CN114106008A

CN114106008A - 一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物及其方法和应用

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Publication number: CN114106008A
Application number: CN202111417485.0A
Authority: CN
Inventors: 彭成; 曹治兴; 闫婕; 郭大乐; 李波; 郑皓元; 吴涛; 余香君; 王喜阔; 黄龙; 钟钰; 刘丁
Original assignee: Chengdu Push Bio Technology Co ltd; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu Push Bio Technology Co ltd; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN114106008B

Abstract

本发明公开了一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物及其方法和应用，其结构式如（Ⅰ）所示。该二萜醌类化合物是以干燥的丹参为原料，经乙醇回流提取、减压浓缩、大孔树脂柱层析、C18反相色谱分离等步骤提取分离得到，为一种具有新型结构及药理活性的新的药用化合物，对MV4‑11、TMD‑8、MOLM‑13和H460细胞的增殖具有明显的抑制作用，可作为在制备抗肺癌、淋巴瘤、白血病药物中的应用，并为制备新型抗肿瘤药物以及在二萜醌类物质药用研究等方面提供了可靠的依据。

Description

一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物及其方法和应用

技术领域

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从丹参中提取分离得到的新的二萜醌类药用化合物及其方法和抗肿瘤治疗应用。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，首载于《神农本草经》，被列为草部上品。丹参，味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神的功效。古有“一味丹参，功同四物”的说法：补血生血，功过归地；调血敛血，力堪芍药；逐瘀生新，性倍川芎。丹参主要通过“养血”的作用来达到活血化瘀的目的。丹参作为传统的活血化瘀中药，也是现代医学研究的主要中药之一。其主要化学成分为脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。近年研究发现，丹参在改善脑缺血再灌注损伤、血液流变学及血小板功能等方面有药理活性。随着对丹参活性成分药用价值的研究不断深入，其在肿瘤疾病方面的应用价值也被逐渐发掘。例如，张伟伟，陆茵，“丹参抗肿瘤活性成分研究新进展”（中国中药杂志，2010年2月，第35卷第3期），文献报道了丹参中含有多种抗肿瘤活性成分，在水溶性成分中主要有丹酚酸A，丹酚酸B，salvinal等，在脂溶性成分中主要有丹参酮Ñ、丹参酮Ò_A、二氢丹参酮Ñ、次丹参酮、隐丹参酮、凤眼草内脂、新丹参内脂、含氮化合物等。这些抗肿瘤活性成分在肿瘤发生发展及转移的不同阶段，起着重要作用。丹参中新的抗肿瘤活性成分的发现，对丹参的抗肿瘤临床应用具有推动作用。

基于此，本发明在对丹参 Salvia miltiorrhiza Bge活性成分进行研究时，发现并分离得到了一种新的抗肿瘤化合物，该化合物为二萜醌类化合物，药理活性研究表明其在抗肺癌、淋巴瘤、白血病方面具有一定的活性作用，为临床研究和开发新型抗肿瘤药物提供了可靠依据。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种从丹参中提取分离到的二萜醌类化合物。该化合物为一种具有新型结构及药理活性的新化合物，对丹参化学成分的系统研究以及丹参的药理作用研究提供了物质基础。

本发明的目的之二在于提供一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法。它是以干燥的丹参为原料，经乙醇回流提取、减压浓缩、大孔树脂柱层析、C18反相色谱分离等步骤，获得一种具有新型结构及药理活性的二萜醌类化合物，该方法操作步骤简单、易于控制，可确保新化合物的纯度达99%以上，且整个生产流程耗时短，适用于工业化生产。

本发明的目的之三在于提供一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物在制备抗肺癌、淋巴瘤、白血病药物中的应用，为制备抗肿瘤新药提供可靠的依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物，所述二萜醌类化合物具有（Ⅰ）所示的结构式：

所述（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物为从干燥的丹参中经提取分离得到，其化学名称为：呋喃并[2 ' '，3 ' ':5 ' '，6 ' ']萘并[1 ' '，2'':7 '，8 ']环十二烷[1 '，2':5，6]萘并[1，2-b]呋喃-10，11，21，22-四酮，6，7，8，9，19，20-六氢-1，12，17-三甲基-6-亚甲基-，(17E)-，属于二萜醌类化合物，自命名为：四氢甘西鼠尾新酮A。

