CN110229054A - 一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法及其在中药材根腐病防治中的应用 - Google Patents

一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法及其在中药材根腐病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，包括以下步骤：（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，烘干，冷却后粉碎，过筛，得到核桃青皮粉；（2）乙醚提取：将核桃青皮粉加入乙醚中回流提取，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；（3）核桃青皮的粗提取：得到核桃青皮粗提物；（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物。本发明回收废弃的核桃青皮为原料，提取方法操作简单，变废为宝，提高了其利用率，且制备的核桃青皮胡桃醌提取物纯度高，对防治中药材根腐病具有明显的效果，而且药效持续时间长。

Description

一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法及其在中药材根腐病 防治中的应用
技术领域
本发明属于核桃青皮提取物技术领域，具体涉及一种核桃青皮提取物的制备方法及其在中药材根腐病防治中的应用。
背景技术
商洛，地处秦岭南麓，具有丰富的中药材资源，尤其是丹参、连翘、桔梗、黄芩和五味子这五种药材因其地道、质优、量大，在全国享有盛名，被称为“五大商药”。但是研究表明，根腐病是中药材生长过程中一类常见的毁灭性土传病害，素有“植物癌症”之称。特别是在以根茎类入药的多年生中草药上，往往积重难返、危害严重、难以根治，而且涉及药材种类广、致病菌繁杂，可直接导致药材产量和品质的大幅降低，造成重大经济损失。因此，合理防控中草药根腐病，是保障其可持续发展的重要环节，这已经成为制约“五大商药”乃至商洛中药产业发展的瓶颈。
核桃青皮，又名青龙衣，为胡桃科植物胡桃楸(Juglans Mandshurica M.)和胡桃(Juglans Regial L.)的未成熟果实的绿色外果皮，主产于东北、山东、河北等地，自古以来一直作为民间常用中药材，辛、苦、涩、平，有清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢等广泛的药用价值。商洛作为全国著名的核桃之乡，素有“中国核桃之都”之美誉，年产量为全国第一。与此同时，每年都有大量的核桃青皮被倒入田野、河流或者田地，这在一定程度上不仅污染了河流也带来了严重的环境问题。如果能从这些废弃物中提取出防治中药材病虫害的活性成分，不但能够解决大量的核桃青皮堆积问题，实现“变废为宝”，而且也能有效防治中草药病虫害，一举两得。中国专利CN 105994389 A中公开了一种核桃青皮提取物的制备方法及其在烟草蚜虫病害中的应用，对烟蚜的杀虫率高，但是，该方法得到的核桃青皮提取物对于中药材根腐病防治的效果差。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种核桃青皮提取物的制备方法，得到的核桃青皮提取物在中药材根腐病防治中的具有较好的效果。
一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，然后在80-90℃下烘干3-4h，冷却后粉碎，过60-100目筛，得到核桃青皮粉；
（2）乙醚提取：按照核桃青皮粉和乙醚的体积比为1：（2-5），将核桃青皮粉加入乙醚中，在2-5℃下回流提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；
（3）核桃青皮的粗提取：将乙醚浓缩液用2（w/v）%的氢氧化钠水溶液萃取，萃取液用2（v/v）%盐酸溶液中和至中性，再用乙醚萃取，得到的乙醚萃取液用水洗涤至中性，挥干乙醚，按照体积比1:30加入氯仿的乙醇水溶液中，在30℃下超声回流提取30min，过滤，重复超声提取3次，合并滤液，滤液在45℃下旋转蒸发浓缩，然后将浓缩物真空冷冻干燥得到核桃青皮粗提物；
（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物。
优选地，所述氯仿的乙醇水溶液中，氯仿的体积浓度为70-90%，乙醇的体积浓度为1%。
优选地，所述超声的功率为180-220W。
