CN104447900B - 一种新化合物的制备活性与应用及质量控制 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个新化合物——2‑(4‑羟基苯基)乙基‑β‑D‑巢菜糖苷(化学结构见说明书摘要附图1)的分离和结构鉴定方法，及其活性与应用。研究发现该化合物为甜叶菊降血糖降血脂功效成分中的重要活性物质，并同时具有降血糖降血脂等多种活性。

Description

一种新化合物的制备活性与应用及质量控制

技术领域

本发明涉及甜叶菊及其有关中药资源中的一个新化合物——2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷与理化性质、化学结构表征及其活性与应用的发现。特别是涉及本化合物的结构特性、植物资源与制备方法，及其降血糖降血脂活性，以及在医药保健品及其食品中应用。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)属菊科甜菊属多年生草本植物，早期就有其治疗糖尿病的报道，发明人通过研究发现了其酚类成分为降血糖降血脂的有效物质基础，并制备得到本有效组分——甜菊酚，且通过药效实验验证了甜菊酚的降血糖、降血脂功效。通过对具有降糖药效的制备物甜菊酚进行化学成分分析研究，首次从其中分离制备得到化合物2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷(2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)，且通过在糖尿模型大鼠体内对本化合物进行PK-PD分析研究发现其与降血糖活性密切相关，具有快速降血糖药效作用特征，即为甜叶菊有效组分关键指标性成分，从而确认了本化合物的药效活性。

同时，经化学结构研究确定，到目前为止，尚未发现有对本化合物2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷结构及其活性的研究报道，本发明可为2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷应用于降血糖、降血脂的药物研发提供科学依据。

技术方案

本发明的第一个目的在于提供一个新化合物2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷及其化学结构组成与波谱特征表征；本发明第二个目的在于提供本化合物的部分植物来源；本发明的第三个目的在于提供本化合物的制备方法；本发明的第四个目的在于提供对含有2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的提取物、制备物、组合物、混合物的质量控制方法；本发明的第五个目的在于提供本化合物的活性及其应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所提供的新化合物为苯乙醇苷类化合物，化学命名为：2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷，其化学结构见说明书附图图1。

2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的理化性质及波谱学数据如下：

白色粉末，易溶于水，可溶于甲醇，为含酚羟基的苷类，FeCl3反应显阳性，molish反应显阳性。UV(MeOH-H2O)λmaxnm：220.0，279.1。高分辨质谱(HR-ESI-MS)m/s：455.1515[M+Na]+(calcd for C19H28O11Na：455.1529)，分子式C19H28O11。ESI-MSn m/s：455[M+Na]+，431[M-H]-，455(323，275)，431(299，191，179，161，149，143，131).氢谱及碳谱数据见表1。

表1化合物TYJ-10的¹H-NMR(500MHz，D₂O)和¹³C-NMR(125MHz，D₂O)数据

表1的碳氢数¹H-¹H COSY、DEPT(s，C；d，CH；t，CH₂；q，CH₃)、HSQC和HMBC谱见说明书附图图2～7。

本发明中的新化合物可由如下含有苯乙醇苷类的植物中制备而得：甜叶菊，白菊，金银花，女贞子，红景天等。

本发明中的新化合物，可经上述原料植物以乙醇、或其他醇类、稀醇、或其他有机溶剂或水提取再通过大孔吸附树脂或其他色谱方法，如硅胶色谱法、聚酰胺色谱法等，或溶剂萃取法或制备液相技术等纯化得到。

本发明中的新化合物可经化学合成或结构修饰，生物合成或生物转化等途径获得，且本发明的新化合物可经化学合成或结构修饰，生物合成或生物转化等途径生成其他具有相同或不同活性的衍生物。

本发明的新化合物优选为甜叶菊原料药制得。

本发明的新化合物制备方法包括如下步骤：

步骤1：取原料植物，溶剂回流提取；

步骤2：色谱法富集纯化；

步骤3：色谱法分离纯化

上述步骤1中，甜叶菊药材用30～95％乙醇回流提取2～3次，每次提取1～2小时，合并提取液，减压回收溶剂至干，得甜叶菊乙醇提取物。

上述步骤2中，将步骤1所得乙醇提取物加水分散溶解，以甜叶菊药材计，上样液浓度为0.08～0.25g/ml，通过大孔吸附树脂，上样量以生药量计为与0.10～0.50g/ml，吸附流速为2～9BV/h，树脂柱径高比为1∶3～10，用0～20％乙醇洗脱1～4BV进行除杂，弃去，用20～60％乙醇洗脱3～6BV，洗脱流速为2～9BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，干燥，即得甜叶菊酚类提取物。

