CN101434591B - 一种丹参丹酚酸b的制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丹参丹酚酸B制备方法和检测方法，其特征在于丹参药材乙醇提取后，经大孔吸附树脂法、聚酰胺吸附树脂法和有机溶剂萃取法，得到丹参丹酚酸B；其中制备得到丹参丹酚酸B采用科学的梯度流动相的检测分析方法，得到的丹参丹酚酸B含量大于等于90％且小于100％；本发明的制备工艺提取率好、纯化高、单易于工业化生产；本发明的检测分析方法，分离度好，分析结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种丹参丹酚酸B的制备方法和检测分析方法，进一步涉及一种含量大于等于90％的丹参丹酚酸B的制备方法和检测分析方法。
背景技术
丹参中含有的成分包括：多糖、蛋白质和鞣质等无效成分，水溶性和脂溶性等有效成分，有效成份中脂溶性成分主要有丹参酮类和罗列酮类，丹参酮类化合物多属于二萜化合物，其中大部分是二萜醌类化合物，丹参的水溶性成分均具有酚酸性结构，统称为丹酚酸，包括丹参素、丹酚酸A、B、C、D、E、H、I、J、异丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸等，丹酚酸多数是由丹参素[D-(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸]与咖啡酸、其衍生物或二聚体缩合而成。丹参丹酚酸B是丹参水溶性有效成分之一，又称为丹参酸B，也属于酚酸类化合物，是由3分子的丹参素和1分子咖啡酸缩合而成。丹酚酸B作为丹参中的主要水溶性成分，在治疗心血管疾病、慢性肝炎、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等方面发挥着重要作用。因此，从丹参药材得到丹参丹酚酸B工艺，一直是很多医药科研人员想要解决的事情，主要原因：(1)丹参的成分复杂，含有大量的无效成分，纯化工艺中无效成分对丹参丹酚酸B具有很大的裹协作用，导致丹酚酸B提取率降低；(2)现有技术中采用的检测分析方法中，没有采用科学的方法，将与丹参丹酚酸B性质相近的物质分离开，导致高效液相色谱中，丹酚酸B峰与很多成分重叠，没有达到很好的纯度；(3)丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，其他丹酚酸也有类似结构，丹酚酸类化合物含有多个酚羟基、酯键以及羟基，这些结构在受热情况下容易发生分解、氧化以及脱羧、脱羟基等反应，给提取分离带来一定的困难，丹酚酸类成分结构、性质相近，对其纯化分离具有一定的难度。
综上所述，若将丹参丹酚酸B开发成成药制剂，必须采用科学的分析技术为标准，开发出一种适合工业化生产，收率好、纯度高的生产工艺，得到丹参丹酚酸B作为物质基础。
文献“高纯度丹酚酸B的制备工艺研究(时珍国医国药2005年第16卷第六期，476-478，王凤美等)”采用水提取、乙酸乙酯萃取、大孔树脂纯化的方法，得到91.8％的丹参丹酚酸B；文献“大孔树脂分离丹参酚酸B的筛选研究(时珍国医国药2006年第17卷第6期，973-974，叶勇)”，采用醇提、大孔吸附树脂的方法，得到丹参丹酚酸B；上述文献采用的分析方法是：等度流动相的检测分析方法，这种分析方法的科学性有待商榷，其丹参丹酚酸B的含量不是真正物质的含量，并且上述方提取率不高，需要进一步研究；中国专利CN1488627A“丹酚酸B镁盐的制备方法”采用乙醇提取、大孔吸附树脂法、聚酰胺层析法，得到含量大于90％的丹参丹酚酸B，该方法虽然在能够得到一定含量的丹参丹酚酸B，但其含量的检测方法没有明确，结果可信度有待研究。
发明内容
基于上述原因，我们的科研人员通过创造性的劳动，对丹参的成分进行深入的研究，发现将乙醇提取法、大孔吸附树脂法、聚酰胺层析法、有机溶剂萃取法进行有机的结合，形成整体的提取纯化丹参中丹酚酸B的工艺方法，该方法的提取率可以达到2％以上，丹参丹酚酸B采用梯度流动相洗脱的检测方法含量大于90％，充分说明本发明的工艺方法具有很好的现实意义。
本发明通过以下技术方案实现的。
一种丹参丹酚酸B的制备方法：丹参药材乙醇提取后，经大孔吸附树脂法、聚酰胺吸附树脂法和有机溶剂萃取法，得到丹参丹酚酸B。
其中方法为：
取丹参药材，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，水洗弃去，10-20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，30％-50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，50％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液调节PH值1-4，用有机溶剂萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得。
其中大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8。
其中有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇中的一种。
制备方法得到丹参丹酚酸B为活性成分制备的药物制剂，其中制剂为单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、口服液、微丸剂、滴丸剂、水针剂、输液剂、粉针剂。
其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、口服液、微丸剂、滴丸剂的单位剂量为1-5000mg。
其中水针剂、输液剂、粉针剂单位剂量为1-1500mg。
一种丹参丹酚酸B的检测分析方法：
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；
0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；
对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸B对照品到容量瓶中，加乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
供试品溶液的配制：精密称取或量取样品到容量瓶中，加乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，即得。
实验结果：见表1
表1标准有效成分丹参丹酚酸B检测结果
| 组别 | 丹参丹酚酸B含量％ | 丹参丹酚酸B保留时间min |
| 12345678910111213141516171819 | 90.0197.195.999.894.998.394.994.296.397.095.391.999.196.496.993.294.995.293.9 | 41.841.241.541.941.741.042.041.741.441.941.341.841.741.141.341.140.941.341.9 |
| 20 | 92.7 | 42.0 |
实验结论：通过上述实验表明，本申请制备方法采用梯度流动相检测分析方法，丹参丹酚酸B的含量大于等于90％且小于100。
一、不同制备方法得到的丹酚酸B含量比较实验
实验药物：
