CN112858526B - 一种鹅不食草指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体提供了一种鹅不食草指纹图谱及其构建方法，该方法可以同时兼顾鹅不食草中有机酸类、黄酮类及萜类化合物的检测。采用该方法可以检测鹅不食草药材、鹅不食草饮片或者鹅不食草药物制剂，同时该方法可用于比较不同产地鹅不食草之间的差异，根据不同产地饮片所制备的药物制剂的检测结果，选择14个共有峰，其中11个共有峰为已知成分，该检测方法能从色谱的整体特征面貌上监控鹅不食草药物制剂的质量情况。

Description

一种鹅不食草指纹图谱及其构建方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种鹅不食草指纹图谱及其构建方法。

背景技术

鹅不食草为菊科植物鹅不食草Centipeda minima(L.)A.Br.etAschers.的干燥全草，其主要化合物包括挥发油、甾醇类、黄酮类、三萜类、愈创木内酯类和伪愈创木内酯型等，具有发散风寒、通鼻窍、止咳等功效，用于治疗风寒头痛、咳嗽、跌打扭伤、百日咳、疟疾、急慢性鼻炎、过敏性鼻炎等症。

根据已有文献报道，鹅不食草中含有有机酸类、黄酮类、萜类等多类化学成分。《中国药典》2020版一部中，首次以萜类化合物短叶老鹳草素A作为鹅不食草含量测定的指标成分；而其他文献中，常以有机酸类或者黄酮类化合物作为特征图谱的目标成分进行分析研究，以单一成分、或某一类成分为评判标准，不能综合地反映鹅不食草药物制剂的整体质量；因此，需要建立一种能够全面地、快速地检测鹅不食草的方法。为此，如昝珂等采用高效液相色谱法建立了鹅不食草药材的特征图谱方法，并对鹅不食草药材中的7种化学成分的含量进行了测定，该特征图谱方法共选取12个特征峰，其中7个特征峰为已知成分，但这7种已知成分分别为有机酸类和黄酮类(昝珂,谢艳,过立农,等.鹅不食草HPLC特征图谱和7个成分含量测定[J].药物分析杂志,2018,38(1):151-157)。目前暂未有对鹅不食草中的有机酸类、黄酮类、萜类化合物等多类化合物同时进行检测的文献报道。

因此，建立一种鹅不食草及其药物制剂高效液相指纹图谱的方法，对其全面质量检测具有重要意义。

发明内容

因此，本发明的目的在于解决现有技术中鹅不食草指纹图谱的构建方法无法同时提供对鹅不食草中有机酸类、黄酮类、萜类化合物的色谱信息，不能充分的反映鹅不食草药材及其制剂的整体性和特征性的问题，提供了一种鹅不食草指纹图谱及其构建方法。

具体的，本发明公开了一种鹅不食草指纹图谱的构建方法，包括以下步骤，

(1)鹅不食草供试品溶液的制备；

(2)取鹅不食草供试品溶液采用液相色谱法检测，洗脱时间<100-120min，检测波长为320-330nm，洗脱时间≥100-120min时，检测波长为210-230nm。

在某些优选的实施方式中，步骤(2)包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含酸水溶液-乙腈，梯度洗脱程序包括：0→35min→37min→47min→52min→54min→63min→90～95min→95～123min→115～127min→120～152min→145～153min→146～155min，流动相中乙腈的体积百分数为：5-6％→11.7-12％→13％→14.7％→16.5％→19.5％→19.7％→20.7％→20.7％～21.9％→21.9％～43％→43％～50％→50％～5％→5％～6％，流速为0.8-1.2mL/min，柱温为15-40℃，得到鹅不食草指纹图谱。

更优选的实施方式中，梯度洗脱程序还包括150～155min，乙腈的体积百分数为6％。用于平衡色谱柱。

更优选的实施方式中，流速0.9mL/min～1.0mL/min。

更优选的实施方式中，以0.01-0.25vt％磷酸水溶液和/或0.2vt％甲酸水溶液为流动相B。

更优选的实施方式中，所述色谱柱选自InertsustainAQ-C18色谱柱、XBridge C18色谱柱；Kromasil 100-5 C18色谱柱；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；ThermoAcclaimTM120 C18色谱柱中的至少一种。

在某些优选的实施方式中，步骤(2)包括：以含酸水溶液为流动相B，以乙腈为流动相A进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-123min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；123-127min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；127-152min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；152-153min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；153-155min，A：B的体积百分数为6％：94％，洗脱时间<120min，检测波长为325nm，洗脱时间≥120min时，检测波长为225nm。

在某些优选的实施方式中，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为5％→12％：95％→88％；35-37min，A：B的体积百分数为12％→13％：88％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-95min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；95-115min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；115-120min，A：B的体积百分数为21.9％→38％：78.1％→62％；120-150min，A：B的体积百分数为38％→50％：62％→50％；150-151min，A：B的体积百分数为50％→5％：50％→95％；151-155min，A：B的体积百分数为5％：95％，洗脱时间<110min，检测波长为325nm，洗脱时间≥110min时，检测波长为225nm。