上述步骤3中，将步骤2所得甜叶菊酚类部位加水超声萃取1～5次，每次1～2h，离心，弃去沉淀得上样液，上样液通过Diaion大孔树脂处理，水洗脱1～10BV，5％乙醇洗脱9～15BV，收集5％乙醇洗脱液，反复反相硅胶、LH-20、Toyopeal柱层析，反复制备液相分离，回收溶剂，得到白色西沙状结晶2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷。

含本发明新化合物的甜叶菊酚类有效部位，经降血糖降血脂药效实验表明，具有显著的降血糖降血脂作用，且体内药代-药效关联分析表明，本发明的新化合物具有降血糖降血脂活性，为药效物质组成成分。

实验例12-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物降血糖药效实验研究

1实验材料

1.1药物与试剂

2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物，石任兵实验室自制。

四氧嘧啶：购自SIGMA公司，批号：100956780，淡粉色粉末状。

葡萄糖：广西梧州制药，批号：100806。

盐酸二甲双胍：中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023370，批号：1107077。

1.2动物

ICR小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，由维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2006-0009

饲料购自北京科澳协力公司，每天喂食1次。

1.3仪器

血糖测试仪：美国强生稳豪型：OneTouchUltra，

血糖试纸：强生稳豪型血糖试纸OneTouchUltra，

2试验方法

造模：ICR小鼠80只，雌雄各半，初始体重18～22g，适应性喂养2天。禁食(不禁水)12h后，尾静脉注射四氧嘧啶70mg/kg，72小时后尾部取血，用血糖仪测禁食不禁水6～12h后的空腹血糖值，筛选空腹血糖＞11.1mmol/L的小鼠100只作为糖尿病模型小鼠。

分组：将糖尿病模型小鼠按血糖值随机分为4组：①2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物(960mg/kg)，②正常对照组酚类低剂量组(240mg/kg)，③模型对照组，④二甲双胍对照组200mg/kg。每组不少于10只动物，雌雄各半。按10ml/kg灌胃给药，每天1次，连续给药21天。

指标测定：(1)食量和饮水量测定：给药期间，每天称体重，每周测食量和饮水量。(2)糖耐量测定^[7]：给药第21天，禁食不禁水6～12h，取血测定血糖作为服糖前的血糖值，立即灌胃葡萄糖2.5g/kg，测定给糖后1小时，2小时及3小时的血糖值。

统计方法：对各试验组测定血糖值取均值，采用SAS软件对上述结果进行组间Student’t检验判定显著性差异。

3结果

表2试药对糖尿病小鼠血糖的影响

注：给药组与模型组比较：*P＜0.05，^**P＜0.01；

模型与对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；

表3各试药组对葡萄糖负荷小鼠糖耐量的影响

注：给药组与模型组比较：*P＜0.05，^**P＜0.01；

模型与对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

4结论：

造模后，试验各组小鼠血糖值与正常对照比较，均有显著性的升高，表明四氧嘧啶造成的糖尿病模型成功。

糖尿病小鼠给予试药治疗后，血糖值有逐步下降趋势，给药21天后，制备物组血糖值显著性差异明显，与模型对照组比较有生物学统计意义，相同实验条件下，阳性对照药二甲双胍也显示出显著性的降糖作用，表明制备物试药组对四氧嘧啶造成的胰岛β细胞损伤而引起的实验性糖尿病具有治疗作用。

糖耐量试验结果如表3，二甲双胍有效地抑制了葡萄糖灌胃后血糖的升高(P＜0.001)，制备物受试药组也均显示了一定的抑制作用，表明试药能显著抑制葡萄糖负荷糖尿病小鼠的血糖值升高，具有一定的降糖作用。

