CN112444579A - 柴银口服液uplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

柴银口服液uplc指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药制剂分析领域，涉及一种柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备、UPLC色谱条件的确定及UPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，所得指纹图谱有35个共有峰。本发明方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得指纹图谱共有峰多且分离度好，通过与标准指纹图谱中共有峰的比较，可对柴银口服液的质量进行全面评价和控制，确保其内在质量的均一、稳定，提高了临床用药的安全性和有效性。

Description

柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明涉及一种柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法，属于中药制剂分析领域。
背景技术
柴银口服液收载于中国药典2015版一部，由柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘、桔梗、苦杏仁、薄荷、鱼腥草十一味中药原料制备组成，具有清热解毒，利咽止咳功效，主治上呼吸道感染外感风热证，症见发热恶风、头痛、咽痛，汗出，鼻塞流涕，咳嗽，舌边尖红，苔薄黄，临床效果显著。
目前，中国药典2015版一部标准中关于柴银口服液的现行检查项目主要包括：检查苦杏仁中氰苷的理化鉴别，薄荷、柴胡、连翘、青蒿、葛根的薄层色谱鉴别，HPLC测定黄芩苷含量。已有文献报道主要是对柴银口服液中葛根素、连翘苷、绿原酸等指标成分进行单独或同时的HPLC含量测定。柴银口服液由十一味中药材制成，原料多样，成分复杂，仅用薄层色谱法进行指标成分的定性鉴别，并采用高效液相色谱法对其中几种指标成分进行含量测定，不足以全面反映柴银口服液的质量优劣。中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较为全面的控制药品的质量，具有系统性、整体性和稳定性特点。已有学者采用高效液相色谱法对柴银口服液进行了特征指纹图谱研究(李翔,刘皈阳,马建丽,等.柴银口服液快速HPLC特征指纹图谱研究[J].中国药师,2014,17(01):38-40.)，但所得指纹图谱仅有16个共有峰，且分离度不甚理想，难以全面、准确地对柴银口服液进行质量评价。
超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量及色谱峰容量，具有简便准确、灵敏度高、重复性好、检测器种类多等特点，是构建指纹图谱的重要方法之一。目前，尚未见有专利公开及文献报道采用UPLC法对柴银口服液进行指纹图谱研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有柴银口服液的质量控制方法不足，提供一种柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法。其特点是将柴银口服液制成供试品溶液，经过UPLC分离检测，获得柴银口服液UPLC指纹图谱，从而为柴银口服液的真伪鉴别和内在质量控制提供可靠依据。
本发明一种柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法，包括下列步骤：
1)供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液适量，加入30％-80％的甲醇，超声处理10min-20min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)UPLC色谱条件的确定：
Figure BDA0002837303110000021
C18柱；乙腈为流动相A，0.16-0.23％磷酸溶液为流动相B，采用流动相含量及流速梯度变化洗脱；检测波长：227-234nm；柱温：31-34℃；进样量：1-10μl；
3)UPLC标准指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对柴银口服液供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱。
步骤2所述流动相含量及流速梯度变化洗脱条件为：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-48 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％
48-55 0.6 60％ 40％
55-56 0.6→0.4 60％→6％ 40％→94％
优选地，步骤1)所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密量取柴银口服液2ml，精密加入50％甲醇，超声处理15min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
优选地，步骤2)所述检测波长为230nm，柱温为32℃，进样量：2μl。
优选地，步骤2)所述流动相B为0.2％磷酸溶液。
所述指纹图谱共有35个共有特征峰，其中第16号峰为葛根素，第8号峰为新绿原酸，第11号峰为绿原酸，第14号峰为隐绿原酸，第29号峰为黄芩苷，第30号峰为连翘苷，第34号峰为汉黄芩苷，第35号峰为黄芩素。
其中，所述8号峰、11号峰、14号峰、15号峰、27号峰、33号峰为金银花中的成分；28号峰为荆芥中的成分；12号峰、23号峰、24号峰、26号峰、30号峰、31号峰为连翘中的成分；1号峰、2号峰、22号峰为桔梗中成分；29号峰、32号峰、34号峰、35号峰为黄芩中的成分；21号峰为苦杏仁中的成分。
本发明还提供了由上述方法得到的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，具体步骤是将24批柴银口服液样品，按步骤1)制备成供试品溶液，按步骤2)进行UPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到柴银口服液UPLC标准指纹图谱。
与现有技术对比，本发明取得了以下有益技术效果：
1)本发明建立的柴银口服液UPLC指纹图谱检测方法，根据柴银口服液的构成特点，优选最佳流动相组成及其梯度洗脱程序、流速、检测波长等，解决了特征峰难以分开及杂质峰干扰大的难题，所得指纹图谱分离度高、峰形好，各特征峰均实现了基线分离，能更全面、准确地评价柴银口服液的质量。
2)本发明检测方法以葛根素为参照峰，确定35个共有峰为构成柴银口服液指纹图谱的共有峰，较现有柴银制剂HPLC指纹图谱组成更加丰富、全面；从共有峰中鉴定出葛根素、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、黄芩素8个化学成分，并对21个共有峰进行了成分归属，进一步阐明了柴银口服液的化学物质基础。
3)本发明首次建立了柴银口服液的UPLC指纹图谱，为制剂质量提供了全新的检测方法。本发明方法操作简单、准确可靠，具有精密度、稳定性和重复性好的特点。可克服现有技术检测指标单一、不能反映柴银口服液内在质量的不足，实现制剂质量全面、准确评价，从而更有效地保证制剂质量。
4)与现有HPLC指纹图谱检测方法相比，本发明方法检测速度快、进样量小、有机溶剂用量省，节省了时间成本和材料成本，更加高效、环保。
附图说明
图1为柴银口服液UPLC标准指纹图谱(1-35为35个共有峰)
其中第16号峰为葛根素，第8号峰为新绿原酸，第11号峰为绿原酸，第14号峰为隐绿原酸，第29号峰为黄芩苷，第30号峰为连翘苷，第34号峰为汉黄芩苷，第35号峰为黄芩素。
图2为24批柴银口服液的UPLC指纹图谱叠加图
其中第16号峰为葛根素，第8号峰为新绿原酸，第11号峰为绿原酸，第14号峰为隐绿原酸，第29号峰为黄芩苷，第30号峰为连翘苷，第34号峰为汉黄芩苷，第35号峰为黄芩素。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1柴银口服液UPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
柴银口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表1柴银口服液测试样品批号
Figure BDA0002837303110000041
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：
Figure BDA0002837303110000042