所述丹参为唇形科鼠尾草植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎。

所述四氢甘西鼠尾新酮A的分子量为560，分子式为C₃₆H₃₂O₆。

一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，包括以下步骤：

A. 回流提取

以干燥的丹参为原料，粉碎后用浓度为80～90%的乙醇回流提取，得到提取液；

B. 减压浓缩

将步骤A得到的提取液经减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇后，再将浓缩提取液加水进行分散处理，得到水分散体；

C. 树脂柱层析

将步骤B得到的水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得到浓缩液；

D．C18反相色谱柱分离

将步骤C得到的浓缩液过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，得到产品收集液：

乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm；

E. 浓缩

将步骤D得到的产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，得到红色粉末物，该红色粉末物即四氢甘西鼠尾新酮A，为二萜醌类化合物，并具有（Ⅰ）所示的结构式。

在步骤A中，所述原料粉碎后的粒径为60～80目。

在步骤A中，所述回流提取时，乙醇的用量为原料重量的8～10倍。

在步骤A中，所述回流提取为3～5次，每次1小时。

在步骤B中，所述浓缩提取液按体积比1:6～1:10倍加水进行分散处理。

在步骤C中，所述AB-8大孔吸附树脂柱层析分离使用的流动相为：甲醇:水=80:20V/V。

本发明提取分离得到的红色粉末物，Molish反应呈阳性，进一步证明其为二萜醌类化合物。

在此基础上，进一步分析结果如下：

（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物的电喷雾电离质谱ESI-MS显示：m/z 561.07[M+H]⁺，583.13[M+Na]⁺，说明该化合物的分子量为560，分子式为C₃₆H₃₂O₆。经scifinder检索，未见有该化合物的相关报道，确定化合物为新二萜醌类结构，自命名为四氢甘西鼠尾新酮A。

¹H-NMR和¹³C-NMR数据见下表1。

由此，通过¹H-NMR、¹³C-NMR以及DEPT135º和核磁二维HSQC，HMBC，H-HCOSY，NOESY等分析技术手段，进一步确定了该化合物为：四氢甘西鼠尾新酮A（新二萜醌类化合物），结构式如（Ⅰ）所示。

同时，药理实验证明，本发明提取分离得到的结构式如（Ⅰ）所示的二萜醌类化合物，具有一定的抗肺癌、淋巴瘤、白血病活性，可应用于抗肺癌、抗淋巴瘤、抗白血病药物的制备。

本发明的有益技术效果在于：

1、本发明提供的新二萜醌类化合物为从干燥的丹参中提取分离而得到，该化合物具有（Ⅰ）所示的结构式，其结构确定，并明确了其药理活性与丹参有效成分的关系，具有一定的抗肿瘤活性，尤其对肺癌、淋巴瘤、白血病具有较好的抑制作用。

2、本发明通过从丹参药材中提取分离得到的二萜醌类化合物，为一种新的药用化合物，抗肿瘤动物实验表明，其对肺癌、淋巴瘤、白血病具有较好的抑制效果，对于临床研究和制备新型抗肿瘤药物具有很好的参考价值。

3、本发明以唇形科鼠尾草植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎为原料，经乙醇回流提取、减压浓缩、大孔树脂柱层析、C18反相色谱分离等工艺步骤得到二萜醌类化合物，该方法操作步骤简单易于控制，可确保四氢甘西鼠尾新酮A的纯度达99%以上，且整个生产流程耗时短，适用于工业化生产。

4、本发明为首次报道了四氢甘西鼠尾新酮A的结构，并根据核磁二维等相关数据确定了其相对构型，为一种新型的二萜醌类化合物，自命名为四氢甘西鼠尾新酮A。化合物抗肿瘤实验表明，四氢甘西鼠尾新酮A对MV4-11、TMD-8、MOLM-13和H460细胞的增殖抑制效果较IC50、HEPG-2等其他细胞显著，基于此，对于新型抗肿瘤药物的研制，能够作为一种潜体结构进行开发利用，同时为大规模组织培养生产二萜醌类物质、在二萜醌类物质药用研究等方面也提供了可靠的依据。

附图说明

图1为本发明丹参原料中四氢甘西鼠尾新酮A的色谱图。

检测方法：乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm，流速1.0ml/min，C18分析柱（4.6*250mm，5µm）。

