CN109799303A - 止血调经组合物的指纹图谱构建方法、定量检测方法及质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种止血调经组合物的指纹图谱构建方法、定量检测方法及质量检测方法，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：将所述止血调经组合物制成供试品溶液，采用高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到具有共有特征峰的所述止血调经组合物的指纹图谱。本发明为止血调经组合物的质量研究提供了试验依据，为止血调经组合物提供了综合的质量评价方法，为该组合物的质量内部管控和提升提供了很好的依据，同时也对确保其临床疗效具有极其重要的意义。

Description

止血调经组合物的指纹图谱构建方法、定量检测方法及质量 检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，特别是涉及一种止血调经组合物的指纹图谱构建方法、定量检测方法及质量检测方法。

背景技术

止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断等9味中药组成，方中揉合了当归补血汤、阿胶养血膏等方剂，具有益气养血、止血调经功能，用于上环所致经期延长气血两虚证者，症见经血过期不净、月经色淡、神疲乏力、头晕眼花、少腹坠胀、色淡、苔薄白、脉细弱，具体产品包括止血调经颗粒等。

目前止血调经组合物的企业质量标准方法中仅采用薄层色谱法(TLC)对成品中的没食子酸、芍药苷两个成分或当归、佛手两位药材进行定性鉴别，或者采用高效液相色谱法(HPLC)对黄芪甲苷进行定量测定。但止血调经颗粒全方成分复杂，由9味中药组成，仅以两三个成分的检测结果无法全面表征处方的物质基础，难以全面控制止血调经组合物的内在质量。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够更全面地表征止血调经组合物的内在质量的止血调经组合物的指纹图谱构建方法。

一种止血调经组合物的指纹图谱构建方法，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成供试品溶液，采用高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到具有共有特征峰的所述止血调经组合物的指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

指纹图谱是当今国内外公认的能较好反映中药内在质量和鉴别真伪的方法，通过建立药用植物指纹图谱，可以较全面的反映中药所含内在化学成分的种类和数量。本发明建立了止血调经组合物的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出11个共有峰，相似度均大于0.95，说明所建立的指纹图谱具有较好的稳定性和可控性，能为止血调经组合物的质量评价提供依据。此外，对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，可确认共有峰的药材归属，所有峰都得到了峰来源归属。指纹图谱经过和对照品的图谱比对，其中三个峰的物质成分得到确认，4号为芍药苷，5号为毛蕊异黄酮葡萄糖苷以及10号峰为芒柄花苷。在进一步的方法学试验验证中，证明该方法同时适合于对该复方中芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定。综上所述，本发明为止血调经组合物的质量研究提供了试验依据，为止血调经组合物提供了综合的质量评价方法，为该组合物的质量内部管控和提升提供了很好的依据，同时也对确保其临床疗效具有极其重要的意义。

在其中一个实施例中，所述检测波长为254nm。

在其中一个实施例中，将所述止血调经组合物制成供试品溶液的步骤包括：将所述止血调经组合物粉碎，然后与溶剂混合，超声提取后取上清液过滤，收集滤液得到所述供试品溶液。

在其中一个实施例中，所述止血调经组合物与所述溶剂的质量体积比为(2～3)g:(18～22)mL。

在其中一个实施例中，所述C₁₈键合硅胶色谱柱的长度为200mm～300mm，内径为3mm～5mm，固定相的粒径为4μm～6μm。

在其中一个实施例中，所述C₁₈键合硅胶色谱柱为Thermo Acclaim 120 C18液相色谱柱。

在其中一个实施例中，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述C₁₈键合硅胶色谱柱的柱温为25℃～35℃。

本发明还提供了一种止血调经组合物的指纹图谱，根据上述指纹图谱构建方法得到。

本发明还提供了一种止血调经组合物中活性成分的定量检测方法，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述活性成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷中的任意一种，所述定量检测方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测所述待测品溶液，得到所述待测品溶液的色谱图，根据所述色谱图中与所述活性成分对应的峰的峰面积计算所述活性成分的含量；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

