CN113933427A - 基于uplc的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法及质量评价方法 - Google Patents
基于uplc的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法及质量评价方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，包括如下步骤：使用超高效液相色谱‑紫外检测‑四极杆‑静电场轨道阱高分辨质谱联用的方法对小儿消积止咳口服液中的成分进行检测；并使用超高效液相色谱‑紫外检测的方法测定小儿消积止咳口服液中质量控制关键指标成分的含量，即得到基于UPLC的小儿消积止咳口服液的具有定量意义的指纹图谱。该UPLC指纹图谱方法具有检测时间短，表征的指纹图谱检测准确度和重复性好的优势。本申请所提供的小儿消积止咳口服液UPLC指纹图谱方法既能对该复方中的大量成分进行定性分析，又能对其定量分析，可适用于监控小儿消积止咳口服液的原料药，中间体和成品的质量以及生产过程的质量控制，适用范围广。
Description
技术领域
本发明属于中药检测领域，尤其涉及基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法及质量评价方法。
背景技术
小儿消积止咳口服液由山楂、槟榔、桔梗、连翘、枇杷叶、瓜蒌、枳实、葶苈子、莱菔子、蝉蜕共十味中药组成，是根据中医对小儿食积咳嗽发病机理的认识和长期临床用药经验积累以及结合古籍文献研制而复方成方制剂，具有消积止咳、清热肃肺的功效，是国家中药保护品种，国药准字为Z10970022。方中山楂、槟榔导滞消食为君药，肺与大肠相表里，治其本使得痰热无所依附，生而无源；枇杷叶、瓜蒌和连翘化痰清肺、宣散肺气为臣药，主治肺部，咳嗽渐愈；枳实、葶苈子、莱菔子和蝉蜕共为佐药，具有清痰行气、泻肺平喘、消食化积、降气化痰的作用，桔梗宣肺止咳为使药，引导诸药直达病所。
现行2020年版《中国药典》中未收载小儿消积止咳口服液指纹图谱，基于高效液相色谱法对复方制剂中的辛弗林进行定量测定。小儿消积止咳口服液的相关研究主要是在药典质量标准的基础上进一步深化，以成分含量测定的方式对小儿消积止咳口服液进行质量控制，先后建立了小儿消积止咳口服液中柚皮苷、新橙皮苷、槟榔碱、橙皮苷、辛弗林的含量测定方法，用于评价不同批次样品间成分含量的差异，从而进行批次间质量稳定性的控制。还有采用HPLC法测定小儿消积止咳口服液中连翘苷的含量，在前人的基础上对该制剂的质控方式进行了改进。
发明内容
作为本申请的一个方面，提供了一种基于超高效液相色谱UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，该方法具有检测时间短的优势。
基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，包括如下步骤：
使用超高效液相色谱-紫外检测与四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用的方法对小儿消积止咳口服液中的成分进行检测并实现定性分析；使用超高效液相色谱-紫外检测的方法测定小儿消积止咳口服液中质量控制指标性成分的含量，得到基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱；
所述超高效液相色谱-紫外检测的条件包括：采用乙腈为流动相A，甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
可选地，所述梯度洗脱过程中乙腈的体积分数随时间变化为：0-5min，0-1％乙腈；5-20min，1-7％乙腈；20-30min，7-14％乙腈；30-45min，14-18％乙腈；45-53min，18-24％乙腈；53-60min，24-30％乙腈；60-65min，30-100％乙腈。
可选地，所述甲酸水溶液中甲酸的浓度为0.005-0.5wt.％。
可选地，所述超高效液相色谱-紫外检测的条件为：采用HSS T3色谱柱，柱温10-40℃，进样量4-6μL，体积流量0.3-0.5mL/min，检测波长为245-265nm。
可选地，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。色谱柱尺寸100mm×2.1mm,1.8μm。
可选地，所述质量控制指标物质包括苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱、连翘酯苷I、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷或新橙皮苷中的至少一种。
可选地，所述质量控制指标物质选择不同类型的化合物。
可选地，所述质量控制指标物质为新绿原酸、连翘酯苷A、芥子碱、柚皮苷和新橙皮苷。