实验例2甜菊酚类提取物降血脂活性

通过高脂饲料造模后，模型组大鼠血脂各项指标甘油三酯、总胆固醇、LDL均显著高于空白对照组，说明高脂模型造模成功。

阳性对照药物吉非罗齐组显著降低血清中甘油三酯(P＜0.05)、显著升高HDL(P＜0.05)，本试验结果与本品的作用机制及文献报道结果基本一致。

受试药高、低剂量组显著降低血清中甘油三酯(P＜0.05)和LDL、显著升高HDL(P＜0.05)。表明受试药具有显著的降低血脂作用。

表4对高脂模型大鼠血脂的影响

与空白对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

经高效液相检测，该甜菊酚中2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷含量为1.53％。

实验3高糖高脂模型大鼠体内2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷PK-PD研究

采用四氧嘧啶造模高糖模型大鼠，末次给高糖模型大鼠口服2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷后不同时间点2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷血药浓度测定结果和药-时曲线见说明书附图图8。

由图8可知，2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷在体内出现4个最大血药浓度，分别是：0.25h、0.75h、1.5h、12h；血药浓度依次为：0.793μg/mL、0.929μg/mL、1.231μg/mL、57.53μg/mL。

对各实验组的各个时间点的血糖测定结果以x±s表示，采用SAS统计分析软件进行组间单因素方差分析，拟合各组大鼠降糖测量曲线见说明书附图图9，2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷降糖的药效动力学曲线见说明书附图图10。

由图9可见，与模型组相比，阳性药组(二甲双胍)在1h后具有明显的降糖作用(P＜0.01)。同样与模型组相比，1.5h后给药组也有降糖作用(P＜0.05)，其中1.5h和4h降糖效果最好，P值均小于0.05；不过在0.25h和0.75h处也表现出降糖的趋势，P值分别为0.057和0.094。

由10图可知，通过降糖作用的考察，可见E_max(最佳药效)分别出现在0.25h，0.75h，1.5h，4h，综合考虑，得出E_max 1.5h＞E_max 4h＞E_max 0.25h＞E_max 0.75h。

表7高血糖大鼠降糖的PD表征

综合2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷PK-PD分析可知，Emax分别出现在0.25h，0.75h，1.5h，4h；2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷Tmax分别出现在0.25h，0.75h，1.5h，12h；其中Emax与Tmax于0.25h，0.75h，1.5h三处时间点相吻合，表明2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷降血糖活性具有快速作用特点。

含有本发明提出的化合物结构组成的化合物应用，可以本化合物化学结构为基础，增加修饰苷元结构或增加糖苷数量，制成可具有相同活性的化合物。

含有本发明提出的化合物的制剂可根据本领域公知的方法制备。可将本发明提出的化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅料结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

含有本发明提出的化合物物的制剂，可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、透皮、皮下、皮内、腹膜、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型，如液体剂型可以是真溶液剂型、胶体溶液剂型、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。液体剂型形式可以是糖浆剂、酒剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳液等；固体剂型例如片剂、锭剂、胶囊、滴丸剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、霜剂、栓剂、散剂、膏剂等。

含有本发明提出的化合物的制剂，可以是普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统等。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子包括，赋形剂如碳酸钙、乳糖、磷酸钙、磷酸钠；稀释剂与吸收剂如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝、葡聚糖、胶态二氧化硅、阿拉伯胶、明胶、三硅酸镁、角蛋白等；湿润剂与粘合剂如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂如干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可酯、氢化植物油等；吸收促进剂如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂如滑石粉、三乙胺硬脂酸镁、三乙胺硬脂酸、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片等。

为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可酯、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄耆胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将单位给药剂型制成胶囊，可将本发明提出的化合物与上述各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬明胶胶囊或软胶囊中。也可将本发明提出的化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

为了将单位给药剂型制成口服液体制剂，如乳液、溶液、悬浮液、糖浆等，可根据需要任选添加剂如着色剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、矫味剂(如薄荷、冬青油等)、甜味剂(如蔗糖、乳糖等)或其他材料。

为了将单位给药剂型制成注射用含水或非水制剂，如溶液剂、混悬型溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体，如稀释剂、润湿剂、乳化剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂，以及常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、植物油(如橄榄油、玉米油等)、明胶、可注射用有机酯(如油酸乙酯、脂肪酸酯等)、聚氧乙烯山梨醇等。为了制备等渗注射剂，还可以添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油。

