉香舒郁片指纹图谱考察重复性试验(相似度)

结果显示，沉香舒郁片供试品溶液之间相似度均＞0.95，表明供试品溶液在24小时内稳定。

实施例38流速耐用性试验

取本品(批号：400009)供试品溶液，在拟定色谱条件下，分别于流速0.8ml/min、流速1.0ml/min、流速1.2ml/min进行测定，对比图见图35，相似度计算结果见表7。由图35可以看出流速的改变对主要色谱峰的分离没有影响，对一些分离度较差的色谱峰有一定影响(虚线位置)，但这些色谱峰峰面积较小，因此可以忽略其影响。

表7耐用性流速试验相似度结果

由表7可以看出，三个流速下的沉香舒郁片气相指纹图谱相似度均＞0.90，因此可表明沉香舒郁片气相指纹图谱的检测方法对流速的耐用性较好。

实施例39不同厂家色谱柱耐用性试验

取本品(批号：400009)供试品溶液，在拟定色谱条件下，分别使用安捷伦公司(DB-5)、菲罗门公司(ZB-5)、赛默飞世尔公司(TR-5)的气相毛细管色谱柱进行测定，对比图见图36，相似度计算结果见表8。由图36可以看出，图中可以看出色谱柱厂家的改变对主要色谱峰的分离没有影响，对一些分离度较差的色谱峰有一定影响(虚线位置)，但这些色谱峰峰面积较小，因此可以忽略其影响。

表8耐用性色谱柱试验相似度结果

由表8可以看出，三个不同生产编号色谱柱下的沉香舒郁片气相指纹图谱相似度均＞0.90，因此可表明沉香舒郁片气相指纹图谱的检测方法对不同厂家的色谱柱的耐用性较好。

实施例40系统适应性试验

综合上述各条件下参照物峰去氢木香内酯的理论塔板数，规定理论塔板数按参照物峰计算应不低于2000000，见表9。

表9理论塔板数计算结果表

实施方式五

本组实施方式对指纹峰的确定进行了考察。

实施例41

本实施例考察了共有峰的确定方法。

选择6批供试品气相色谱图所给出的相关参数，确定共有峰数量，见图37。

根据6批供试品气相色谱图所给出的相关参数，确定共有峰数量应有26个，各共有峰依次标号为1，2，…，26，其中参照物峰(去氢木香内酯)标号为11(S)，见图38～43，图38～43分别为批号400009、400010、FJ40007、FJ40008、GA40009、GA40010的气相指纹图谱。

实施例42

本实施例考察了共有峰的相对保留时间。

以11号峰(去氢木香内酯)作为参照峰，计算6批供试品各共有峰相对保留时间比值，结果见表10。

表10共有峰相对保留时间

结果表明，相对保留时间具有较好的重复性，各共有峰相对保留时间与其均值的差值均小于0.9％。

实施例43

本实施例考察了指纹图谱相似度。

通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”对沉香舒郁片6批样品的色谱图进行计算和处理，得到沉香舒郁片气相色谱对照指纹图谱(图44)，各批供试品与对照指纹图谱间的相似度均≥0.95。相似度结果见表11。

表11沉香舒郁片6批图谱与对照指纹图谱相似度结果

实施方式六

本实施方式对得到的26个色谱峰的归属进行了考察。

按照处方量，称取甘草对照药材0.1g、陈皮对照药材0.15g、柴胡对照药材0.1g，沉香对照药材0.15g，砂仁对照药材0.12g，木香对照药材0.2g、厚朴对照药材0.15g、枳壳对照药材0.1g、香附对照药材0.1g、延胡索对照药材0.1g、姜黄对照药材0.1g、青皮对照药材0.1g、豆蔻药材0.1g，分别置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按照拟定的色谱条件进行测定，对共有峰中的色谱峰进行归属。见表12，图45～57依次为上述13种对照药材的色谱检测结果。

表12色谱峰归属表

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (12)

1.一种沉香舒郁片气相色谱标准对照指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

不同批次沉香舒郁片经无水乙醇回流提取得到供试品溶液，采用气相色谱仪对供试品溶液检测得到气相色谱，选择不同批次沉香舒郁片气相指纹图谱中的共有峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，确定沉香舒郁片对照指纹图谱；

所述气相色谱的色谱条件为：

以5%苯基-95%甲基聚硅氧烷为固定相，柱温初始温度为60℃，以5℃/min的速率升温至150℃，再以8℃/min的速率升温至300℃，而后保持23.25min，进样口温度为300℃，检测器温度为320℃，分流比为10:1。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，色谱柱为DB-5色谱柱。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括，沉香舒郁片研磨后加入至无水乙醇中，回流提取15~60min后，过滤取滤液，向滤液中补加无水乙醇至滤液质量与回流前等重，即得到供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，沉香舒郁片研磨后加入至无水乙醇过程中，每克沉香舒郁片对应的无水乙醇的体积为20~100ml。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：

沉香舒郁片研磨后加入至无水乙醇中，称重记为质量A，回流提取30min后，过滤取滤液，向滤液中补加无水乙醇至滤液质量为质量A，即得到供试品溶液；

其中，每克述沉香舒郁片对应的有机溶剂的体积为20ml。

6.根据权利要求1~5任一项所述的构建方法，其特征在于，

所述共有峰的获取方法包括：

以沉香舒郁片的有效成分为参考制备标准对照品溶液，对不同批次沉香舒郁片得到的供试品溶液与标准对照品溶液同时进行气相色谱检测，得到以有效成分为参考的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰；

所述对照指纹图谱的获取方法包括，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对得到的不同批次沉香舒郁片共有的气相色谱峰进行拟合，确定沉香舒郁片对照气相指纹图谱。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述沉香舒郁片的有效成分包括去氢木香内酯、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯或百秋李醇中至少一种。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述去氢木香内酯浓度为0.9950mg/ml。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述厚朴酚浓度为0.5080mg/ml。

10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述木香烃内酯浓度为0.6444mg/ml。

11.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述百秋李醇浓度为0.4970mg/ml。

12.权利要求1~11任一项所述的构建方法在沉香舒郁片质量控制中的应用。

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