CN102266547A - 一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物的制备方法及其产品，属于生姜深加工技术领域。它是以新鲜生姜为原料，精选、清洗后，冷冻干燥，然后粉碎，首先进行乙醇溶液浸提、浓缩制得生姜醇提物；然后再经乙酸乙酯/水相分离，收集乙酸乙酯层并浓缩干燥制得乙酸乙酯提取物；最后以硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯/正己烷体系等梯度洗脱，收集30％-70％乙酸乙酯洗脱液洗脱组分，真空浓缩，氮吹仪挥干残留溶剂，包装、密封即为本发明所制备的生姜提取物。该提取物可显著诱导鼠肝癌Hepa1c1c7细胞中醌氧化还原酶(QR)的活性，显示了良好的上调II相解毒酶的潜力，可用于开发低毒高效的癌症预防剂、功能食品等产品。

Description

一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物的制备方法及其产品

一、技术领域

本发明涉及一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物的制备方法及其产品，属于生姜深加工技术领域，可用于开发低毒高效的癌症预防剂、功能食品等产品。

二、背景技术

随着社会生产的发展和工业化进程的加快，人们在日常生活和生产中接触各种化学毒物的机会越来越多。据统计，全世界已登记的化学物达3000多万种，常用的有8-10万种。这些外源化学物主要包括：工业污染物、环境污染物、食品中有害成分(天然毒素及添加剂)、农用化学物及放射性核素等，它们可以通过不同途径(接触、呼吸道、消化道等)进入机体，诱发癌症等恶性疾病，严重威胁着人类健康。

外源物质对机体的损伤特别是DNA的损伤是诱发癌症的关键因素。外源物质在体内的解毒(生物转化)主要涉及I相代谢和II相代谢。I相代谢主要是在细胞色素P450酶系的作用下，使外源物质发生氧化、还原及水解反应；II相代谢则是通过结合反应将内源极性小分子物质与I相反应的活化产物或外来物质结合，增加其水溶性，使其易于排出体外。由于I相代谢过程往往会激活某些致癌物前体，而II相代谢则可使高活性的致癌物失活，起真正解毒作用。II相代谢是在一系列II相代谢酶的催化下进行的，如醌氧化还原酶(QR)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、血红素氧合酶(HO-1)等，它们可以清除体内多种致癌物质及亲电子试剂，保护生物功能蛋白及DNA免受破坏，因此，又被称为II相解毒酶。很明显，诱导这些酶的表达，可以有效地抵御外来致癌剂对机体的伤害，这已被认为是许多植物化学成分发挥癌症预防作用的重要机制。

目前，很多植物化学成分如莱菔硫烷、茶多酚、睡茄交酯类化合物等已被证实均可以显著诱导II相解毒酶的活性，这些发现为筛选和开发潜在有效的肿瘤化学预防剂提供了理论基础和应用前景。

生姜是一种传统的药食兼用植物，我国生姜资源丰富，种植历史悠久，然而由于我国生姜加工艺水平不高，尤其是生姜深加工技术比较落后，导致目前生姜加工品种少、技术附加值低、综合利用率低。尽管生姜及其提取物显示了抗炎、镇吐、抗肿瘤和抗菌等广泛的生物学活性，然而目前尚没有公开与生姜通过调节II相代谢酶发挥癌症预防作用相关的报道及专利。

三、发明内容

本发明的目的在于提供了一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物的制备方法及其产品。本发明是通过以下技术方案实现的：

①以新鲜生姜为原料，精选后，清洗去除泥土，冷冻干燥，然后粉碎，在60-80℃下用60-95％的乙醇溶液对上述姜粉浸提3-6h，过滤后取浸提液真空旋转浓缩；生姜醇提物溶于300-500mL水中，然后加入等体积乙酸乙酯分层，收集乙酸乙酯层并浓缩干燥制得生姜乙酸乙酯提取物；

②生姜乙酸乙酯提取物与3倍质量的硅胶混合，干法上样，采用硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯/正己烷(0-100％乙酸乙酯，v/v)体系为洗脱剂等梯度洗脱，收集30％-70％乙酸乙酯洗脱液洗脱组分，真空旋转浓缩，氮吹仪挥干残留溶剂，包装、密封即为本发明所制备的生姜提取物。

本发明的有益效果：

生姜及其提取物具有广泛的药理学活性，这些在专利《生姜提取物制剂及在防治胆石症中的作用-200510023861.2》、《生姜天然抗氧化剂的生产方法-200610042238.6》、《生姜中单萜苷类化合物及其抗菌用途和药物组合物-200710067009.4》等被报道。然而，目前尚没有与生姜通过调节II相解毒酶发挥癌症预防作用相关的报道及专利。本发明制备的生姜提取物具有良好的II相解毒酶诱导能力，以广泛采用的II相解毒酶细胞评价体系-Hepa1c1c7为模型(体外实验)，该提取物能显著诱导醌氧化还原酶、谷胱甘肽硫转移酶等典型II相解毒酶的表达；同时，体内实验结果表明该提取物可明显提高苯并芘染毒大鼠肝脏中醌氧化还原酶和谷胱甘肽硫转移酶的表达，起到明显的解毒作用。该发明制备工艺简单、适于工业化大规模生产，相比传统生姜加工利用方法，产品附加值，可用于开发低毒高效的癌症预防剂、功能食品等。