可选地，所述四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的条件为：电喷雾离子源，扫描范围m/z 100～1500，诱导碰撞解离能量为30、40、50eV，毛细管温度：350℃，辅助气流量15arb，鞘气流量35arb，S-Lens RF Level为50，正、负电离检测模式，正离子电压：3.8kV，负离子电压：3.2kV。
可选地，所述方法还包括如下步骤：取山楂、槟榔、桔梗、连翘、枇杷叶、瓜蒌、枳实、葶苈子、莱菔子和蝉蜕单味中药饮片分别按照小儿消积止咳口服液的制剂工艺制成单味药提取溶液；
再使用超高效液相色谱仪分别对各个单味药提取溶液进行检测，将各个单味药提取溶液的超高效液相色谱图上的成分峰与小儿消积止咳口服液中各个成分的色谱峰进行匹配。
可选地，所述将中药饮片制成单味药提取溶液的方法为：取单味中药饮片加水浸泡后煎煮，过滤，再将滤渣加水煎煮，过滤，合并滤液；将滤液减压浓缩，再加入乙醇，过滤，滤液回收乙醇得浓缩液；将浓缩液过滤，稀释后通过微孔滤膜过滤，得到单味药提取溶液。
可选地，单味药提取溶液的制备方法为：取单味中药饮片10g，置圆底烧瓶中加蒸馏水100mL浸泡30min，后煎煮30min，过滤，滤渣加80mL蒸馏水煎煮30min，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩至20mL，加乙醇至含醇量达60％，静置30min，滤过，滤液回收乙醇至无醇味并浓缩至20mL。浓缩液加少量蒸馏水，冷藏1h，过滤，滤液定容至100mL。精密量取2mL，置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，经0.22μm微孔滤膜，即得。
本申请中建立得到的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱，检测重复性和定量准确度好。
本申请提供了基于UPLC的小儿消积止咳口服液的质量评价方法，基于UPLC的小儿消积止咳口服液指纹图谱对小儿消积止咳口服液进行质量评价，既能对该复方中的大量成分进行定性分析，又能对其定量分析，检测他们在不同批次制剂中的稳定性，可适用于监控小儿消积止咳口服液的原料药材，中间体和成品的质量以及生产过程的质量控制，适用范围广。
可选地，所述质量评价方法还包括根据新绿原酸、连翘酯苷A、芥子碱、柚皮苷和新橙皮苷的含量对小儿消积止咳口服液的原料药质量进行评价。
可选地，根据新绿原酸评价炒山楂、桔梗、蜜枇杷叶的质量；根据芥子碱评价槟榔、炒葶苈子的质量；根据连翘酯苷A评价连翘、蜜枇杷叶的质量；根据柚皮苷评价枳实、蜜枇杷叶的质量；根据新橙皮苷评价枳实的质量。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的小儿消积止咳口服液UPLC指纹图谱方法，具有检测时间短的优势。
2)该方法表征的指纹图谱检测准确度和重复性好。
3)本申请总结整理了各原料药中主要成分的药理作用，结合十味原料药的口尝味和药典规定的功能味和UPLC指纹图谱的表征和含量，确定有机酸中新绿原酸、生物碱中芥子碱、苯乙醇苷类成分中连翘酯苷A、黄酮类成分柚皮苷和新橙皮苷作为UPLC图谱质量控制的关键指标性成分。本申请所提供的小儿消积止咳口服液UPLC指纹图谱方法，既能对该复方中的大量成分进行定性分析，又能对其定量分析，检测他们在不同批次制剂中的稳定性，可适用于监控小儿消积止咳口服液的原料药材，中间体和成品的质量以及生产工艺的质量控制，适用范围广。
4)本发明的小儿消积止咳口服液UPLC指纹图谱方法，能更完整，更全面地评价小儿消积止咳口服液的整体质量稳定性，有利于全面监控产品质量。
附图说明
图1为空白对照与小儿消积止咳口服液样品UPLC图(检测波长254nm)；
图2为小儿消积止咳口服液UPLC-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱总离子流图；其中A-负离子模式，B-正离子模式；
图3为混合对照品与小儿消积止咳口服液UPLC图；其中1：L-苯丙氨酸 2：新绿原酸3：绿原酸 4：隐绿原酸 5：芥子碱 6：连翘酯苷I 7:连翘酯苷A 8：(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷 9：柚皮苷 10：橙皮苷 11:新橙皮苷；
图4为十味原料药与小儿消积止咳口服液UPLC对比图；
图5为18批小儿消积止咳口服液的UPLC指纹图谱(检测波长254nm)。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请实施例中使用的仪器：Agilent 1290超高效液相色谱仪,G7120A高速泵,Agilent DAD-G7114B紫外检测器,Agilent-UP-G7116B柱温箱,ChemStation色谱工作站；色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 Column(100mm×2.1mm,1.8μm)；四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(ThermoscientificExactive)，KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ZNHW智能控温电热套；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；SB-1100旋转蒸发仪(Eyela日本东京理化器械株式会社)。