C18(4.6x50mm，2.7um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.2％磷酸水溶液为流动相B；检测波长：230nm；柱温：32℃；进样体积：2μl。
按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-48 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％
48-55 0.6 60％ 40％
55-56 0.6→0.4 60％→6％ 40％→94％
2.2供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液2ml，置10ml量瓶中，精密加入50％甲醇，超声处理15min，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定24个批号柴银口服液UPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的35个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.098、0.116、0.125、0.163、0.182、0.219、0.259、0.313、0.416、0.445、0.583、0.606、0.654、0.712、0.747、1.000、1.142、1.20、1.29、1.36、1.47、1.58、1.98、2.03、2.31、2.39、2.55、3.01、3.23、3.30、3.41、3.43、3.51、3.59、3.96。
其中第16号峰为葛根素，第8号峰为新绿原酸，第11号峰为绿原酸，第14号峰为隐绿原酸，第29号峰为黄芩苷，第30号峰为连翘苷，第34号峰为汉黄芩苷，第35号峰为黄芩素。其中8号峰、11号峰、14号峰、15号峰、21号峰、27号峰、33号峰为金银花中的成分；28号峰为荆芥中的成分；12号峰、23号峰、24号峰、26号峰、30号峰、31号峰为连翘中的成分；1号峰、2号峰、22号峰为桔梗中成分；29号峰、32号峰、34号峰、35号峰为黄芩中的成分。
将24个批号的柴银口服液UPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，进行色谱峰匹配，以16号峰为参照确定35个共有峰为构成柴银口服液指纹图谱的共有峰，24批柴银口服液共有峰的相对保留时间见表2，相对峰面积见表3。24批柴银口服液与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.999，0.999，0.998，0.998，0.999，0.999，0.998，0.999，0.999，0.998，0.999，0.999，0.999，0.999，0.998，0.999，0.999，1，0.999，1，0.999，0.999，0.999，0.999。
表2 24批柴银口服液共有峰的相对保留时间(tR)
Figure BDA0002837303110000051
Figure BDA0002837303110000061
续表：
Figure BDA0002837303110000071
Figure BDA0002837303110000081
表3 24批柴银口服液共有峰的相对峰面积(S)
Figure BDA0002837303110000082
Figure BDA0002837303110000091
续表：
Figure BDA0002837303110000092
Figure BDA0002837303110000101
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
取样品(批号：05200081)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以16号峰为参照峰，计算出1～35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
2.4.2稳定性试验
取样品(05200081)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0,2,4,6,8,10,12,14,16,18h，24h进样，以16号峰为参照峰，计算出1～35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在18小时内稳定。
2.4.3重现性试验
取同一批号样品(05200081)，分别精密量取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以16号峰为参照峰，计算出1～35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
实施例2柴银口服液UPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
柴银口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表4。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表4柴银口服液测试样品批号
Figure BDA0002837303110000111
Figure BDA0002837303110000121
2方法与结果
2.1 UPLC色谱条件：色谱柱：
Figure BDA0002837303110000122
C18(4.6x50mm，2.7um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.16％磷酸水溶液为流动相B；检测波长：227nm；柱温：33℃；进样体积：2μl。
按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-42 0.4 28％→40％ 72％→60％
42-50 0.4 40％→60％ 60％→40％
50-55 0.4 60％→6％ 40％→94％
2.2供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液2ml，置10ml量瓶中，精密加入30％甲醇，超声处理10min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定24个批号柴银口服液UPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的35个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.099、0.117、0.126、0.164、0.183、0.313、0.417、0.446、0.583、0.606、0.655、0.710、0.747、1.000、1.142、1.20、1.29、1.36、1.47、1.58、1.98、2.03、2.32、2.40、2.56、3.02、3.25、3.32、3.42、3.43、3.53、3.62、3.95。
实施例3柴银口服液UPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
柴银口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表5。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表5柴银口服液测试样品批号
Figure BDA0002837303110000131
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：
Figure BDA0002837303110000132
C18(4.6x50mm，2.7um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.23％磷酸水溶液为流动相B；检测波长：231nm；柱温：34℃；进样体积：2μl。
按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-50 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％
50-55 0.6 60％ 40％
55-60 0.6→0.4 60％→6％ 40％→94％
2.2供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液2ml，置10ml量瓶中，精密加入40％甲醇，超声处理15min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定24个批号柴银口服液UPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的35个共有峰的相对保留时间tR分别为0.099、0.117、0.126、0.164、0.184、0.221、0.261、0.315、0.418、0.446、0.584、0.606、0.655、0.712、0.748、1.000、1.142、1.20、1.29、1.36、1.47、1.59、1.98、2.03、2.32、2.40、2.56、3.02、3.25、3.32、3.43、3.45、3.54、3.63、3.98。