优选地，步骤（4）中所述采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化具体包括以下步骤：
（41）大孔吸附树脂用3-5（w/v）% NaOH溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；然后用3-5（v/v）% HCl溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；最后用95%乙醇浸泡，蒸馏水冲洗至洗涤液中不含乙醇，所述浸泡的时间均为2-4小时，且保持一致，得到的大孔吸附树脂备用；
（42）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行静态吸附与解吸；
（43）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行动态吸附与解吸；
（44）将步骤（43）得到的洗脱液在30-40℃下减压浓缩，冷冻干燥，得到核桃青皮粗品；
（45）葡聚糖凝胶柱层层析法纯化：葡聚糖凝胶采用湿法装柱，柱子规格为Φ15-20 mm×50-80 cm，装填高度为40-50cm，用无水甲醇平衡后，取步骤（44）得到的样品10-30mg进行干法上样，以20（v/v）%的甲醇碱性水溶液为洗脱液进行洗脱，共收集100管，前30管流速为1.0 mL/min，31-70管流速为0.5 mL/min，71-100管流速为2.0 mL/min，收集洗脱液，在35-40℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥，即得到所述核桃青皮胡桃醌提取物；其中，所述甲醇碱性水溶液为用氨水调节pH为7.5-8.3的溶液。
优选地，步骤（42）中静态吸附过程为：取步骤（41）得到的大孔吸附树脂2-3g，加入20-30mL、浓度为25-30 mg/mL的胡桃醌标品甲醇溶液中，密封，37℃恒温水浴振荡2-4 h，取上清液在紫外可见分管光度计上测吸光度，按照式（1）计算吸附率：
E（%）=[(C0-C1)/C0]×100% (1)
式（1）中：E为吸附率，%；C0为吸附前胡桃醌溶液的起始浓度，mg/mL；C1为吸附平衡时胡桃醌溶液的质量浓度，mg/mL。
优选地，步骤（42）中静态解吸过程为：将吸附后的大孔吸附树脂过滤，用蒸馏水清洗2-3次，加入20-25 mL、95%的乙醇溶液，在相同的水浴振荡条件下振荡解吸2-4 h，取上清液在紫外可见分光光度计上测吸光度，按照式（2）计算吸附率：
D（%）=[C2V2/(C0-C1)V1]×100% (2)
式中：D为解吸率，%；C2为解析后溶液中胡桃醌的质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL。
优选地，步骤（43）动态吸附与解吸过程具体为：将步骤（41）得到的大孔吸附树脂采用湿法装柱，装入2 cm×60 cm的层析柱中，用蒸馏水平衡后，将浓度为0.05-0.1 mg/mL的核桃青皮粗提物水溶液按照流速1.3-1.5 mL/min匀速上样并收集流出液，每10 mL一管，上样量为50 mL；然后将吸附过的大孔吸附树脂进行解吸，用蒸馏水洗涤至无核桃青皮粗提物样品残留，按照流速1-1.5 mL/min用80（v/v）%的乙醇水溶液进行洗脱，每10 mL为一管，收集洗脱液，备用。
优选地，所述大孔树脂的型号为HPD-100，所述葡聚糖凝胶的型号为Sephadex LH-20。
所述核桃青皮胡桃醌提取物在中药材根腐病防治中的应用。
优选地，所述应用具体为：在中药材定植期选择晴朗天气将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入土壤，或者在根腐病害发生期，将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入中药材根部土壤，每亩用量为150-300 g，每周固定时间施入1次，连续施3-5周。
本发明的优点：
本发明回收废弃的核桃青皮为原料，提取方法操作简单，将核桃青皮变废为宝，提高了其利用率，且制备的核桃青皮胡桃醌提取物纯度高，对防治中药材根腐病病害具有明显的效果，而且药效持续时间长，37天时仍具有良好的效果。
附图说明
图1 胡桃醌标品HPLC色谱图；
图2 核桃青皮粗提物HPLC色谱图；
图3 核桃青皮胡桃醌提取物HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明实施例采用的大孔树脂的型号为HPD-100，葡聚糖凝胶的型号为SephadexLH-20。