本申请实施例中使用的试剂：对照品柚皮苷(批号DSTDY009901)、L-苯丙氨酸(批号DSTDB013601)、芥子碱(批号DSTDJ007201)、连翘酯苷A(批号DST200314-049)、连翘酯苷I(批号DST201211-112)、(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷(批号DST200826-024)、橙皮苷(批号DSTDC003801)、新橙皮苷(批号DST200817-039)均购买于成都德思特生物技术有限公司；绿原酸(批号Y24J7K16726)、隐绿原酸(批号P11M10L88123)、新绿原酸(批号P27A10L87091,定性定量共用)、柚皮苷(批号H24N9Z75896，定量用)、新橙皮苷(批号Y28F11Y16982，定量用)、连翘酯苷A(批号Z10N9L71605，定量用)、芥子碱(P16J8F38150，定量用)均购买于上海源叶生物科技有限公司。
乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(LC/MS级，批号190284)赛默飞世尔科技(中国)有限公司；无水乙醇(药用试剂)上海易恩化学技术有限公司；娃哈哈纯净水(批号20201201)杭州娃哈哈集团有限公司。
本申请实施例中使用的原料：处方10味中药饮片与18批小儿消积止咳口服液均由山东鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。
表1小儿消积止咳口服液生产批号
混合对照品溶液的制备方法：称取25mg定性对照品，各置于25mL容量瓶中，加50％乙醇溶液定容至刻度线，配制成质量浓度为1.0mg/mL的对照品溶液，0.22μm的微孔滤膜过滤，即得单个对照品溶液。量取适量单个对照品溶液混合即得混合对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密量取小儿消积止咳口服液0.5mL，置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，经0.22μm微孔滤膜，即得。
中药饮片溶液的制备：取单味中药饮片10g，置圆底烧瓶中加蒸馏水100mL浸泡30min，后煎煮30min，过滤，滤渣加80mL蒸馏水煎煮30min，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩至20mL，加乙醇至含醇量达60％，静置30min，滤过，滤液回收乙醇至无醇味并浓缩至20mL。浓缩液加少量蒸馏水，冷藏1h，过滤，滤液定容至100mL。精密量取2mL，置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，经0.22μm微孔滤膜，即得。
采用超高效液相色谱-VWD-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对小儿消积止咳口服液供试品溶液主要化学物质组进行系统的表征和辨识，阐明其复方制剂中主要的物质基础。
色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3 Column(100mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱；以乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)为流动相梯度洗脱；柱温30℃；进样量5μL；体积流量0.4mL/min，洗脱程序见表2，VWD的检测波长254nm。
表2小儿消积止咳口服液指纹图谱梯度流动相
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，扫描范围m/z 100～1500，诱导碰撞解离能量为30、40、50eV，毛细管温度：350℃，辅助气流量15arb，鞘气流量35arb，S-Lens RF Level为50，正、负电离检测模式，正离子电压：3.8kV，负离子电压：3.2kV。扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率为70000ppm，dd-MS2分辨率为17500ppm。