本发明还提供了一种止血调经组合物的质量检测方法，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述质量检测方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测所述待测品溶液，得到所述待测品溶液的色谱图，将所述色谱图与上述指纹图谱构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，根据所述相似度对所述止血调经组合物的质量进行评价；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

附图说明

图1为止血调经颗粒全波长扫描2D图谱；

图2为止血调经颗粒全波长扫描3D图谱；

图3为10批止血调经颗粒的HPLC指纹图谱；

图4为止血调经颗粒的指纹图谱和对照品溶液的图谱；

图5为止血调经颗粒的指纹图谱和原药材的图谱；

图6为芍药苷的标准曲线图；

图7为毛蕊异黄酮葡萄糖苷的标准曲线图；

图8为芒柄花苷的标准曲线图；

图9为实施例2～5的图谱；

图10为实施例6～8的图谱；

图11为对比例1的图谱；

图12为对比例2的图谱。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的止血调经组合物的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：将止血调经组合物制成供试品溶液，采用高效液相色谱检测上述供试品溶液，得到具有共有特征峰的所述止血调经组合物的指纹图谱。其中，上述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

指纹图谱是当今国内外公认的能较好反映中药内在质量和鉴别真伪的方法，通过建立药用植物指纹图谱，可以较全面的反映中药所含内在化学成分的种类和数量。本发明建立了止血调经组合物的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出11个共有峰，相似度均大于0.95，说明所建立的指纹图谱具有较好的稳定性和可控性，能为止血调经组合物的质量评价提供依据。此外，对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，可确认共有峰的药材归属，所有峰都得到了峰来源归属。指纹图谱经过和对照品的图谱比对，其中三个峰的物质成分得到确认，4号为芍药苷，5号为毛蕊异黄酮葡萄糖苷以及10号峰为芒柄花苷。在进一步的方法学试验验证中，证明该方法同时适合于对该复方中芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定。综上所述，本发明为止血调经组合物的质量研究提供了试验依据，为止血调经组合物提供了综合的质量评价方法，为该组合物的质量内部管控和提升提供了很好的依据，同时也对确保其临床疗效具有极其重要的意义。

在一个具体示例中，检测波长为254nm。通过对波长210nm、230nm、254nm、270nm等进行对比筛选后，发现254nm波长下的图谱对止血调经组合物中的各物质均有更好的吸收。

在一个具体示例中，将止血调经组合物制成供试品溶液的步骤包括：将止血调经组合物粉碎，然后与溶剂混合，超声提取后取上清液过滤，收集滤液得到供试品溶液。

在一个具体示例中，溶剂为甲醇。通过分别采用水、30％体积百分比甲醇水溶液、50％体积百分比甲醇水溶液、80％体积百分比甲醇水溶液和甲醇作为提取溶剂，对比所得色谱图的出峰情况，发现纯甲醇作为提取溶剂时，基线更加的平稳。

在一个具体示例中，止血调经组合物与溶剂的质量体积比为(2～3)g:(18～22)mL。

在一个具体示例中，C₁₈键合硅胶色谱柱的长度为200mm～300mm，内径为3mm～5mm，固定相的粒径为4μm～6μm。进一步地，C₁₈键合硅胶色谱柱为Thermo Acclaim 120 C18液相色谱柱，长度为250mm，内径为4.6mm，固定相的粒径为5μm，可以理解，具体品牌型号不限于此。

在一个具体示例中，流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，C₁₈键合硅胶色谱柱的柱温为25℃～35℃。进一步地，流动相的流速为1.0mL/min，C₁₈键合硅胶色谱柱的柱温为30℃。

在一个具体示例中，供试品溶液的进样量为5μL～20μL。进一步地，供试品溶液的进样量为10μL。

本发明一实施例的止血调经组合物中活性成分的定量检测方法，包括以下步骤：

将止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测待测品溶液，得到待测品溶液的色谱图，根据色谱图中与活性成分对应的峰的峰面积计算活性成分的含量，例如根据峰面积积分值与浓度的标准曲线计算。其中，止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，活性成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷中的任意一种，高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