在某些优选的实施方式中，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为6％→12％：94％→88％；35-37min，A：B的体积百分数为12％→13％：88％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-93min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；93-115min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；115-117min，A：B的体积百分数为21.9％→38％：78.1％→62％；117-147min，A：B的体积百分数为38％→50％：62％→50％；147-148min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；151-155min，A：B的体积百分数为6％：94％，洗脱时间<105min，检测波长为325nm，洗脱时间≥105min时，检测波长为225nm。

在某些优选的实施方式中，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-95min，A：B的体积百分数为20.7％→21％：79.3％→79％；95-115min，A：B的体积百分数为21％→21.9％：79％→78.1％；115-120min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；120-145min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；145-146min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；146-150min，A：B的体积百分数为6％：94％，洗脱时间<100min，检测波长为325nm，洗脱时间≥100min时，检测波长为225nm。

在某些优选的实施方式中，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-97min，A：B的体积百分数为20.7％：79.3％；97-120min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；120-125min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；125-150min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；150-151min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；151-155min，A：B的体积百分数为6％：94％，洗脱时间<100min，检测波长为325nm，洗脱时间≥100min时，检测波长为225nm。

在某些优选的实施方式中，步骤(1)包括：采用溶剂提取鹅不食草供试品，过滤，取滤液，即得；

更优选地，所述溶剂选自水或者体积百分数为30-70％的甲醇水溶液；所述提取方式选自回流提取或者超声提取；提物溶时溶剂的用量是鹅不食草供试品的10-50倍量；提取时间为15-60分钟。倍量是指每克鹅不食草供试品使用溶剂的毫升数。

在某些优选的实施方式中，所述的构建方法还包括采用绿原酸、短叶老鹳草素A中的至少一种制备对照品溶液的步骤，以及按照本发明任一所述的构建方法中的液相色谱法检测对照品溶液得到对照品指纹图谱的步骤和/或还包括采用鹅不食草对照药材作为参照物按照本发明任一所述的构建方法制备参照物溶液并采用液相色谱法检测参照物溶液得到参照物指纹图谱的步骤；

优选的，绿原酸对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取绿原酸对照品加溶剂制成每1ml含绿原酸对照品40-60μg的溶液；

短叶老鹳草素A对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取短叶老鹳草素A对照品，加溶剂制成每1ml含短叶老鹳草素A对照品40-60μg的溶液；

更优选的，所述溶剂选自甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于30％。

在某些优选的实施方式中，所述鹅不食草供试品选自鹅不食草药材、鹅不食草饮片或者鹅不食草药物制剂。

其中鹅不食草制剂为鹅不食草加入或者不加入辅料，按照常规工艺制备得到。可以但不局限于鹅不食草粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、膏剂、丸剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂等。

某些优选的实施方式中，还包括鹅不食草对照指纹图谱的构建，对多批鹅不食草供试品检测得到的指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成鹅不食草对照指纹图谱。

至少采用2批鹅不食草药材、饮品或者制剂得到对照谱图，例如采用3个批次、8个批次、10个批次、15个批次的鹅不食草药材。

本发明还提供了一种鹅不食草指纹图谱，由上述任一所述的构建方法得到。

某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成鹅不食草对照指纹图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。

本发明还提供了一种鹅不食草对照指纹图谱，其具有14个共有特征峰，保留时间分别为20.7min、35.4min、40.9min、47.2min、62.3min、63.3min、73.0min、78.7min、85.6min、88.0min、142.0min、143.2min、147.2min和149.6min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<2.0％、<0.1％或者<0.05％。

本发明还提供了另一种鹅不食草对照指纹图谱，其具有14个共有特征峰，峰1-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.58(峰1)、1.14(峰3)、1.30(峰4)、1.71(峰5)、1.73(峰6)、2.01(峰7)、2.19(峰8)、2.38(峰9)、2.44(峰10)，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.95(峰11)、0.96(峰12)、0.98(峰13)。

本发明还提供了另一种鹅不食草对照指纹图谱，其具有14个共有特征峰，峰1-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；规定值为：0.58(峰1)、1.14(峰3)、1.30(峰4)、1.71(峰5)、1.73(峰6)、2.01(峰7)、2.19(峰8)、2.38(峰9)、2.44(峰10)，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.95(峰11)、0.96(峰12)、0.98(峰13)；且峰11与峰14的相对峰面积≥0.088。考虑到鹅不食草的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性与其中萜类化合物有关，因此，对萜类化合物进行规定可以更加科学地反应鹅不食草制剂的质量，且通过比较相对峰面积能更直观的判断从原料到制剂有效成分的量值传递情况。

本发明中，鹅不食草对照指纹图谱还可以使用单批次或者多批次鹅不食草供试品按照本发明任一所述的构建方法得到的鹅不食草指纹图谱；可选的，鹅不食草对照指纹图谱还可以使用多批次鹅不食草供试品按照本发明任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成指纹图谱。

优选的，采用鹅不食草道地药材制成饮片构建对照指纹图谱。

本发明的另一个目的在于全面地、快速的检测鹅不食草药材、饮片及其制剂，该方法可以同时检测药材、饮片及其制剂中有机酸类、黄酮类、萜类化合物，可用于不同产地鹅不食草饮片所制备的标准汤剂冻干粉的检测分析，以比较不同产地鹅不食草饮片的差异。