实施例1
一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，然后在80℃下烘干4h，冷却后粉碎，过60目筛，得到核桃青皮粉；
（2）乙醚提取：按照核桃青皮粉和乙醚的体积比为1：2，将核桃青皮粉加入乙醚中，在2℃下回流提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；
（3）核桃青皮的粗提取：将乙醚浓缩液用2（w/v）%的氢氧化钠水溶液萃取，萃取液用2（v/v）%盐酸溶液中和至中性，再用乙醚萃取，得到的乙醚萃取液用水洗涤至中性，挥干乙醚，按照体积比1:30加入氯仿的乙醇水溶液中，在30℃下超声回流提取30min，超声的功率为180W，过滤，重复超声提取3次，合并滤液，滤液在45℃下旋转蒸发浓缩，然后将浓缩物真空冷冻干燥得到核桃青皮粗提物；所述氯仿的乙醇水溶液中，氯仿的体积浓度为70%，乙醇的体积浓度为1%；
（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物，具体如下：
（41）大孔吸附树脂用3（w/v）% NaOH溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；然后用3（v/v）%HCl溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；最后用95%乙醇浸泡，蒸馏水冲洗至洗涤液中不含乙醇，所述浸泡的时间均为2小时，得到的大孔吸附树脂备用；
（42）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行静态吸附与解吸：
静态吸附过程为：取步骤（41）得到的大孔吸附树脂2g，加入20mL、浓度为25 mg/mL的胡桃醌标品甲醇溶液中，密封，37℃恒温水浴振荡2h，取上清液在紫外可见分管光度计上测吸光度，按照式（1）计算吸附率：
E（%）=[(C0-C1)/C0]×100% (1)
式（1）中：E为吸附率，%；C0为吸附前胡桃醌溶液的起始浓度，mg/mL；C1为吸附平衡时胡桃醌溶液的质量浓度，mg/mL；
静态解吸过程为：将吸附后的大孔吸附树脂过滤，用蒸馏水清洗2次，加入20 mL、95%的乙醇溶液，在相同的水浴振荡条件下振荡解吸2h，取上清液在紫外可见分光光度计上测吸光度，按照式（2）计算吸附率：
D（%）=[C2V2/(C0-C1)V1]×100% (2)
式中：D为解吸率，%；C2为解析后溶液中胡桃醌的质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL；
（43）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行动态吸附与解吸：将步骤（41）得到的大孔吸附树脂采用湿法装柱，装入2 cm×60 cm的层析柱中，用蒸馏水平衡后，将浓度为0.05 mg/mL的核桃青皮粗提物水溶液按照流速1.3 mL/min匀速上样并收集流出液，每10mL一管，上样量为50 mL；然后将吸附过的大孔吸附树脂进行解吸，用蒸馏水洗涤至无核桃青皮粗提物样品残留，按照流速1 mL/min用80（v/v）%的乙醇水溶液进行洗脱，每10 mL为一管，收集洗脱液，备用；
（44）将步骤（43）得到的洗脱液在30℃下减压浓缩，冷冻干燥，得到核桃青皮粗品；
（45）葡聚糖凝胶柱层层析法纯化：葡聚糖凝胶采用湿法装柱，柱子规格为Φ15 mm×50cm，装填高度为40cm，用无水甲醇平衡后，取步骤（44）得到的样品10mg进行干法上样，以20（v/v）%的甲醇碱性水溶液为洗脱液进行洗脱，共收集100管，前30管流速为1.0 mL/min，31-70管流速为0.5 mL/min，71-100管流速为2.0 mL/min，收集洗脱液，在35℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥，即得到所述核桃青皮胡桃醌提取物；其中，所述甲醇碱性水溶液为用氨水调节pH为7.5的溶液。
实施例2
一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，然后在90℃下烘干3h，冷却后粉碎，过100目筛，得到核桃青皮粉；
（2）乙醚提取：按照核桃青皮粉和乙醚的体积比为1：5，将核桃青皮粉加入乙醚中，在5℃下回流提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；