测试结果如下：图1为空白对照与小儿消积止咳口服液样品UPLC图；图2为小儿消积止咳口服液UPLC-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱总离子流图；A-负离子模式，B-正离子模式；质谱分析结果如表3所示。
将制备好的各中药饮片溶液按照上述色谱条件进样，记录UPLC色谱图，与图1比较，结果如图4所示，峰匹配结果见表4。
表4十味中药与小儿消积止咳口服液UPLC峰匹配结果
实验测得十味中药提取液色谱图与小儿消积止咳口服液色谱图比较，山楂匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在内的47个峰；槟榔匹配出包括L-苯丙氨酸、芥子碱在内的38个峰；枳实匹配出包括包括L-苯丙氨酸、绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在内的42个峰；连翘匹配出包括L-苯丙氨酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、五福花苷酸在内的24个峰；桔梗匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在内的30个峰；瓜蒌匹配出包括L-苯丙氨酸在内的21个峰；炒葶苈子匹配出包括芥子碱在内的40个峰；蜜枇杷叶匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、柚皮苷、橙皮苷在内的42个峰；炒莱菔子匹配出包括L-苯丙氨酸、二芥子酸龙胆二糖苷在内的24个峰；蝉蜕匹配出L-苯丙氨酸和原儿茶醛在内的12个峰，可为小儿消积止咳口服液中成分确定和药材质量控制提供借鉴。
由表4可知，除炒莱菔子和蝉蜕其余中药提取液都含有L-苯丙氨酸；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸主要来源于山楂、桔梗、蜜枇杷叶；芥子碱主要来源于槟榔、炒葶苈子；连翘酯苷I、连翘酯苷A主要来源于连翘、蜜枇杷叶；橙皮苷、柚皮苷主要来源于枳实、蜜枇杷叶；(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷、新橙皮苷主要来源于枳实。五福花苷酸主要来源于连翘。
混合对照品与小儿消积止咳口服液UPLC图的比较结果如图3所示。由图可知柚皮苷峰面积大，峰型好，且旁边无杂峰干扰，可以选其为参照峰建立小儿消积止咳口服液的指纹图谱。
指纹图谱稳定性试验
取1号小儿消积止咳口服液制备供试品溶液,按上述色谱条件分别于0,4,8,12,16,24h测定，26个共有峰峰面积的RSD均小于5％，表明供试品在24小时内稳定性良好。各共有峰峰面积结果如表5所示。
表5小儿消积止咳口服液样品的不同时间点下指纹图谱共有峰峰面积表
指纹图谱精密度试验
取1号小儿消积止咳口服液，制备供试品溶液,按上述色谱条件连续进样6次，记录UPLC色谱图，26个共有峰峰面积的RSD均小于5％，表明本方法的精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。各共有峰峰面积结果如表6所示。
表6精密度试验中小儿消积止咳口服液指纹图谱共有峰峰面积表
指纹图谱重复性试验
取1号小儿消积止咳口服液,平行制备6份供试品溶液,按上述色谱条件测定，记录UPLC色谱图,26个共有峰峰面积的RSD均小于5％，表明本方法重复性良好。各共有峰峰面积结果如表7所示。
表7重复性试验小儿消积止咳口服液指纹图谱共有峰峰面积表
取18批小儿消积止咳口服液样品,分别制备供试品溶液,按照上述项下色谱条件依次测定，进样量为5μL，记录色谱图，将所得到的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版》软件,生成18批小儿消积止咳口服液指纹图谱如图5所示，以柚皮苷峰为参照峰，以3号样品图谱为参照图谱，经多点校正匹配色谱峰，采用平均值法生成18批小儿消积止咳口服液的对照指纹图谱R，各个样品和对照指纹图谱R间的夹角余弦相似度的计算结果见表8；以表8数据结合图5分析可知，18批小儿消积止咳口服液样品匹配出106个峰，选取26个共有峰进行匹配对照；1号和2号是19年生产批次，二者之间的相似度为0.993，与对照图谱R相似度为0.865、0.866；2020年生产的16批样品与对照指纹图R的相似度均除3号、18号样品为0.0862、0.857外，其余均不小于0.923，说明整体上小儿消积止咳口服液批次间的稳定性较好。
小儿消积止咳口服液中关键指标性成分的确定