本发明还提供了本发明的鹅不食草指纹图谱的构建方法和/或本发明的鹅不食草对照指纹图谱在鹅不食草产品的质量检测中的用途。

本发明还提供了一种鹅不食草的质量检测方法，包括将待测鹅不食草产品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测鹅不食草产品的指纹图谱为使用待测鹅不食草产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述鹅不食草对照指纹图谱为本发明所述的鹅不食草对照指纹图谱。

鹅不食草产品可以选择鹅不食草药材、鹅不食草饮片或者鹅不食草制剂。其中鹅不食草制剂为鹅不食草加入或者不加入辅料，按照常规工艺制备得到。可以但不局限于鹅不食草粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、膏剂、丸剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂等。

采用相似度评价待测鹅不食草产品的质量，当待测鹅不食草产品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱的相似度如果不低于0.90-1.00(例如0.95)，则为质量合格；如果低于0.90-1.00(例如0.95)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件得到。

本发明还提供了一种鹅不食草的鉴别方法，包括将待鉴别样品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待鉴别样品的指纹图谱为使用待鉴别样品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述鹅不食草对照指纹图谱为本发明所述的鹅不食草对照指纹图谱。

待鉴别样品可以是药材、饮片或者中药制剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的鹅不食草指纹图谱的构建方法，前期研究发现当仅采用210-230nm的波长时，尽管三类化合物均能够呈现，但有机酸类、黄酮类化合物峰响应相对较低、且部分色谱峰之间的分离度不符合要求，导致色谱图中色谱峰的分布不一，不利于其在同一条件下进行分析；当仅检测波长采用290nm、325nm、360nm、370nm时，萜类化合物的响应极低，基本无法被检测到。而本发明通过在<100-120min时，控制检测波长为320-330nm，≥100-120min使控制检测波长为210-230nm，不仅可以将有机酸类、黄酮类、萜类化合物呈现在同一张色谱图中，而且各色谱峰彼此之间的相对大小较为合适，分离状态好，无干扰。

具体的，萜类化合物的紫外最佳吸收波长与有机酸类、黄酮类相差较大，本发明创造性地采用320-330nm的波长来检测有机酸类、黄酮类，采用210-230nm来检测萜类化合物，避免了三类物质无法同时取得高响应的缺陷，将这三类化合物呈现在同一张色谱图中以实现同时检出的目的。并且将波长切换时间确定为100min-120min，改善了对切换点前后特征峰的影响，构建得到具有更多稳定的共有特征峰的指纹图谱，同时提供对鹅不食草中有机酸类、黄酮类、萜类化合物的色谱信息，充分的反映鹅不食草药材、饮片及其制剂的整体性和特征性，可用于比较不同产地鹅不食草或者由其制得的饮片之间的差异。

2.本发明所述的鹅不食草指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含以含体积百分数为0.01-0.25vt％磷酸水溶液和/或0.2vt％甲酸的水溶液-乙腈梯度洗脱，并通过反复试验得到洗脱程序，在本发明的洗脱条件下可以得到14个共有特征峰，并实现了共有特征峰的有效分离，可以全面、清楚、有效的对鹅不食草进行质量检测或者鉴别。

3.本发明所述的鹅不食草指纹图谱的构建方法，通过对柱温、流动相、色谱柱、色谱仪进行考察，确定了最优色谱条件，以及通过对提取时间、温度和方法等进行考察，确定了最佳提取工艺，上述各个单一条件或者组合的优化均能够使构建方法的时间更短，精密度更高、重复性和稳定性更好，能够更加全面的对鹅不食草进行质量监控。

4.本发明所述的鹅不食草的质量检测方法，通过待测鹅不食草产品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较，可以全面、清楚、有效的对鹅不食草进行质量检测。

5.本发明所述的鹅不食草的鉴别方法，通过将待测样品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较，可以有效鉴别鹅不食草的真伪。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为梯度的第一次优化中的优化梯度6的色谱图；图2为第二次优化的优化梯度1的色谱图；图3为第二次优化的优化梯度2的色谱图；图4为第二次优化的优化梯度3的色谱图；图5为第二次优化的优化梯度4的色谱图；图6为第二次优化的优化梯度5的色谱图；图7为柱温40℃考察结果；图8为柱温35℃考察结果；图9为柱温30℃考察结果；图10为柱温25℃考察结果；图11为柱温20℃考察结果；图12为柱温15℃考察结果；图13为梯度的第二次优化中的优化梯度5的色谱图；图14为第三次优化的优化梯度1色谱图；图15为第三次优化的优化梯度2色谱图；图16为第三次优化的优化梯度3色谱图；图17为第三次优化的优化梯度4色谱图；图18为第三次优化的优化梯度5色谱图；图19为色谱柱1(