方案1：按照文献“高纯度丹酚酸B的制备工艺研究(时珍国医国药2005年第16卷第六期，476-478，王凤美等)”方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案2：按照文献“大孔树脂分离丹参酚酸B的筛选研究(时珍国医国药2006年第17卷第6期，973-974，叶勇)”方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案3：按照中国专利CN1488627A实施例方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案4：本发明制备方法得到丹参丹酚酸B；
实验方法，取上述不同方法得到丹参丹酚酸B，按照本发明的检测分析方法，对丹参丹酚酸B进行含量检测，实验结果见表2：
表2不同丹参丹酚酸B含量结果
| 组别 | 检测批次 | 丹参丹酚酸B平均含量 |
| 方案1方案2方案3 | 555 | 74.271.782.9 |
| 方案4 | 10 | 97.1 |
实验结论：通过上述实验表明，采用科学的检测分析方法，即采用梯度流动相的方法，将与丹参丹酚酸B性质接近的丹参酚酸性物质很好的分离，可以更加准确的确定丹参丹酚酸B的含量，上述实验结果表明，本发明的工艺组合更具有科学性。
二、不同检测分析方法对不同方法得到的丹参丹酚酸B的含量检测
实验药物：
见本发明实验方法一。
实验方法：取本发明实验方法一得到同一批次的丹参丹酚酸B，按照按照文献“高纯度丹酚酸B的制备工艺研究(时珍国医国药2005年第16卷第六期，476-478，王凤美等)”的检测分析方法进行含量检测，实验结果见表3：
表3不同检测方法测定丹参丹酚酸B
| 组别 | 检测批次 | 丹参丹酚酸B平均含量 |
| 方案1方案2方案3 | 555 | 91.790.392.7 |
| 方案4 | 10 | 99.9 |
实验结果：通过上述实验表明，采用现有技术的检测分析方法，得到的丹参丹酚酸B的含量显著提高，充分说明采用等度流动相的检测方法，没有将与丹参丹酚酸B性质相近的丹参酚酸类物质很好的分离，造成高效液相色谱图中丹参丹酚酸B峰面积不准确，误差较大，具体的就是将不是丹参丹酚酸B的物质也计算成丹参丹酚酸B，因此，采用本发明的工艺方法制备丹参丹酚酸B含量显著提高，充分说明该方法更具有科学性。
三、提取率的研究
取相同产地、相同批次的丹参药材，按照下述文献和专利的工艺方法，制备得到丹参丹酚酸B，按照本发明检测分析方法，计算丹参丹酚酸B的含量，计算提取率，实验结果见表4：
提取丹参丹酚酸B的方法：
方案1：按照文献“高纯度丹酚酸B的制备工艺研究(时珍国医国药2005年第16卷第六期，476-478，王凤美等)”方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案2：按照文献“大孔树脂分离丹参酚酸B的筛选研究(时珍国医国药2006年第17卷第6期，973-974，叶勇)”方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案3：按照中国专利CN1488627A实施例方法制备得到的丹参丹酚酸B；
方案4：本发明制备方法得到丹参丹酚酸B；
表4提取率比较实验
| 组别 | 丹参药材的重量kg | 丹参丹酚酸B提取物重量g | 丹参丹酚酸B含量％ | 提取率％ |
| 方案1方案2方案3 | 111 | 9.78.910.3 | 74.772.083.1 | 0.730.640.86 |
| 方案4 | 1 | 31.7 | 96.9 | 3.07 |
实验结论：通过提取率实验表明，本发明工艺方法提取率比现有文献的提取率提高5倍左右，节约大量资源，本发明工艺方法提取率高、丹酚酸B含量高，工艺简单适合工业化生产。
四、药理实验
本发明丹参丹酚酸B对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤具有很好的保护作用；对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤具有很好的保护作用，对大鼠肝纤维化具有很好的保护作用，对小鼠肺纤维化具有很好的保护作用；本发明丹参丹酚酸B具有抗肿瘤作用；本发明丹参丹酚酸B具有很好的延缓衰老的作用；等等；
四、实施例
实施例1
取丹参药材1kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-100大孔吸附树脂柱，水洗弃去，10％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，50％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值1，用有机溶剂正丁醇萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 32.7g。
实施例2
取丹参药材10kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-100A大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值4，用有机溶剂乙酸丙酯萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B314.4g。
实施例3
取丹参药材1kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过1400，水洗弃去，15％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，60％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值2.5，用有机溶剂乙酸乙酯萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 34.9g。
实施例4
取丹参药材1kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-300大孔吸附树脂柱，水洗弃去， 10％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，35％乙醇洗脱，弃去洗脱液，55％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值1.5，用有机溶剂异丙醇萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 29.33g。
实施例5
取丹参药材100kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-400大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，45％乙醇洗脱，弃去洗脱液，65％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值2，用有机溶剂乙酸丁酯萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B3.19kg。
实施例6
取丹参药材10kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-400A大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，65％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值3，用有机溶剂乙酸乙酯萃取，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 327.9g。