18批次小儿消积止咳口服液指纹图谱见图5，总结整理质谱定性解析的各成分的药理作用，并代入“组分中药药性解析平台”预测各个成分的成分药性药味，结合十味原料药的口尝味和药典规定的功能味，基于各味原料药在制剂工艺下的成分归属，确定能体现该复方药味的关键指标性成分。该复方中君药山楂和槟榔消食导滞，肺与大肠相表里，治肺热使得痰热无所依附，生而无源。新绿原酸来源于君药山楂，具有兴奋胃肠平滑肌，与山楂消食健胃作用契合；芥子碱来源于君药槟榔和炒葶苈子，有抑制胃肠平滑肌，止泻和平喘的作用，与槟榔的消积降气和葶苈子的泄肺平喘相符；桔梗、蜜枇杷叶、瓜蒌和连翘化痰清热，宣散肺气为臣药，连翘酯苷A具有解热抗炎的作用，与连翘和蜜枇杷叶的清热化痰功效相符；枳实、炒葶苈子、莱菔子和蝉蜕共为佐药，具有清痰行气、泄肺平喘、降气化痰、消食化积的作用，柚皮苷来源于枳实和蜜枇杷叶，新橙皮苷来源于枳实，前者具有抗炎、松弛气管和支气管平滑肌、镇咳祛痰的作用与佐药的行气消痰的功效一致，后者能兴奋胃肠平滑肌，与佐药的消食化积功效一致。综上所述，结合UPLC指纹图谱的表征和含量，确定有机酸中新绿原酸(来源于炒山楂，桔梗，蜜枇杷叶)；生物碱中芥子碱(来源于槟榔、炒葶苈子)；苯乙醇苷类成分中连翘酯苷A(来源于连翘、蜜枇杷叶)；黄酮类成分柚皮苷(来源于枳实、蜜枇杷叶)和新橙皮苷(来源于枳实)作为UPLC图谱质量控制的关键指标性成分。
因此，后续选择新绿原酸、连翘酯苷A、芥子碱、柚皮苷和新橙皮苷等关键指标性成分进行定量分析。
指标性成分稳定性实验
取2号小儿消积止咳口服液,制备供试品溶液,按上述色谱条件分别于0,4,8,12,16,24h测定，记录UPLC色谱图，新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷色谱峰峰面积结果如表9所示，新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷峰面积在0、4、8、12、16、24h内的RSD值为1.7％，3.9％，0.67％，0.56％,0.50％，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。
指标性成分重复性实验
取2号小儿消积止咳口服液,制备6份供试品溶液,按上述色谱条件测定，记录UPLC色谱图,所得绿原酸，新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷色谱峰峰面积结果见表10，新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD值为1.8％，1.4％，1.1％，1.2％，2.9％，表明本方法重复性良好。
指标性成分线性关系考察
制备对照品溶液，精密称取新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷对照品0.00035g、0.00091g、0.00036g、0.00111g、0.00105g。
1号对照品溶液：将新绿原酸对照品加至10mL容量瓶，加入70％甲醇定容至刻度线，摇匀。精密量取1mL新绿原酸加至10mL容量瓶中，同时在该容量瓶中加入连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷对照品，精密加入70％甲醇定容至刻度线，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜过滤即得。
2号对照品溶液：将芥子碱对照品加至100mL容量瓶，加入0.1％甲酸水溶液定容至刻度线，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜过滤即得。
按上述色谱条件测定，1号对照品溶液进样1μL、2μL、4μL、6μL、8μL，2号对照品溶液稀释0、2、4、6、8、10倍，各进样5μL。以峰面积对标准品的进样质量做线性回归,并记录质量范围如表11所示。
表9四个指标成分稳定性实验的峰面积表
表10四个指标成分重复性实验峰面积表
表11四个指标成分的标准曲线和质量范围
加样回收实验
精密称取新绿原酸、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷对照品0.00042g、0.00319g、0.00972g、0.00980g，置10mL容量瓶中，精密加入70％甲醇定容至刻度线，摇匀，即得混标储备液。
精密量取4号样品0.25mL，置于10mL容量瓶中，平行9次，分别精密加入0.5mL、1.0mL、1.5mL的混标储备液，平行测定3份，精密加入70％甲醇定容至刻度线，摇匀，0.22μm的微孔滤膜过滤，每份样品进样2μL。
精密量取9号样品0.5mL，置于10mL容量瓶中，平行9次，分别精密加入1.0mL、2.0mL、3.0mL的2号对照品溶液，平行测定3份，精密加入0.1％甲酸水溶液定容至刻度线，摇匀，0.22μm的微孔滤膜过滤，每份样品进样5μL。
按上述色谱条件进样检测，计算加样回收率，结果见表12、13、14、15、16，新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的的平均回收率为100.4％、99.6％、101.2％、100.1％、100.2％，RSD值为3.0％、1.6％、4.2％、4.5％、4.2％，表明该方法下绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量计算是可靠的，表明该方法准确度良好。