AQ-C18)供试品色谱图；图20为色谱柱2(

C18)供试品色谱图；图21为色谱柱3(Kromasil 100-5C18)供试品色谱图；图22为色谱柱4(Agilent ZORBAX SB-C18)供试品色谱图；图23为色谱柱5(Ecosil 120-5-AQ PLUS)供试品色谱图；图24为色谱柱6(Thermo AcclaimTM 120 C18)Thermo(25-273)供试品色谱图；图25为进样体积5μl供试品色谱图；图26为进样体积10μl供试品色谱图；图27为进样体积15μl供试品色谱图；图28为进样体积20μl供试品色谱图；图29为15批鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉特征图谱；图30为鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉对照图谱；图31为不同特征峰的对照品定位；图32为鹅不食草供试品色谱图；图33为阴性对照色谱图；图34为waters e2695供试品色谱图；图35为Aglient 1260II供试品色谱图；图36为戴安U3000供试品色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。重量倍量是指每克鹅不食草饮片加入水的毫升数(ml/g)。

实施例1鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉

本实施例提供了一种鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉的制备方法，包括如下步骤：取鹅不食草饮片，砂锅煎煮2次，第一次加入12重量倍量的水浸泡30min，先武火煮沸，再文火煎煮30分钟，过滤，第二次加入10重量倍量的水武火煮沸后，再文火煎煮25分钟，过滤，合并滤液，滤液浓缩(60℃)至料液比为1：1的浓浸膏(料液比为鹅不食草饮片与鹅不食草滤液的质量比(g/g))，置于冷冻干燥机中冷冻干燥，粉碎成粉末，即得。

实施例2鹅不食草配方颗粒

本实施例提供了一种鹅不食配方颗粒的制备方法，包括如下步骤：

取鹅不食草饮片，加热回流提取2次，第一次加入16重量倍量的水浸泡30min，加热回流提取1.0h，过滤，第二次加入14重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04g/ml～1.12g/ml，干燥，加辅料适量，制粒，即得。

实施例3

本实施例提供了一种鹅不食草指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取实施例1制得的鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分数为50％甲醇水溶液10ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，取体积百分数为50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

(2)参照物溶液的制备：取鹅不食草对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，称定重量，加热回流45分钟，加水补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液蒸干，放冷，残渣加50％甲醇水溶液10ml，超声处理30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物A溶液；

精密称取绿原酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.00005g的溶液，摇匀，作为参照物B溶液；

精密称取短叶老鹳草素A对照品，加甲醇制成每1mL份含0.00005g的溶液，摇匀，作为参照物C溶液；

(3)液相色谱法检测：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液0.01ml，注入高效液相色谱仪，测定，分别得鹅不食草指纹图谱、参照物A溶液、参照物B溶液和参照物C溶液的液相色谱；其中，液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(

AQ-C18，柱长250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，体积百分数为0.02％的磷酸水溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-123min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；123-127min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；127-152min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；152-153min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；153-155min，A：B的体积百分数为6％：94％；流速为1.0mL/min；柱温为20℃；检测波长为325nm(<120min)，后变换为225nm(≥120min)；进样体积为10μL。

利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对鹅不食草指纹图谱、参照物A溶液、参照物B溶液和参照物C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，得到鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉对照指纹图谱。

实施例4

本实施例提供了一种鹅不食草指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取实施例2制得的鹅不食草配方颗粒0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分数为50％甲醇水溶液10ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，取体积百分数为50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

(2)参照物溶液的制备：与实施例3相同。

(3)液相色谱法检测：与实施例3相同。

实验例1色谱条件的优化

1.1仪器与试剂：

高效液相色谱仪1：Waters e2695，包括四元梯度输液泵(Alliance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2998二极管阵列紫外检测器、Empower色谱管理系统。高效液相色谱仪2：Thermo Ultimate 3000，包括Pump：LPG-3400SD；ColumCompartment：TCC-3000RS；Autosumpler：WPS-3000SL；Photometer：DAD-3000。高效液相色谱仪3：Agilent 1260，包括G1311B Quat Pump VL；G1367E1260 HiPALS；G4212B 1260DAD。高效液相色谱仪4：Agilent 1260，包括G7111B Quat Pump VL；G7129A 1260Vialsamplar；G7115A 1260VWD。色谱柱：

AQ-C18(5μm，4.6×250mm)；Kromasil 100-5 C18(5μm，4.6×250mm)；ZORBAX SB-C18(5μm，4.6×250mm)；Ecosil 120-5-AQ PLUS(5μm，4.6×250mm)；Thermo AcclaimTM 120 C18(5μm，4.6×250mm)；

C18(5μm，4.6×250mm)；

C18(5μm，4.6×250mm)。鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉(序号1Y-15Y)由华润三九医药股份有限公司从不同产地收集鹅不食草饮片，按照实施例1的制备方法制备而成。新绿原酸(批号：19011731，纯度：98％，上海同田生物技术股份有限公司)；绿原酸(批号：110753-201817，纯度：96.8％，中国食品药品检定研究院)；咖啡酸(批号：110885-200102，纯度：100％，中国食品药品检定研究院)；芦丁(批号：100080-201811，纯度：91.7％，中国食品药品检定研究院)；异绿原酸A(批号：250034-201907，纯度：98％，上海鸿永生物科技有限公司)；异绿原酸B(批号：250035-201907，纯度：98％，上海鸿永生物科技有限公司)；异绿原酸C(批号：250036-201907，纯度：98％，上海鸿永生物科技有限公司)；山金车内酯C(批号：190140-201907，纯度：98％，上海鸿永生物科技有限公司)；山金车内酯D(批号：190141-201907，纯度：98％，上海鸿永生物科技有限公司)；小堆心菊素C(批号：240095-201909，纯度：95％，上海鸿永生物科技有限公司)；短叶老鹳草素A(批号：PS011144，供含量测定用，以98.0％计算，购于成都普思生物科技股份有限公司)。批次1Y～15Y的鹅不食草饮片分别来源于河南省驻马店市确山县、河南省驻马店市确山县、四川省成都市双流县、四川省成都市双流县、四川省成都市双流县、广西玉林市玉州区、广西玉林市玉州区、广西玉林市玉州区、湖北省襄樊市枣阳市、安徽省阜阳市临泉县、湖北省襄樊市枣阳市、湖北省襄樊市枣阳市、河南省驻马店市确山县、安徽省阜阳市临泉县和安徽省阜阳市临泉县。