图2为本发明提取分离得到的四氢甘西鼠尾新酮A的色谱图。

检测方法：甲醇：0.1%磷酸水= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm，流速1.0ml/min，检测波长270nm，C18分析柱（4.6*250mm，5µm）。

图3为本发明四氢甘西鼠尾新酮A对MV4-11、TMD-8、MOLM-13、H460、HEPG-2和HELA细胞的生长抑制曲线（作用72h）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术人员根据上述本发明内容作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物，该化合物为红色粉末，分子量为分子量为560，分子式为C₃₆H₃₂O₆，具有（Ⅰ）所示的结构式：

所述二萜醌类化合物为从丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎提取分离得到，具体工艺步骤如下：

A. 回流提取

由于80～90%的乙醇对二萜醌类化合物的溶解性最好，提取率高，采用回流提取能够进一步缩短提取时间和提高提取效率。

B. 减压浓缩

由于提取液中含大量的乙醇试剂，体积大，不利于下一步的工艺处理。浓缩至无醇既可进一步减少提取液体积，也能使回收的乙醇试剂进行再次利用。但减压浓缩后的提取浓缩液中还含有少量的乙醇试剂，不利于二萜醌类化合物的富集。为消除试剂的影响，将浓缩提取液加水稀释分散处理可提高大孔树脂的富集效率。

C. 树脂柱层析

树脂柱层析相较于其他如硅胶柱层析的主要优点在于操作简单、成本低廉、乙醇试剂相对环保等，通过树脂柱层析将丹参提取浓缩液中二萜醌类化合物富集于树脂上，通过水洗除去大极性的杂质，再通过乙醇水将二萜醌类化合物洗脱出，达到了初次分离的作用。

D．C18反相色谱柱分离

将步骤C得到的浓缩液过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离，得到产品收集液：乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm；

树脂柱层析分离出的含二萜醌类化合物的浓缩液中，有大量的结构相似、极性差异小的化合物，利用以C18填料的高压制备分离系统，采用乙腈-水流动相体系，可以有效除去杂质，收集四氢甘西鼠尾新酮A的制备液，即可分离出纯度达99%以上的四氢甘西鼠尾新酮A目标成分。

E. 浓缩

由于四氢甘西鼠尾新酮A水溶性较差，产品收集液中的有机试剂回收后，四氢甘西鼠尾新酮A的溶解度降低，从浓缩液中会析出，过滤出固体，有利于缩短浓缩时间。析出固体含水，通过真空干燥除水，即可得到符合要求（含水率低于2%）的四氢甘西鼠尾新酮A粉末物。

实施例2

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）10kg，粉碎至60目的粒径，加入8倍重量、浓度为80wt%的乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:6倍加水进行分散处理得水分散体20L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液5L；

D、将浓缩液过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离（乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm），按如图1所示的相对应的色谱峰收集产品；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物6g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约5天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.31%。

实施例3

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）20kg，粉碎至70目的粒径，加入8.5倍重量、浓度为85wt%的乙醇回流提取4次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:7倍加水进行分散处理得水分散体36L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液12L；

D、将浓缩液过滤，滤液用C18反相色谱填料高压制备分离（乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm），收集如图1所示的相对应的色谱峰产品；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物13g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约6天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.08%。

实施例4

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）30kg，粉碎至80目的粒径，加入9倍重量、浓度为90wt%的乙醇回流提取5次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:8倍加水进行分散处理得水分散体58L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液23L；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物20g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约7天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.16%。

实施例5

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）50kg，粉碎至60目的粒径，加入8倍重量、浓度为80wt%的乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:6倍加水进行分散处理得水分散体90L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液30L；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物32g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约7天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.21%。

实施例6

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）50kg，粉碎至70目的粒径，加入10倍重量、浓度为85wt%的乙醇回流提取5次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:10倍加水进行分散处理得水分散体120L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含二萜醌类成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液50L；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物38g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约9天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.34%。

实施例7

A、取干燥的丹参（丹参 Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根及根茎）50kg，粉碎至80目的粒径，加入9倍重量、浓度为90wt%的乙醇回流提取4次，每次1小时，合并提取液；

B、将提取液减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至无醇，再将浓缩提取液按体积比1:9倍加水进行分散处理得水分散体100L；