（3）核桃青皮的粗提取：将乙醚浓缩液用2（w/v）%的氢氧化钠水溶液萃取，萃取液用2（v/v）%盐酸溶液中和至中性，再用乙醚萃取，得到的乙醚萃取液用水洗涤至中性，挥干乙醚，按照体积比1:30加入氯仿的乙醇水溶液中，在30℃下超声回流提取30min，超声的功率为220W，过滤，重复超声提取3次，合并滤液，滤液在45℃下旋转蒸发浓缩，然后将浓缩物真空冷冻干燥得到核桃青皮粗提物；所述氯仿的乙醇水溶液中，氯仿的体积浓度为90%，乙醇的体积浓度为1%；
（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物，具体如下：
（41）大孔吸附树脂用5（w/v）%NaOH溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；然后用5（v/v）%HCl溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；最后用95%乙醇浸泡，蒸馏水冲洗至洗涤液中不含乙醇，所述浸泡的时间均为4小时，得到的大孔吸附树脂备用；
（42）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行静态吸附与解吸：
静态吸附过程为：取步骤（41）得到的大孔吸附树脂3g，加入30mL、浓度为30 mg/mL的胡桃醌标品甲醇溶液中，密封，37℃恒温水浴振荡4 h，取上清液在紫外可见分管光度计上测吸光度，按照式（1）计算吸附率：
E（%）=[(C0-C1)/C0]×100% (1)
式（1）中：E为吸附率，%；C0为吸附前胡桃醌溶液的起始浓度，mg/mL；C1为吸附平衡时胡桃醌溶液的质量浓度，mg/mL；
静态解吸过程为：将吸附后的大孔吸附树脂过滤，用蒸馏水清洗3次，加入25 mL、95%的乙醇溶液，在相同的水浴振荡条件下振荡解吸4 h，取上清液在紫外可见分光光度计上测吸光度，按照式（2）计算吸附率：
D（%）=[C2V2/(C0-C1)V1]×100% (2)
式中：D为解吸率，%；C2为解析后溶液中胡桃醌的质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL；
（43）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行动态吸附与解吸：将步骤（41）得到的大孔吸附树脂采用湿法装柱，装入2 cm×60 cm的层析柱中，用蒸馏水平衡后，将浓度为0.1 mg/mL的核桃青皮粗提物水溶液按照流速1.5 mL/min匀速上样并收集流出液，每10 mL一管，上样量为50 mL；然后将吸附过的大孔吸附树脂进行解吸，用蒸馏水洗涤至无核桃青皮粗提物样品残留，按照流速1.5 mL/min用80（v/v）%的乙醇水溶液进行洗脱，每10 mL为一管，收集洗脱液，备用；
（44）将步骤（43）得到的洗脱液在40℃下减压浓缩，冷冻干燥，得到核桃青皮粗品；
（45）葡聚糖凝胶柱层层析法纯化：葡聚糖凝胶采用湿法装柱，柱子规格为Φ15 mm×50cm，装填高度为40cm，用无水甲醇平衡后，取步骤（44）得到的样品30mg进行干法上样，以20（v/v）%的甲醇碱性水溶液为洗脱液进行洗脱，共收集100管，前30管流速为1.0 mL/min，31-70管流速为0.5 mL/min，71-100管流速为2.0 mL/min，收集洗脱液，在40℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥，即得到所述核桃青皮胡桃醌提取物；其中，所述甲醇碱性水溶液为用氨水调节pH为8.3的溶液。
实施例3
一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，然后在85℃下烘干3.5h，冷却后粉碎，过80目筛，得到核桃青皮粉；
（2）乙醚提取：按照核桃青皮粉和乙醚的体积比为1：3，将核桃青皮粉加入乙醚中，在3℃下回流提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；
（3）核桃青皮的粗提取：将乙醚浓缩液用2（w/v）%的氢氧化钠水溶液萃取，萃取液用2（v/v）%盐酸溶液中和至中性，再用乙醚萃取，得到的乙醚萃取液用水洗涤至中性，挥干乙醚，按照体积比1:30加入氯仿的乙醇水溶液中，在30℃下超声回流提取30min，超声的功率为200W，过滤，重复超声提取3次，合并滤液，滤液在45℃下旋转蒸发浓缩，然后将浓缩物真空冷冻干燥得到核桃青皮粗提物；所述氯仿的乙醇水溶液中，氯仿的体积浓度为80%，乙醇的体积浓度为1%；