1.2色谱条件优化

(1)梯度的第一次优化

在实验过程中采用了多个不同的洗脱梯度对同一份鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉样品进行测定，除了梯度程序、波长和柱温之外，其余工艺和条件均与实施例3相同，其中优化梯度1-6的柱温均采用35℃，优化梯度1-4的波长无切换，均为290nm，优化梯度5和6在89min时由波长为290nm切换至225nm，通过比较不同洗脱程序所测定的样品色谱图，从中优选色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且分析时间较为合理的梯度，不同的梯度洗脱程序如表1～2所示。

表1优化梯度1～3洗脱程序

表2优化梯度4～6洗脱程序

结果显示，优化梯度1～4洗脱所呈现的色谱图能够检测到有机酸类和黄酮类化合物，但无法检测到萜类化合物；优化梯度5所呈现的色谱图能够同时检测三类化合物，但部分色谱峰的分离度、峰形以及系统适应性参数相对较差，而优化梯度6洗脱呈现的图谱的主要色谱峰分离度高、且色谱峰分布均匀，基线较平稳且分析时间较为合理，因此暂定流动相梯度为优化梯度6做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。

(2)波长的选择

采用3D全波长扫描，除了波长和柱温之外，其余工艺和条件均与实施例3相同，各波长下的柱温均采用35℃，以色谱峰数量和峰高作为评选指标。结果显示，色谱图前一部分色谱峰(有机酸类、黄酮类)的最佳吸收波长在320nm-330nm之间，而色谱图后一部分色谱峰(萜类)的最佳吸收波长在210nm-230nm之间，结合上述7个波长下色谱峰的情况，选择最佳吸收波长为前一部分是325nm，后切换为225nm，而切换波长的时间点暂定为90min。

(3)流动相的选择

选择流动相系统分别为0.2％甲酸-乙腈、0.2％乙酸-乙腈、水-乙腈、0.25％磷酸-乙腈、0.2％磷酸-乙腈、0.1％磷酸-乙腈、0.05％磷酸-乙腈、0.03％磷酸-乙腈、0.02％磷酸-乙腈、0.01％磷酸-乙腈对鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉分离效果的影响。上述流动相均为含酸水溶液与乙腈的组合，百分数(％)为酸在含酸水溶液中的体积百分数；除了流动相和柱温之外，柱温均为35℃，其余工艺和条件均与实施例3相同。

结果显示，当使用0.2％甲酸-乙腈流动相系统、0.2％乙酸-乙腈流动相系统时，色谱图受波长切换点的影响较大，水-乙腈流动相系统色谱峰信息相对较少；而且，当流动相系统为0.05％磷酸水-乙腈时，保留时间为75.082min的色谱峰旁分离出一个小的色谱峰，说明磷酸浓度对该色谱峰的影响较大，因此后续又考察了0.03％磷酸水-乙腈、0.02％磷酸水-乙腈、0.01％磷酸-水流动相系统，相比于0.25％-0.1％磷酸-乙腈来说，当流动相系统为0.01-0.03％磷酸水-乙腈和0.2％甲酸-乙腈时，各色谱峰的分离度相对其他色谱系统色谱峰的分离度较好，0.02％磷酸水-乙腈时最佳，由于流动相微小的变化对色谱峰的分离效果影响较大，因此建议固定流动相系统为0.02％磷酸-乙腈。

(4)梯度的第二次优化

在上述流动相系统研究后，选定0.02％磷酸水-乙腈流动相系统作为后续考察条件，但上述考察结果的色谱图中，部分色谱峰的分离情况较差，因此需在现有研究结果的基础上，对原有特征图谱梯度洗脱程序进行了优化，其切换波长时间点由上一个梯度色谱图情况以及该梯度的程序决定，除了梯度程序、波长和柱温之外，其余工艺和条件均与实施例3相同，下述优化梯度的柱温均采用35℃，各梯度程序均是由325nm切换至225nm，不同的梯度洗脱程序如表3～4所示，不同梯度洗脱程序色谱图见图1～6。

表3优化梯度的洗脱程序

表4优化梯度的洗脱程序

表5梯度优化考察结果

由表5、图1～6可知，上述梯度均可以呈现丰富的色谱信息，优化梯度5洗脱呈现的图谱，各色谱峰分离度相对其他梯度更佳，基线较平稳且分析时间较为合理，因此暂时确定了流动相梯度为优化梯度5做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。