本发明一实施例的止血调经组合物的质量检测方法，包括以下步骤：

将止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测待测品溶液，得到待测品溶液的色谱图，将色谱图与上述指纹图谱构建方法得到的指纹图谱比较，计算相似度，根据相似度对止血调经组合物的质量进行评价；其中，止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

以下为具体实施例。

仪器：赛默飞Ultimate3000系列高效液相色谱仪，色谱软件为：ChromeleonChromatography Data System 7.2；电子分析天平AE100(十万分之一，Mettler Toledo)；超声波清洗仪(型号：KQ 2200E，昆山市超声仪器有限公司)。

试药：乙腈(色谱纯，sigma-aldrich公司)；甲醇(色谱纯，sigma-aldrich公司)；超纯水(型号：PLSW series，青海蓝天有限公司)；芍药苷(批号：110736-201842，中国食品药品检定研究院)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，中国食品药品检定研究院)；芒柄花苷(批号：111703-201504，中国食品药品检定研究院)；黄芪、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断等8味药材均由湖南安邦制药有限公司提供，10批次止血调经颗粒由湖南安邦制药有限公司研制生产(S1～S10样品)。

实施例1

色谱条件：Thermo Acclaim^TM 120 C18柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相：A为纯水，B为乙腈；洗脱梯度：0～5min，5％B；5～40min，5％～35％B；40～60min，35％～95％B；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：10μL。关于检测波长，采用DAD全波长扫描的方式，选择了一个各峰面积相对较为明显的波长254nm，全波长图谱见图1和图2。

供试品溶液的制备：分别取10批次的止血调经颗粒样品(S1～S10样品)适量，粉碎，取约2.5g，精密称定，至25mL锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称量，超声提取30min后，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀静置，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取滤液，即得供试品溶液。

精密吸取10μL供试品溶液，检测波长254nm，分别进样测定，记录60min的图谱。结果采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”进行数据分析处理，设定S1样品为参照图谱，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成止血调经颗粒特征图谱，如图3-R所示。根据10批止血调经颗粒的特征图谱检测结果，通过相似度评价软件，共标出11处共有峰，其中，以峰4为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表1和表2。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件计算上述S1～S10样品的图谱与生成的特征图谱的相似度，结果分别为0.972、0.973、0.959、0.986、0.965、0.979、0.989、0.968、0.963和0.989，各批止血调经颗粒与特征图谱之间相似度均大于0.95，表明相似度良好。

表2 10批止血调经颗粒HPLC指纹图谱共有峰相对峰面积

参照峰的确定：分别精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷对照品适量，用甲醇溶解并定容，配成含芍药苷浓度为1.9mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为1.55mg/mL和芒柄花苷浓度为0.59mg/mL的对照品溶液。采用相同的高效液相色谱条件分别对对照品溶液进行检测得到色谱图，将其与止血调经颗粒的特征图谱比较分析，可指认4号峰为芍药苷，5号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰为芒柄花苷，如图4所示。其中，a为止血调经颗粒样品的图谱，b为毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液的图谱，c为芍药苷对照品溶液的图谱，d为芒柄花苷对照品溶液的图谱，4号峰分离度较好(分离度为2.50)，峰面积也比较稳定，故选择此峰作为参照峰。

共有峰的来源确认：考虑到复方制剂前，所有药材都是经过加热回流提取，若需对复方指纹图谱中的各峰来源进行确认，应尽量保证药材和复方前处理方法的一致性。分别取止血调经颗粒组方中的8味药材(除阿胶)各约5g，精密称定，至150mL圆底烧瓶中，精密加入水50mL，加热回流60min后，过滤，蒸干，再加入甲醇40mL，超声30min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取滤液，即得药材样品溶液。分别精密吸取8味药材样品溶液各10μL进样，注入高效液相色谱仪，记录60min色谱图。对保留时间保持一致的色谱峰进行分析比较，根据紫外光谱信息，对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认共有峰的药材归属，如图5所示。通过止血调经颗粒复方和全方药材相关性研究，可确认止血调经颗粒复方HPLC指纹图谱11个特征峰的来源，指纹峰各来自黄芪(1号峰、5号峰、7号峰、10号峰)、党参(1号峰)、续断(2号峰、3号峰)、白芍(4号峰)、当归(6号峰)、茜草(6号峰、8号峰、11号峰)和仙鹤草(9号峰)。由于阿胶的物质成分主要为蛋白质类和微量元素，不适合于采用液相检测，故此处未对阿胶进行检测，而佛手涉及到的物质成分色谱峰峰高较低，且存在于大多数没有完全分离的色谱峰中，所以在复方中没有明显的特征图谱。