C、将水分散体湿法上样，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离（甲醇:水=80:20 V/V为流动相），收集含总黄酮成分的层析液，再减压浓缩至无醇，得浓缩液40L；

E、将产品收集液50℃减压到-0.08～-0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，即得红色粉末产物35g，为具有（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物，色谱图如图2所示。

整个生产流程用时约8天；

通过更换流动相组分（A：甲醇 B：0.1%V/V磷酸水，A:B= 78:22 V/V为流动相；检测波长270nm），利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得该产物的纯度为99.19%。

实施例8 化合物抗肿瘤实验

任意选取上述实施例4提取分离得到的具有（Ⅰ）所示结构式的红色粉末化合物（即下列实验中所称的四氢甘西鼠尾新酮A）进行下述实验：

（1）实验材料与仪器

细胞：人肝癌细胞HEPG-2、人宫颈癌细胞HELA、人大细胞肺癌细胞 H460、人弥漫大B淋巴瘤细胞TMD-8、人急性髓系白血病细胞MOLM-13、人髓性单核细胞白血病细胞 MV-4-11，上述细胞株均购买于美国标准生物品收藏中心（American type culture collection，ACTT）。

药物与试剂：四氢甘西鼠尾新酮A（纯度＞99.0%，自制）；DMSO溶液进行溶解，配制成的母液浓度20mg/ml，现配现用，低温避光保存；试验时按需要用含血清的完全培养基稀释。IMDM 培养基（Gibco 公司，批号 8121034），DMEM 培养基（Corning公司，批号30720021），DMEM/F-12 培养基（Gibco 公司，批号 8121062），RPMI1640 培养基（Gibco 公司，批号 8121249），胎牛血清（呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司，批号P1844335），青霉素-链霉素溶液（碧云天生物技术有限公司，批号 020221210413），DMSO（Sigma 公司，批号 SHBK2750），PBS（北京中彬金桥生物技术有限公司，批号 170809），胰蛋白酶（Biofroxx公司，批号 EZ6789B168。配制方法：以新鲜配制的PBS溶解配制，浓度为0.25%，0.22μm滤器过滤，-4℃保存备用），甲基噻唑蓝（MTT，Biofroxx公司，批号EZ6789A155，配制方法：称取MTT0.5g，溶于100 mL 蒸馏水中，使终浓度为5mg/mL，用移液枪混合吹打均匀，锡箔纸包裹于4℃避光保存），其他常规化学试剂均为国产分析纯。

仪器：CO₂培养箱（日本sanyo公司，型号 MCO-15AC），超净工作台（日本sanyo公司，型号 MCV-13161FT），倒置显微镜（德国ZEISS公司，型号 MKG9823），细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司），全自动酶标仪（美国赛默飞世尔公司，型号 MK 3），电子分析天平（最大量程210g，十万分之一，德国Sartorius公司，型号BP-211D），台式低速离心机（Cence湘仪公司，型号TDZ5-W5），Milli-Q超纯水制造系统（Millipore公司，型号 F3CA69756）

（2）实验方法

MV4-11和MOLM-13细胞悬浮培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的IMDM和RPMI1640完全培养基中，在37℃，5%CO2的培养箱内培养，传代和收获，取对数生长期细胞进行试验。TMD-8细胞悬浮培养于含20%胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基中，在37℃，5%CO₂的培养箱内培养，传代和收获，取对数生长期细胞进行试验。收集对数生长期的MV4-11细胞和MOLM-13细胞，加入完全培养基将其重悬成浓度为2～8×105个/mL的细胞悬液，按每孔100 μL接种于96孔板内。加入含9号化合物0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/ml的完全培养基，每孔100μL。设置含0.1% DMSO完全培养基的细胞为溶剂对照组，每个药物浓度设置3个复孔，置于37℃，5% CO₂条件下孵育培养。72h后，在每个孔内加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育2～4h，然后每个孔内加入含20%的SDS各80μL并孵育过夜，第二天，用酶标仪在570nm处测定吸光度（optical density，OD）。按如下公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100 %。