(5)流速的优化

取同一份鹅不食草配方颗粒样品的供试品溶液，分别以0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min等不同流速测定，除了流速之外，其余工艺和条件均与实施例4相同。结果显示，当流速为0.8mL/min时所呈现的色谱图中部分色谱峰的色谱信息丢失，而流速为1.2mL/min时，能够呈现完整的色谱信息，但色谱峰的分离度不符合要求。因此建议选择流速0.9mL/min～1.0mL/min。其中，流速为1.0mL/min流速的色谱效果较好。

(6)柱温的优化

取同一份鹅不食草配方颗粒样品的供试品溶液，考察不同柱温40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃对本品的分离效果的影响，除了柱温之外，其余工艺和条件均与实施例4相同。结果见图7-12所示，当柱温为40℃、35℃、30℃时所呈现的色谱图均能检测三零化合物，但部分色谱峰的分离度不符合要求；当柱温为25℃时，保留时间为37.427min的色谱峰旁会分离出一个小的色谱峰，为了使各色谱峰呈现较好的分离效果，因此后续又考察了20℃、15℃，对上述六个柱温考察结果进行分析，发现柱温为15℃时，所呈现的色谱图部分色谱峰色谱信息丢失，而柱温为20℃时，能够呈现完整的色谱信息，且色谱峰分离情况相对较好，因此建议选择柱温20℃。

(7)梯度的第三次优化

在上述不同柱温研究后，选定柱温20℃进行后续考察，但柱温20℃的色谱图中，部分色谱峰的分离情况相对较差，因此在该结果的基础上，对原有特征图谱梯度洗脱程序进行了优化，其切换波长时间点由上一个梯度色谱图情况以及该梯度的程序决定，各梯度程序均是由325nm切换至225nm。除了梯度程序之外，其余工艺和条件均与实施例4相同，不同的梯度洗脱程序如表6～7所示，不同梯度洗脱程序的色谱图如图13～18所示。

表6优化梯度的洗脱程序

表7优化梯度的洗脱程序

由图13～18可知，上述梯度条件均可呈现丰富的色谱信息，分离度较低，其中，优化梯度5洗脱呈现的图谱各色谱峰的分离度较其他条件更佳，基线较平稳且分析时间较为合理，因此暂时确定了流动相梯度为优化梯度5做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。

(8)不同色谱柱的选择

取同一份鹅不食草配方颗粒，考察不同色谱柱(

AQ-C18；

C18；Kromasil 100-5 C18；Agilent ZORBAX SB-C18；Ecosil 120-5-AQ PLUS；ThermoAcclaimTM 120 C18)对该品的分离效果，除了色谱柱之外，其余工艺和条件均与实施例4相同。

见图19-24所示，

C18；Kromasil 100-5 C18；Agilent ZORBAX SB-C18和Thermo AcclaimTM 120 C18色谱柱所呈现的色谱图能够检测三类化合物，但各色谱峰的分离度较低，分离效果较差；Ecosil 120-5-AQ PLUS色谱柱不能所呈现的色谱图色谱信息量少，不能够完成三类化合物的检测，而

AQ-C18色谱柱所呈现的色谱图色谱信息量丰富，各色谱峰间分离效果好，因此建议选择

AQ-C18进行后续考察。

(9)色谱条件的确定。

色谱柱(

AQ-C18，柱长250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，0.02％磷酸为流动相B，梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为20℃；0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-123min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；123-127min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；127-152min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；152-153min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；153-155min，A：B的体积百分数为6％：94％；检测波长为325nm(<120分钟)，后变换为225nm(≥120分钟)；理论板数按短叶老鹳草素A峰计算应不低于3000。

实验例2

(1)提取方式的选择

取同一批次鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉，分别采用回流提取和超声提取，除了提取方式之外，其余工艺和条件均与实施例3相同，回流提取与超声提取色谱峰信息接近，但超声提取的主要色谱峰的峰面积较回流提取的主要色谱峰峰面积稍大，且超声处理简单便捷，因此建议采用超声提取进行后续研究。

(2)进样量的考察

取同一份鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉供试品，按照上述确定的色谱条件，分别吸取5μl、10μl、15μl、20μl进样分析，除了进样量之外，其余工艺和条件均与实施例3相同，比较不同进样量对鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉特征图谱色谱峰的影响。不同进样量的色谱图如图25～28所示，进样量为5μl、10μl、15μl、20μl所获得的色谱峰的分离效果无明显差异，但对各峰的系统适应性参数进行分析后，进样体积为10μl时各色谱峰的响应相较好，故选定10μl作为本试验供试品溶液的进样量。

(3)供试品溶液制备方法的确认

鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉供试液制备的方法为：取本品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率200W，频率53kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验例3鹅不食草配方颗粒特征图谱的建立

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比较(以平均数建立参照特征指纹图谱)，并进行方法学考察。

根据实验例1和2，确定鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉HPLC特征指纹图谱按如下方法建立：

(1)供试品溶液的制备：同实施例3的供试品溶液的制备。

(2)参照物溶液的制备：分别称取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、山金车内酯C、山金车内酯D、小堆心菊素C、短叶老鹳草素A对照品适量，精密称定，分别置于不同棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、山金车内酯C、山金车内酯D、小堆心菊素C、短叶老鹳草素A各50μg的溶液，即得。