（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物，具体同实施例2。
对比例1
步骤（2）中回流提取温度为室温20℃，其他同实施例3。
对比例2
步骤（2）中回流提取温度为45℃，其他同实施例3。
对比例3
专利CN105994389 A中实施例1的提取物。
一. 纯度检测
采用高效液相色谱法测定实施例3中步骤（3）中核桃青皮粗提物和（4）中核桃青皮胡桃醌提取物的含量，测定条件为：色谱条件：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水-磷酸（53∶47：0.2）；流速：0.8 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30℃，测定结果见图2、图3。
从图1中可以看出，胡桃醌标品色谱峰在22.0～22.5 min出现，而步骤（3）核桃青皮粗提物中色谱图出峰较多（图2），主要是含有其他成分的缘故，纯化后步骤（4）的核桃青皮胡桃醌提取物纯度较高，但仍有极少量杂质峰（图3）。由外标法计算出氯仿提取物中的胡桃醌含量为92%，纯化后的纯度达到96%以上。
采用相同方法检测实施例1和实施例2的核桃青皮胡桃醌提取物的纯度，其纯度都大于96%；对比例1的核桃青皮胡桃醌提取物的纯度为79%，对比例2的核桃青皮胡桃醌提取物的纯度为72%。
二. 对根腐病病菌生长抑制率、孢子萌发抑制率的研究
将实施例3得到的核桃青皮胡桃醌提取物溶于蒸馏水，形成核桃青皮胡桃醌提取物溶液，作用于中药材根腐病病菌，采用生长速率法和悬滴法测定其对腐皮镰刀菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，结果见表1、表2。
表1 对中药材根腐病病原菌腐皮镰刀菌生长的影响
从表1可以看出，本发明提供的核桃青皮胡桃醌提取物对桔梗、丹参、黄芪和黄芩根腐病病菌均有较好的生长抑制作用，并且呈现出明显的量效关系。而对比例1-3对桔梗、丹参、黄芪和黄芩根腐病病菌的抑制作用明显弱于本发明。
表2 对中药材根腐病病原菌孢子萌发的影响
从表2可以看出，本发明提供的提取物对桔梗、丹参、黄芪和黄芩根腐病病原菌孢子萌发均有不同程度的抑制作用，明显优于对比例1-3。
三. 对中药材根腐病的防治效果
1. 在中药材定植期选择晴朗天气将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入土壤，每亩用量为150 g，每周固定时间施入1次，连续施3周，结果见表3，药效持续时间单位为天。
表3对中药材根腐病的防治效果（1）
2. 在根腐病害发生期，将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入中药材根部土壤，每亩用量为150g，每周固定时间施入1次，连续施3周，结果见表4，药效持续时间单位为天。
表4对中药材根腐病的防治效果（2）
由表3和表4可知，本发明提供的核桃青皮胡桃醌提取物对中药材中根腐病的防治具有较好的效果。

Claims (10)

1.一种核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）预处理：取核桃青皮，通风晾干，切忌颜色变黑，然后在80-90℃下烘干3-4h，冷却后粉碎，过60-100目筛，得到核桃青皮粉；
（2）乙醚提取：按照核桃青皮粉和乙醚的体积比为1：（2-5），将核桃青皮粉加入乙醚中，在2-5℃下回流提取2h，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓缩得到乙醚浓缩液；
（3）核桃青皮的粗提取：将乙醚浓缩液用2（w/v）%的氢氧化钠水溶液萃取，萃取液用2（v/v）%盐酸溶液中和至中性，再用乙醚萃取，得到的乙醚萃取液用水洗涤至中性，挥干乙醚，按照体积比1:30加入氯仿的乙醇水溶液中，在30℃下超声回流提取30min，过滤，重复超声提取3次，合并滤液，滤液在45℃下旋转蒸发浓缩，然后将浓缩物真空冷冻干燥得到核桃青皮粗提物；
（4）将得到的核桃青皮粗提物采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化，得到核桃青皮胡桃醌提取物。
2.根据权利要求1所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：所述氯仿的乙醇水溶液中，氯仿的体积浓度为70-90%，乙醇的体积浓度为1%。
3.根据权利要求1所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：所述超声的功率为180-220W。