实施例4柴银口服液UPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
柴银口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表6。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表6柴银口服液测试样品批号
Figure BDA0002837303110000141
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：
Figure BDA0002837303110000142
C18(4.6x50mm，2.7um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.21％磷酸水溶液为流动相B；检测波长：234nm；柱温：31℃；进样体积：2μl。
按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-48 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％
48-55 0.6 60％ 40％
55-60 0.6→0.4 60％→6％ 40％→94％
2.2供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液2ml，置10ml量瓶中，精密加入60％甲醇，超声处理18min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定24个批号柴银口服液UPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的35个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.099、0.117、0.126、0.165、0.184、0.221、0.261、0.315、0.416、0.446、0.584、0.605、0.654、0.711、0.748、1.000、1.143、1.20、1.29、1.36、1.47、1.59、1.98、2.03、2.32、2.40、2.56、3.02、3.25、3.32、3.43、3.45、3.53、3.61、3.99。
实施例5柴银口服液UPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
柴银口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，见表7。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
表7柴银口服液测试样品批号
Figure BDA0002837303110000151
Figure BDA0002837303110000161
2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：
Figure BDA0002837303110000162
C18(4.6x50mm，2.7um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.19％磷酸水溶液为流动相B，检测波长：229nm，柱温：33℃，进样体积：2μl。
按下表进行梯度洗脱：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％
0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％
30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％
40-48 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％
48-55 0.6 60％ 40％
55-65 0.6 60％→80％ 40％→20％
65-68 0.6→0.4 80％-6％ 20％→94％
2.2供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液2ml，置10ml量瓶中，精密加入80％甲醇，超声处理20min，放冷，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定24个批号柴银口服液UPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱，其中以16号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的35个共有峰的相对保留时间tR分别为：0.099、0.118、0.127、0.165、0.184、0.221、0.261、0.315、0.415、0.445、0.584、0.606、0.652、0.711、0.748、1.000、1.14、1.20、1.29、1.33、1.47、1.59、1.99、2.03、2.32、2.40、2.57、3.03、3.26、3.33、3.41、3.43、3.51、3.63、3.97。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种柴银口服液UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)供试品溶液的制备：精密量取柴银口服液适量，加入30％-80％的甲醇，超声处理，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
2)UPLC色谱条件的确定：
Figure FDA0002837303100000011
C18柱；乙腈为流动相A，0.16-0.23％磷酸溶液为流动相B，采用流动相含量及流速梯度变化洗脱；检测波长：227-234nm；柱温：31-34℃；进样量：1-10μl；
3)UPLC标准指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对柴银口服液供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的柴银口服液UPLC标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述流动相含量及流速梯度变化洗脱条件为：
时间，min 流速，ml/min 流动相A，％ 流动相B，％ 0-30 0.4 6％→16％ 94％→84％ 30-40 0.4 16％→28％ 84％→72％ 40-48 0.4→0.6 28％→60％ 72％→40％ 48-55 0.6 60％ 40％ 55-56 0.6→0.4 60％→6％ 40％→94％
。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密量取柴银口服液2ml，精密加入50％甲醇，超声处理15min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述检测波长为230nm，柱温为32℃，进样量：2μl。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述流动相B为0.2％磷酸溶液。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱共有35个共有特征峰，其中第16号峰为葛根素，第8号峰为新绿原酸，第11号峰为绿原酸，第14号峰为隐绿原酸，第29号峰为黄芩苷，第30号峰为连翘苷，第34号峰为汉黄芩苷，第35号峰为黄芩素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述8号峰、11号峰、14号峰、15号峰、27号峰、33号峰为金银花中的成分；28号峰为荆芥中的成分；12号峰、23号峰、24号峰、26号峰、30号峰、31号峰为连翘中的成分；1号峰、2号峰、22号峰为桔梗中成分；29号峰、32号峰、34号峰、35号峰为黄芩中的成分；21号峰为苦杏仁中的成分。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取24批柴银口服液样品按步骤1)制备成供试品溶液，按步骤2)进行UPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到柴银口服液UPLC标准指纹图谱。
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