精密度测试：精密吸取同一供试品溶液(S1样品)10μL，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录其色谱图。以4号峰(芍药苷)为参照，计算11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.02％～0.10％和0.38％～7.85％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求，详情见表3。

重复性测试：取止血调经颗粒粉末(S1样品)6份，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，分别进样测定，记录色谱图。以4号峰(芍药苷)为参照峰，计算11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.01％～0.14％和1.16％～9.81％，表明该方法重复性好，详情见表3。

稳定性测试：精密吸取同一供试品溶液(S1样品)10μL，分别于0、4、8、12、16、24h进行测定，记录色谱图。以4号峰(芍药苷)为参照峰，计算11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.08％～1.13％和1.04％～8.89％。结果表明，供试品溶液于24h内测定结果稳定，详情见表3。

表3方法学考察结果

以下进一步通过方法学试验验证，证明该方法同时适合于对该止血调经复方中芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行含量测定。

芍药苷线性关系考察：精密吸取浓度为11.4μg/mL、57μg/mL、114μg/mL、142.5μg/mL、285μg/mL的芍药苷溶液各10μL进样得到图谱，测定其峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，制得标准曲线，其回归方程为y＝0.0242x+0.0214(r²＝1)。表明芍药苷在0.114μg～2.85μg范围内具有良好的线性关系，数据见表4，标准曲线图如图6所示。

表4芍药苷线性关系考察结果表

浓度(μg/mL)	11.4	57	114	142.5	285
						峰面积值	0.2903	1.4123	2.7636	3.4877	6.917

毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系考察：精密吸取浓度为1.86μg/mL、9.3μg/mL、18.6μg/mL、46.5μg/mL、93μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷溶液各10μL进样得到图谱，测定其峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，制得标准曲线，其回归方程为y＝0.31543x-0.3685(r²＝0.9995)。表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在0.0186μg～0.93μg范围内具有良好的线性关系，数据见表5，标准曲线图如图7所示。

表5毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系考察结果表

浓度(μg/mL)	1.86	9.30	18.60	46.50	93.00
						峰面积值	0.5009	2.5331	5.0886	14.4576	28.9662

芒柄花苷线性关系考察：精密吸取浓度为0.177μg/mL、1.416μg/mL、2.655μg/mL、8.85μg/mL、17.7μg/mL的芒柄花苷各10μL进样得到图谱，测定其峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，制得标准曲线，其回归方程为y＝0.9744x+0.043(r²＝1)。表明芒柄花苷在0.0177μg～0.177μg范围内具有良好的线性关系，数据见表6，标准曲线图如图8所示。

表6芒柄花苷线性关系考察结果表

浓度(μg/ml)	0.177	1.416	2.655	8.85	17.7
						峰面积值	0.1926	1.4081	2.6550	8.6956	17.2922

精密度试验：精密吸取同一供试品溶液(S1样品)10μL，重复进样6次，测定其峰面积积分值，其结果见表7，结果表明本方法精密度好。

表7精密度试验结果表

重复性试验：取同一批号样品(S1样品)分别按上述步骤制备6份供试品溶液，平行测定6次，结果见表8，结果表明本方法重现性好。

表8重复性试验结果表

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液(S1样品)10μl，分别于0、2、4、8、12、24小时进样，测定其峰面积积分值，结果见表9，结果表明供试品溶液在24小时内峰面积值基本稳定。