(3)液相色谱检测：色谱条件如实验例2步骤(9)确定的色谱条件。

(4)特征图谱特征峰的确认及指认

取15个批次的鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉样品分别按照步骤(1)制备供试品溶液，通过步骤(2)的高效液相色谱检测得到15批鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉特征指纹图谱，见图29所示(S1～S15依次为批号1Y～15Y。采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征指纹图谱(或者称对照指纹图谱)，见图30所示。对冻干粉特征图的检测结果进行分析、比较，确认得到的鹅不食草HPLC特征图谱分离度较好的14个色谱峰，并通过LC-MS/MS对特征峰的识别和指认，如表8所示。

通过对照品定位确认，峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为咖啡酸、峰6为芦丁、峰7为异绿原酸B、峰8为异绿原酸A、峰10为异绿原酸C、峰11为山金车内酯D、峰12为山金车内酯C、峰13为小堆心菊素C、峰14为短叶老鹳草素A。具体对照品-供试品定位色谱图检图31。峰1：新绿原酸；峰2：绿原酸；峰3：咖啡酸；峰6：芦丁；峰7：异绿原酸B；峰8：异绿原酸A；峰10：异绿原酸C；峰11：山金车内酯D；峰12：山金车内酯C；峰13：小堆心菊素C；峰14：短叶老鹳草素A。

表8鹅不食草饮片标准汤剂LC/MS/MS分析检测结果

由上述结果，鹅不食草HPLC特征指纹图谱共有色谱峰14个，其中11个峰(峰1、2、3、6、7、8、10、11、12、13、14)为已知成分峰；选取以绿原酸参照物峰相应的色谱峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％、±5％或者±3％的相对范围之内，规定值为：0.58(峰1)、1.14(峰3)、1.30(峰4)、1.71(峰5)、1.73(峰6)、2.01(峰7)、2.19(峰8)、2.38(峰9)、2.44(峰10)；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的色谱峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％、±5％或者±3％的相对范围之内，规定值为：0.95(峰11)、0.96(峰12)、0.98(峰13)；计算峰11与S2峰的相对峰面积，不得少于0.088。所得结果如表9～11所示。

表9鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉对照图谱相对保留时间

表10 15批鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉特征图谱相对保留时间测定结果

表11 15批鹅不食草饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积测定结果

由上述结果，不同产地鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉相对保留时间均在规定值范围内，而相对峰面积波动较大，表明不同产地饮片标准汤剂冻干粉中各化学成分的含量差别较大。

实验例4鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉特征图谱的方法学验证

(1)仪器精密度试验

取同一份供试品(1Y)，按实验例3项下色谱条件，重复进样6次。以绿原酸参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，计算峰11与S2峰的相对峰面积。各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD均小于2.0％，峰11与S2峰的相对峰面积范围是0.14％-0.15％，RSD值小于2.0％，表明该方法仪器精密度良好。

(2)方法重复性试验

取同一批鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉(1Y)6份，按实验例3项下色谱条件进样分析，以绿原酸参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，计算峰11与S2峰的相对峰面积。各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD均小于2.0％，峰11与S2峰的相对峰面积均是0.15％，RSD值小于2.0％，表明本方法重复性良好。

(3)中间精密度(不同操作人员)

取同一批鹅不食草饮片标准汤剂冻干粉(1Y)，分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实验例3项下色谱条件进样分析，以绿原酸参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，计算峰11与S2峰的相对峰面积。各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD均小于2.0％，峰11与S2峰的相对峰面积均是0.15％，RSD值小于2.0％，表明本方法中间精密度良好。

(4)专属性考察

取鹅不食草供试品溶液(1Y)、阴性空白对照样品溶液，按实验例3项下色谱条件进样分析，供试品溶液、阴性对照样品溶液色谱图结果见图32～33，由图可知，该方法专属性良好，阴性无干扰。

(5)稳定性试验

取同一份鹅不食草供试品(1Y)，按实验例3项下色谱条件，分别在0、2、8、10、12、24小时进样分析。以绿原酸参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，计算峰11与S2峰的相对峰面积。各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD均小于2.0％，峰11与S2峰的相对峰面积范围是0.14％-0.15％，RSD值小于2.0％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。

(6)不同色谱仪考察

取同一份鹅不食草供试品(1Y)，分别采用不同型号色谱仪按实验例3项下色谱条件进样分析。以绿原酸参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3～峰10与S1峰的相对保留时间；以短叶老鹳草素A参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰11～峰13与S2峰的相对保留时间，计算峰11与S2峰的相对峰面积。具体结果见图34～36，由图可知，waters e2695和戴安U3000色谱仪均能呈现14个特征峰，Aglient 1260II部分色谱峰缺失。较其他两种品牌的仪器，Waters e2695呈现更好的分离度效果，故建议测定鹅不食草饮片配方颗粒特征图谱时固定使用Waters e2695。

发明所做的举例，而并非是对本发明实施方法的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种鹅不食草指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，

(1)鹅不食草供试品溶液的制备：采用溶剂提取鹅不食草供试品，过滤，取滤液，所述溶剂选自水或者体积百分数为30-70％的甲醇水溶液；对照品溶液的制备：分别称取新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、山金车内酯C、山金车内酯D、小堆心菊素C、短叶老鹳草素A对照品适量，精密称定，分别置于不同棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、山金车内酯C、山金车内酯D、小堆心菊素C、短叶老鹳草素A各50μg的溶液，即得；