H460、HELA和HEPG-2细胞细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM或RPMI1640 完全培养基中，在37℃，5%CO2的培养箱内培养，细胞经0.25 %胰蛋白酶消化分散传代和收获，取对数生长期细胞进行试验。收集对数生长期的H460、HELA和HEPG-2细胞，消化，离心，加入完全培养基重悬成浓度为2×104个/mL 的细胞悬液，每孔100 μL细胞悬液将细胞接种于96孔板内，并置于培养箱中孵育过夜。次日，待细胞贴壁后，弃上清，加入含9号化合物0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/ml的完全培养基，每孔100 μL。设置含0.1%DMSO完全培养基的细胞为溶剂对照组，每个药物浓度设置3个复孔，置于37℃，5%CO₂条件下孵育培养。72h后，在每个孔内加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育2～4h，然后每个孔内加入含20%的SDS各80μL 并孵育过夜，第二天，用酶标仪在570nm处测定OD值。计算细胞抑制率（同上）。

采用生物统计软件Graphpad Prism拟合药物对不同细胞的生长抑制曲线，计算半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）值。

（3）实验结果

下表2可见，四氢甘西鼠尾新酮A对MV4-11、TMD-8、MOLM-13和H460细胞的增殖抑制效果较其他细胞显著，IC50分别为为1.239ug/ml、1.388ug/ml、1.9 ug/ml 和1.131 ug/ml；对HEPG-2人肝癌细胞体外抑制活性较弱；对HELA人宫颈癌细胞株在测量范围内未发现抑制活性。

由图3可知，随着四氢甘西鼠尾新酮A化合物浓度的增加，对MV4-11、TMD-8、MOLM-13和H460细胞的抑制率越高，提示该化合物对MV4-11、TMD-8、MOLM-13和H460细胞的抑制作用呈剂量依赖性。

从以上抗肿瘤实验结果可以看出：四氢甘西鼠尾新酮A对MV4-11、TMD-8、MOLM-13和H460细胞的增殖具有明显的抑制作用，因此，本发明提取分离得到的结构式如（Ⅰ）所示的二萜醌类化合物可应用于抗肺癌、淋巴瘤、白血病药物的制备。

Claims

1.一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物，其特征在于：所述二萜醌类化合物具有（Ⅰ）所示的结构式：

其化学名称为：呋喃并[2 ' '，3 ' ':5 ' '，6 ' ']萘并[1 ' '，2'':7 '，8 ']环十二烷[1 '，2':5，6]萘并[1，2-b]呋喃-10，11，21，22-四酮，6，7，8，9，19，20-六氢-1，12，17-三甲基-6-亚甲基-，(17E)-，自命名为：四氢甘西鼠尾新酮A。

2.如权利要求1所述的一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物，其特征在于：所述（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物为红色粉末物，Molish反应呈阳性。

3.如权利要求1所述的一种从丹参中提取分离的二萜醌类化合物，其特征在于：所述（Ⅰ）所示的结构式的二萜醌类化合物的电喷雾电离质谱ESI-MS显示：m/z 561.07[M+H]⁺，583.13[M+Na]⁺，该化合物的分子量为560，分子式为C₃₆H₃₂O₆。

4.一种制备如权利要求1所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A. 回流提取

B. 减压浓缩

C. 树脂柱层析

D．C18反相色谱柱分离

乙腈:水= 62:38 V/V为流动相；检测波长270nm；

E. 浓缩

将步骤D得到的产品收集液50℃减压到-0.08 ~ -0.09MPa浓缩至固体析出，过滤，固体磨粉后45℃真空干燥至含水率低于2%，得到红色粉末物，即（Ⅰ）所示结构式的二萜醌类化合物。

5.如权利要求4所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，其特征在于：在步骤A中，所述原料粉碎后的粒径为60～80目。

6.如权利要求4所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，其特征在于：在步骤A中，所述回流提取时，乙醇的用量为原料重量的8～10倍，回流提取为3～5次，每次1小时。

7.如权利要求4所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，其特征在于：在步骤B中，所述浓缩提取液按体积比1:6～1:10倍加水进行分散处理。

8.如权利要求4所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物的方法，其特征在于：在步骤C中，所述AB-8大孔吸附树脂柱层析分离使用的流动相为：甲醇:水=80:20 V/V。

9.一种如权利要求1所述的从丹参中提取分离的二萜醌类化合物在制备抗肺癌、淋巴瘤、白血病药物中的应用。