表9稳定性试验结果表

回收率试验：精密称量已知芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的样品(S1样品)1.25g，共取6份，分别精密加入芍药苷对照品溶液(0.817mg/ml)1.5ml，即1225.50μg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(0.093mg/ml)1.3ml，即120.9μg，至25mL锥形瓶中，精密加入相应甲醇溶液17.2mL，超声提取30min后，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀静止，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取滤液进行检测，结果如表10和表11所示。试验过程中也尝试对芒柄花苷进行加标试验，然其分离度低，导致样品加标后无法和旁边的小峰完全分离，于是没有相应的测试结果，而芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的加标回收率结果均在95％～110％之间，表示本方法对二者的加样回收率较好。

表10芍药苷回收率测定结果表

表11毛蕊异黄酮葡萄糖苷回收率测定结果表

实施例2～5

实施例2～5与实施例1的方法基本相同，区别仅在于制备供试品溶液时，溶剂分别为水、30％体积百分比甲醇水溶液、50％体积百分比甲醇水溶液和80％体积百分比甲醇水溶液，色谱结果如图9所示，其中A为实施例1，B为实施例5，C为实施例4，D为实施例3，E为实施例2。

实施例6～8

实施例6～8与实施例1的方法基本相同，区别仅在于检测波长分别为210nm、230nm和270nm，色谱结果如图10所示。

对比例1

本对比例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于色谱条件不同：色谱柱：ThermoAcclaim^TM 120 C18柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相：A为纯水，C为甲醇；洗脱梯度：0～5min，5％C；5～30min，5～100％C；30～40min，100％C；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。色谱结果如图11所示，分离效果很差。

对比例2

本对比例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于色谱条件不同：色谱柱：ThermoAcclaim^TM 120 C18柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相：A为纯水，B为乙腈；洗脱梯度：0～5min，5％B；5～45min，5～95％B；45～50min，95％B；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。色谱结果如图12所示，分离效果很差。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种止血调经组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成供试品溶液，采用高效液相色谱检测所述供试品溶液，得到具有共有特征峰的所述止血调经组合物的指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

2.根据权利要求1所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述检测波长为254nm。

3.根据权利要求1所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，将所述止血调经组合物制成供试品溶液的步骤包括：将所述止血调经组合物粉碎，然后与溶剂混合，超声提取后取上清液过滤，收集滤液得到所述供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述止血调经组合物与所述溶剂的质量体积比为(2～3)g:(18～22)mL。

5.根据权利要求1所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述C₁₈键合硅胶色谱柱的长度为200mm～300mm，内径为3mm～5mm，固定相的粒径为4μm～6μm。

6.根据权利要求5所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述C₁₈键合硅胶色谱柱为Thermo Acclaim 120 C18液相色谱柱。

7.根据权利要求1～6任一项所述的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min，所述C₁₈键合硅胶色谱柱的柱温为25℃～35℃。

8.一种止血调经组合物的指纹图谱，其特征在于，根据权利要求1～6任一项所述的指纹图谱构建方法得到。

9.一种止血调经组合物中活性成分的定量检测方法，其特征在于，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述活性成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷中的任意一种，所述定量检测方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测所述待测品溶液，得到所述待测品溶液的色谱图，根据所述色谱图中与所述活性成分对应的峰的峰面积计算所述活性成分的含量；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。

10.一种止血调经组合物的质量检测方法，其特征在于，所述止血调经组合物由黄芪、阿胶、党参、白芍、当归、仙鹤草、茜草、佛手和续断组成，所述质量检测方法包括以下步骤：

将所述止血调经组合物制成待测品溶液，采用高效液相色谱检测所述待测品溶液，得到所述待测品溶液的色谱图，将所述色谱图与权利要求8所述的止血调经组合物的指纹图谱比较，计算相似度，根据所述相似度对所述止血调经组合物的质量进行评价；其中，所述高效液相色谱检测的条件为：采用C₁₈键合硅胶色谱柱，检测波长为210nm～270nm，以水和乙腈为流动相，按照如下梯度洗脱程序进行梯度洗脱：

在0～5min，所述流动相中水的体积百分比为95％，乙腈的体积百分比为5％；

在5～40min，所述流动相中水的体积百分比从95％降低至65％，乙腈的体积百分比从5％升高至35％；

在40～60min，所述流动相中水的体积百分比从65％降低至5％，乙腈的体积百分比从35％升高至95％。