表12新绿原酸加样回收数据表(n＝9)
表13芥子碱的加样回收数据表(n＝9)
表14连翘酯苷A加样回收数据表(n＝9)
表15柚皮苷加样回收数据表(n＝9)
表16新橙皮苷加样回收数据表(n＝9)
实施例2
取18个批次的样品，制备供试品溶液，并按上述色谱条件进样检测，进样量为5μL，记录峰面积，根据新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的标准曲线计算新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量，结果见表17。
表17 18个样品五种成分的含量
由表17可以看出，18批样品中新绿原酸的质量浓度在0.055848-0.080020mg/mL之间；芥子碱质量浓度在0.030588-0.073229mg/mL之间；连翘酯苷A质量浓度在0.476642-0.836119mg/mL之间；柚皮苷质量浓度在2.275798-4.527018mg/mL之间；新橙皮苷质量浓度1.854072-5.741228mg/mL之间。2019年批次的小儿消积止咳口服液中新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量平均值分别为0.077968mg/mL、0.039743mg/mL、0.521185mg/mL、2.519644mg/mL、2.005786mg/mL。2020年批次的小儿消积止咳口服液中新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量平均值分别为0.062837mg/mL、0.050026mg/mL、0.753975mg/mL、3.229653mg/mL、3.572974mg/mL。2019年批次小儿消积止咳口服液中新绿原酸平均含量大于2020年批次，芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷平均含量则小于2020年批次，其中6号、7号、11号样品5种成分含量低于平均值，12号、15号样品5种成分含量均高于平均值。
实验测得十味中药提取液色谱图与小儿消积止咳口服液色谱图比较，山楂匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在内的47个峰；槟榔匹配出包括L-苯丙氨酸、芥子碱在内的38个峰；枳实匹配出包括包括L-苯丙氨酸、绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在内的42个峰；连翘匹配出包括L-苯丙氨酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A在内的24个峰；桔梗匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸在内的30个峰；瓜蒌匹配出包括L-苯丙氨酸在内的21个峰；炒葶苈子匹配出包括L-苯丙氨酸、芥子碱在内的40个峰；蜜枇杷叶匹配出包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷I、连翘酯苷A、柚皮苷、橙皮苷在内的42个峰；炒莱菔子匹配出包括新绿原酸在内的24个峰；蝉蜕匹配出12个峰，可为小儿消积止咳口服液中成分确定和药材质量控制提供借鉴。1号和2号是19年生产批次，二者之间的相似度为0.993，与对照图谱R相似度为0.865、0.866；2020年生产的16批样品与对照指纹图R的相似度均除3号、18号样品为0.0862、0.857外，其余均不小于0.923，可说明整体上该工艺下小儿消积止咳口服液批次间稳定性较好。实验测得18批样品中新绿原酸的质量浓度0.055848-0.080020mg/mL之间；芥子碱质量浓度在0.030588-0.073229mg/mL之间；连翘酯苷A质量浓度在0.476642-0.836119mg/mL之间；柚皮苷质量浓度2.275798-4.527018mg/mL之间；新橙皮苷质量浓度在1.854072-5.741228mg/mL之间。2019年批次的小儿消积止咳口服液中新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量平均值分别为0.077968mg/mL、0.039743mg/mL、0.521185mg/mL、2.519644mg/mL、2.005786mg/mL。2020年批次的小儿消积止咳口服液中新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷的含量平均值分别为0.062837mg/mL、0.050026mg/mL、0.753975mg/mL、3.229653mg/mL、3.572974mg/mL。2019年批次小儿消积止咳口服液中新绿原酸平均含量大于2020年批次，芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷平均含量则小于2020年批次，且2020年16批小儿消积止咳口服液中5种成分批次间含量部分也存在较大差异，有的高达一倍以上，其中6号、7号、11号样品5种成分含量低于平均值，12号、15号样品5种成分含量均高于平均值，说明不同年份或是同一年份不同批次使用的原料药会对制剂造成影响，但并未对制剂批次间的稳定性造成太大影响，制剂质量依旧能得到保证。