实施例7
取丹参药材1kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过HPD-450大孔吸附树脂柱，水洗弃去，15％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值3.5，用有机溶剂乙酸丙酯萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 30.1g。
实施例8
取丹参药材500g，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过D101大孔吸附树脂柱，水洗弃去，10％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，45％乙醇洗脱，弃去洗脱液，55％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值1.5，用有机溶剂乙酸丁酯萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 16.7g。
实施例9
取丹参药材100g，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过1300-I大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，65％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值4，用有机溶剂正丁醇萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 3.11g。
实施例10
取丹参药材1000kg，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过AB-8大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液用调节PH值2.5，用有机溶剂异丙醇萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得本发明丹参丹酚酸B 34.9kg。
将上述实施例1-10制备得到丹参丹酚酸B进行检测分析，丹参丹酚酸B的含量大于等于90％且小于100％。
将上述实施例1-10得到的丹参丹酚酸B制备成药物制剂；
药物制剂包括单位剂量的片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、口服液、微丸剂、滴丸剂、水针剂、输液剂、粉针剂；其中片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、口服液、微丸剂、滴丸剂的单位剂量为1-5000mg；其中水针剂、输液剂、粉针剂单位剂量为1-1500mg。
上述实施例1-10得到的丹参丹酚酸B在制备治疗心脑血管疾病、肝损伤、肝纤维化、肺纤维化、肿瘤、衰老药物中的应用。
注：本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。
Claims (4)
1.一种丹参丹酚酸B的制备方法，其特征为：
取丹参药材，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，水洗弃去，10-20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，30％-50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，50％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液调节pH值1-4，用有机溶剂萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得丹参丹酚酸B。
2.根据权利要求1所述的一种丹参丹酚酸B的制备方法，其中大孔树脂为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、或AB-8。
3.根据权利要求1或2所述的一种丹参丹酚酸B的制备方法，其中有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇中的一种。
4.一种丹参丹酚酸B的制备方法，其特征为：
取丹参药材，乙醇提取，滤过，合并滤液，浓缩，离心，取上清液过非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，水洗弃去，10-20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，30％-50％乙醇洗脱，弃去洗脱液，50％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液调节pH值1-4，用有机溶剂萃取，有机相浓缩，真空干燥，即得丹参丹酚酸B，所得到的丹参丹酚酸B采用如下检测分析方法：
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；
0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；
对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸B对照品到容量瓶中，加乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
供试品溶液的配制：精密称取或量取样品到容量瓶中，加乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，即得。
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Addressee: Beijing Bencao Tianyuan Pharmaceutical Research Institute Document name: Notification to Pay the Fees |
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Addressee: Sun Dejie Document name: payment instructions |
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Addressee: Sun Dejie Document name: payment instructions |
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Addressee: Sun Dejie Document name: Notice of Termination of Patent Rights |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121114 |