四、附图说明

图1是生姜提取物对Hepa1c1c7细胞的相对QR诱导活性及细胞毒性

五、具体实施方式

实施例1：生姜提取物的制备

2.21kg新鲜生姜(Zingiber officinale Rosc.)于2009年4月购于当地超市。精选后，清洗去泥，冷冻干燥，然后粉碎，在70℃下用95％的乙醇溶液(1∶10，m/v)对上述姜粉浸提4h，过滤后取浸提液真空旋转浓缩。生姜醇提物溶于500mL水中，然后加入等体积乙酸乙酯，静置分层，收集乙酸乙酯层，反复萃取5-6次，合并萃取液并浓缩干燥；取10g生姜乙酸乙酯提取物与3倍质量的硅胶混合，用5.5cm×60cm的玻璃柱进行硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯/正己烷(0-100％乙酸乙酯，v/v)体系进行等梯度洗脱，收集30％-70％乙酸乙酯洗脱液洗脱组分，真空旋转浓缩，氮吹仪挥干残留溶剂，包装、密封，得3.87g本所明所述生姜提取物产品。

实施例2：生姜提取物诱导II相酶活性测定

2.1原理：醌氧化还原酶(QR)是一种重要的II相解毒酶。它具有易与其它II相酶协同作用、对诱导子响应性好以及测量方便等优点，被广泛用作测定II相酶的生物标记物；而鼠肝癌Hepa 1c1c7细胞株中QR表达稳定、重现性好，使得该细胞株逐渐成为一种快速可靠的QR酶活性测定模型。

2.2细胞株：小鼠肝癌hepa1c1c7细胞，购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

2.3测定方法：将融合度达80％的Hepa1c1c7细胞以5000/孔接种于96孔板，37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h。然后每孔添加200μL含生姜提取物的新鲜培养液，培养48h。弃去培养液，每孔加入50μL的0.08％(w/v)的洋皂黄地苷和2mMEDTA溶液，振荡30min。然后每孔加入200μL反应溶液。反应液配方为：0.1g牛血清，3.75mL的1M Tri-HCl，1mL1.5％吐温-20，1mL 0.75mM的FAD，1mL 150mM葡萄糖6-磷酸，90μL 50mM NADP，300U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，45mg MTT，用去离子水定容至140mL。最后，每孔加入0.2μL甲萘醌(50mM溶于乙醇)，立即测定490nm处10分钟内吸光值的动力学曲线。同时，取相同96孔重复板，采用MTT法测定在610nm处吸光值，计算细胞存活率。

2.4醌还原酶活性的计算公式：

QR诱导活性＝(样品OD₄₉₀-空白OD₄₉₀)/(对照OD₄₉₀-空白OD₄₉₀)；

相对QR诱导活性＝样品QR诱导活性/对照组QR诱导活性；

细胞存活率＝(样品OD₆₁₀-空白OD₆₁₀)/(对照OD₆₁₀-空白OD₆₁₀)×100％；

样品的QR诱导活性用CD值来衡量，其定义为：使相对QR诱导活性值为2时对应的样品浓度；细胞存活率＞50％且相对QR诱导活性≥2时样品具有诱导活性。

2.5实验结论

该生姜提取物具有显著的诱导醌氧化还原酶(QR)能力，其两倍诱导浓度(CD值)为7.8±0.3μg/mL(图1)，表明该化合物具有较强的II相解毒酶诱导潜力。

Claims (5)

1.一种具有对外源致癌剂有解毒作用的生姜提取物，其特征在于：

该生姜提取物中起解毒作用的活性成份主要包括6-姜酚、1-脱氢-[6]-姜二酮、6-姜烯酚、1-脱氢-[10]-姜二酮、6-脱氢姜烯酚和六氢姜黄素。

2.根据权利要求1所述之提取物，主要来源于生姜鲜品或干品。

3.根据权利要求1或2所述的生姜提取物的制备方法其特征在于由以下步骤组成：

①以新鲜生姜为原料，精选后，清洗去除泥土，冷冻干燥，然后粉碎，在60-80℃下用60-95％的乙醇溶液对上述姜粉浸提3-6h，过滤后取浸提液真空旋转浓缩；生姜醇提物溶于300-500mL水中，然后加入等体积乙酸乙酯分层，收集乙酸乙酯层并浓缩干燥制得生姜乙酸乙酯提取物；

②生姜乙酸乙酯提取物与3倍质量的硅胶混合，干法上样，采用硅胶柱色谱法分离，以乙酸乙酯/正己烷(0-100％乙酸乙酯，v/v)体系为洗脱剂等梯度洗脱，收集30％-70％乙酸乙酯洗脱液洗脱组分，真空旋转浓缩，氮吹仪挥干残留溶剂，包装、密封即为本发明所制备的生姜提取物。

4.根据权利要求1所述的生姜提取物缓解外源致癌剂毒性的用途，其特征在于：该生姜提取物具有显著的诱导II相解毒酶的能力，以醌氧化还原酶(QR)为生物标志物，其两倍诱导浓度值(CD值)小于10μg/mL。

5.根据权利要求4所述的生姜提取物缓解外源致癌剂毒性的用途，其特征在于：所述II相解毒酶对于外源性致癌剂具有解毒功能。

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