(2)取鹅不食草供试品溶液和对照品溶液采用液相色谱法检测，采用

AQ-C18色谱柱，柱温为20℃，流速为1.0mL/min，以0.02％磷酸水溶液为流动相B，以乙腈为流动相A进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序包括：0-35min，A：B的体积百分数为6％→11.7％：94％→88.3％；35-37min，A：B的体积百分数为11.7％→13％：88.3％→87％；37-47min，A：B的体积百分数为13％→14.7％：87％→85.3％；47-52min，A：B的体积百分数为14.7％→16.5％：85.3％→83.5％；52-54min，A：B的体积百分数为16.5％→19.5％：83.5％→80.5％；54-63min，A：B的体积百分数为19.5％→19.7％：80.5％→80.3％；63-90min，A：B的体积百分数为19.7％→20.7％：80.3％→79.3％；90-123min，A：B的体积百分数为20.7％→21.9％：79.3％→78.1％；123-127min，A：B的体积百分数为21.9％→43％：78.1％→57％；127-152min，A：B的体积百分数为43％→50％：57％→50％；152-153min，A：B的体积百分数为50％→6％：50％→94％；153-155min，A：B的体积百分数为6％：94％，洗脱时间<120min，检测波长为325nm，洗脱时间≥120min时，检测波长为225nm；得到鹅不食草指纹图谱和对照品指纹图谱，峰1为新绿原酸、峰2为绿原酸、峰3为咖啡酸、峰6为芦丁、峰7为异绿原酸B、峰8为异绿原酸A、峰10为异绿原酸C、峰11为山金车内酯D、峰12为山金车内酯C、峰13为小堆心菊素C、峰14为短叶老鹳草素A。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取方式选自回流提取或者超声提取；提取时溶剂的用量是鹅不食草供试品的10-50倍量；提取时间为15-60分钟。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用鹅不食草对照药材作为参照物按照权利要求1或2所述的构建方法制备参照物溶液并采用液相色谱法检测参照物溶液得到参照物指纹图谱的步骤。

4.权利要求1-3中任一项所述的鹅不食草指纹图谱的构建方法在鹅不食草产品的质量检测和/或鉴别中的用途。

5.一种鹅不食草的质量检测方法，其特征在于，包括将待测鹅不食草产品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测鹅不食草产品的指纹图谱为使用待测鹅不食草产品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到，所述鹅不食草对照指纹图谱选自如下(1)-(5)中的任意一项：

(1)其具有14个共有特征峰，各特征峰的保留时间与下述各特征峰保留时间的规定值的RSD<2.0％，各特征保留时间的规定值分别为20.7min、35.4min、40.9min、47.2min、62.3min、63.3min、73.0min、78.7min、85.6min、88.0min、142.0min、143.2min、147.2min和149.6min；

(2)其具有14个共有特征峰，峰1、峰3-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1、峰3-峰10的规定值分别为：0.58、1.14、1.30、1.71、1.73、2.01、2.19、2.38、2.44，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰11-峰13的规定值分别为：0.95、0.96、0.98；

(3)其具有14个共有特征峰，峰1、峰3-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1、峰3-峰10的规定值分别为：0.58、1.14、1.30、1.71、1.73、2.01、2.19、2.38、2.44，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰11-峰13的规定值分别为：0.95、0.96、0.98；且峰11与峰14的相对峰面积≥0.088；

(4)使用单批次或者多批次鹅不食草供试品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到的鹅不食草指纹图谱；

(5)使用多批次鹅不食草供试品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。

6.一种鹅不食草的鉴别方法，其特征在于，包括将待鉴别样品的指纹图谱与鹅不食草对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待鉴别样品的指纹图谱为使用待鉴别样品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到，所述鹅不食草对照指纹图谱选自如下(1)-(5)中的任意一项：

(1)其具有14个共有特征峰，各特征峰的保留时间与下述各特征峰保留时间的规定值的RSD<2.0％，各特征保留时间的规定值分别为20.7min、35.4min、40.9min、47.2min、62.3min、63.3min、73.0min、78.7min、85.6min、88.0min、142.0min、143.2min、147.2min和149.6min；

(2)其具有14个共有特征峰，峰1、峰3-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1、峰3-峰10的规定值分别为：0.58、1.14、1.30、1.71、1.73、2.01、2.19、2.38、2.44，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰11-峰13的规定值分别为：0.95、0.96、0.98；

(3)其具有14个共有特征峰，峰1、峰3-峰10与峰2的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰1、峰3-峰10的规定值分别为：0.58、1.14、1.30、1.71、1.73、2.01、2.19、2.38、2.44，峰11-峰13与峰14的相对保留时间在规定值的±10％的范围之内；峰11-峰13的规定值分别为：0.95、0.96、0.98；且

峰11与峰14的相对峰面积≥0.088；

(4)使用单批次或者多批次鹅不食草供试品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到的鹅不食草指纹图谱；

(5)使用多批次鹅不食草供试品按照权利要求1-3中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。

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