本发明对小儿消积止咳口服液中成分进行归属，建立小儿消积止咳口服液的指纹图谱，同时遵循制剂的配伍特点以测定新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷、新橙皮苷对照品测定制剂中相应成分的含量，不仅可以通过指纹图谱峰对照从宏观层面把控质量，更能通过成分归属追溯到药材，从药材质量开始对制剂进行质量控制，全方位提高制剂质量，该实验方法的建立可为小儿消积止咳口服液的质量控制提供参考。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (10)
1.基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用超高效液相色谱-紫外检测与四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用的方法对小儿消积止咳口服液中的成分进行检测；并使用超高效液相色谱-紫外检测的方法测定小儿消积止咳口服液中控制质量属性的指标成分的含量，得到基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱；
所述超高效液相色谱-紫外检测的条件包括：采用乙腈为流动相A，甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中乙腈的体积分数随时间变化为：0-5min，0-1％乙腈；5-20min，1-7％乙腈；20-30min，7-14％乙腈；30-45min，14-18％乙腈；45-53min，18-24％乙腈；53-60min，24-30％乙腈；60-65min，30-100％乙腈；65-70min，100％-0％乙腈，70-75min，0％乙腈。
3.根据权利要求1所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述甲酸水溶液中甲酸的浓度为0.005-0.5wt.％。
4.根据权利要求1所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-紫外检测的条件为：采用HSS T3色谱柱，柱温10-40℃，进样量2-10μL，体积流量0.3-0.5mL/min，检测波长为245-265nm。
5.根据权利要求4所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，采用HSS T3色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。
6.根据权利要求1所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述控制质量属性的指标成分包括L-苯丙氨酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芥子碱、连翘酯苷I、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D吡喃葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷或新橙皮苷中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述控制质量属性的指标成分为新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷和新橙皮苷。
8.基于UPLC的小儿消积止咳口服液的质量评价方法，其特征在于，根据权利要求1-7中任一方法建立得到的基于UPLC的小儿消积止咳口服液指纹图谱对待测小儿消积止咳口服液的质量进行评价。
9.根据权利要求8所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的质量评价方法，其特征在于，所述质量评价方法还包括根据新绿原酸、芥子碱、连翘酯苷A、柚皮苷和新橙皮苷的含量对小儿消积止咳口服液及其原料药进行质量评价。
10.根据权利要求9所述的基于UPLC的小儿消积止咳口服液的质量评价方法，其特征在于，根据新绿原酸评价炒山楂、桔梗、蜜枇杷叶的质量；根据芥子碱评价槟榔、炒莱菔子和炒葶苈子的质量；根据连翘酯苷A评价连翘、蜜枇杷叶的质量；根据柚皮苷评价枳实、蜜枇杷叶的质量；根据新橙皮苷评价枳实的质量。
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