附图说明

图1是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的化学结构式图；图2是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的¹H-NMR谱图；图3是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的¹³C-NMR谱图；图4是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的DEPT谱图；图5是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的¹H-¹H COSY谱图；图6是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的HSQC谱图；图7是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷的HMBC谱图；图8是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷在糖尿病模型大鼠体内PK曲线图；图9是各组大鼠降糖测量曲线图图；图10是2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷降糖的PD表征图。

具体实施方式

实施例1：2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物

取干燥甜叶菊1Kg，剪成1cm小段，加14倍量50％乙醇回流提取3次，每次提取1小时，合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至一定体积，使溶液浓度为0.125g/mL(以生药量计)作为上样液，上样液通过7L已处理的AB-8型大孔树脂树脂柱，吸附流速3BV/h，树脂柱径高比为1∶6，上样量为0.14g/mL(以生药材量计)，水洗1倍树脂体积，除杂流速为2BV/h，25％乙醇洗脱8倍树脂体积，洗脱流速是2BV/h，收集25％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得含本发明具有降血糖降血脂活性作用的2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物。

其中2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷含量测定方法：

仪器：WatersACQUITY超高效液相色谱仪，PDA(光电二极管矩阵)检测器，Empower3工作站，自动进样；Sartorious BT 25S型1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；HH-S型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)。

精密称取2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷对照品21.06mg，置于10mL的容量瓶中，用50％甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.2106mg/mL的2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷对照品溶液。

甜叶菊药材供试品溶液：准确称取甜叶菊药材粉末1g，于250mL具塞三角瓶中，加入50％的甲醇溶液200mL，超声提取1次(功率：500W，频率：40KHz)，一次20min，过滤，浓缩，转移至100mL容量瓶中，定容，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得甜叶菊药材供试品溶液。

2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物供试品溶液：精密称取甜2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物干燥粉末约10mg，于10mL容量瓶中，加50％甲醇超声，使其完全溶解，定容，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物供试品溶液。

色谱条件：WatersACQUITY超高效液相色谱仪，PDA(光电二极管矩阵)检测器，Empower 3工作站，自动进样；色谱柱：

BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；检测波长：330nm，270nm，254nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：3μL。采集时间：60min；流动相：乙腈+0.1％甲酸(A)-0.2％甲酸(B)梯度洗脱，梯度变化如下所示：

梯度变化表

依上述色谱条件，精密吸取2-(4-羟基苯基)乙基-βD-巢菜糖苷对照品溶液和供试品溶液各3μL，分别进样。

分别精密吸2-(4-羟基苯基)乙基-βD-巢菜糖苷0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，测定色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标，以色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并分别进行线性回归，得回归方程为：Y＝325053.9519X-71.7599，r＝0.9999。

2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷制备物中2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷含量测定结果1.53％。

Claims (7)

1.一种新化合物，其特征在于，该化合物的化学名称为2-(4-羟基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷，英文名：2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside。

2.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，其理化性质及波谱学数据如下：白色粉末，易溶于水，可溶于甲醇，FeCl₃反应显阳性，molish反应显阳性，为含酚羟基的苷类；MeOH-H₂O为溶剂时紫外吸收峰为220.0nm和279.1nm；高分辨质谱下的加钠离子峰为455.1515[M+Na]⁺，按C19H28O11Na计，理论分子量为455.1529，真实分子式为C19H28O11；ESI-MSn下，加钠离子峰为455[M+Na]+，准分子离子峰为431[M-H]-，455碎片还产生323和275碎片，431碎片还产生299、191、179、161、149、143和131碎片。

3.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，将甜叶菊通过溶剂法水或醇提取制得甜叶菊提取物，水分散上样液通过大孔树脂如Diaion分离，水洗脱1～10BV，1％～90％醇洗脱9～15BV，收集醇洗脱液，再用色谱法纯化，色谱分离材料选自聚酰胺，硅胶，反相硅胶，LH-20或Toyopeal，回收洗脱液，即得。

4.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，能通过化学合成或生物途径途径获得。

5.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，能用于降血糖或降血脂药物的制备。

6.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，能加入常规辅料，按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型。

7.如权利要求1所述的新化合物，其特征在于，能作为辅料或添加剂，加至食品或饮料中，制成可接受的任意常规制品。

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