4.根据权利要求1所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述采用大孔吸附树脂柱层析法联合葡聚糖凝胶柱层析法予以分离纯化具体包括以下步骤：
（41）大孔吸附树脂用3-5（w/v）% NaOH溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；然后用3-5（v/v）% HCl溶液浸泡，用蒸馏水冲洗至中性；最后用95%乙醇浸泡，蒸馏水冲洗至洗涤液中不含乙醇，所述浸泡的时间均为2-4小时，且保持一致，得到的大孔吸附树脂备用；
（42）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行静态吸附与解吸；
（43）采用大孔吸附树脂对所述核桃青皮粗提物进行动态吸附与解吸；
（44）将步骤（43）得到的洗脱液在30-40℃下减压浓缩，冷冻干燥，得到核桃青皮粗品；
（45）葡聚糖凝胶柱层层析法纯化：葡聚糖凝胶采用湿法装柱，柱子规格为Φ15-20 mm×50-80 cm，装填高度为40-50cm，用无水甲醇平衡后，取步骤（44）得到的样品10-30mg进行干法上样，以20（v/v）%的甲醇碱性水溶液为洗脱液进行洗脱，共收集100管，前30管流速为1.0 mL/min，31-70管流速为0.5 mL/min，71-100管流速为2.0 mL/min，收集洗脱液，在35-40℃条件下减压浓缩，真空冷冻干燥，即得到所述核桃青皮胡桃醌提取物；其中，所述甲醇碱性水溶液为用氨水调节pH为7.5-8.3的溶液。
5.根据权利要求4所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：步骤（42）中静态吸附过程为：取步骤（41）得到的大孔吸附树脂2-3g，加入20-30mL、浓度为25-30 mg/mL的胡桃醌标品甲醇溶液中，密封，37℃恒温水浴振荡2-4 h，取上清液在紫外可见分管光度计上测吸光度，按照式（1）计算吸附率：
E（%）=[(C0-C1)/C0]×100% (1)
式（1）中：E为吸附率，%；C0为吸附前胡桃醌溶液的起始浓度，mg/mL；C1为吸附平衡时胡桃醌溶液的质量浓度，mg/mL。
6.根据权利要求5所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：步骤（42）中静态解吸过程为：将吸附后的大孔吸附树脂过滤，用蒸馏水清洗2-3次，加入20-25 mL、95%的乙醇溶液，在相同的水浴振荡条件下振荡解吸2-4 h，取上清液在紫外可见分光光度计上测吸光度，按照式（2）计算吸附率：
D（%）=[C2V2/(C0-C1)V1]×100% (2)
式中：D为解吸率，%；C2为解析后溶液中胡桃醌的质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL。
7.根据权利要求6所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：步骤（43）动态吸附与解吸过程具体为：将步骤（41）得到的大孔吸附树脂采用湿法装柱，装入2 cm×60 cm的层析柱中，用蒸馏水平衡后，将浓度为0.05-0.1 mg/mL的核桃青皮粗提物水溶液按照流速1.3-1.5 mL/min匀速上样并收集流出液，每10 mL一管，上样量为50 mL；然后将吸附过的大孔吸附树脂进行解吸，用蒸馏水洗涤至无核桃青皮粗提物样品残留，按照流速1-1.5 mL/min用80（v/v）%的乙醇水溶液进行洗脱，每10 mL为一管，收集洗脱液，备用。
8.根据权利要求4所述核桃青皮胡桃醌提取物的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂的型号为HPD-100，所述葡聚糖凝胶的型号为Sephadex LH-20。
9.核桃青皮胡桃醌提取物在中药材根腐病防治中的应用，其特征在于：所述核桃青皮胡桃醌提取物为通过权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述应用具体为：在中药材定植期选择晴朗天气将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入土壤，或者在根腐病害发生期，将所述核桃青皮胡桃醌提取物施入中药材根部土壤，每亩用量为150-300 g，每周固定时间施入1次，连续施3-5周。
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