CN117510677A - 一种新的灵芝β-葡聚糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的灵芝β‑葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：称取灵芝β‑葡聚糖，加水90‑100℃下充分搅拌1‑3小时，采用高压纳米均质机均质处理，离心去除残渣，即得到灵芝β‑葡聚糖均质液，冷冻干燥即得到新的灵芝β‑葡聚糖。本发明所制备得到新的灵芝β‑葡聚糖的溶解度明显提高，免疫活性明显增强。
Description
技术领域
本发明属于灵芝多糖加工领域，具体的说涉及一种新的灵芝β-葡聚糖及其制备方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是传统的药用真菌，因富含多糖、三萜、蛋白等功能成分而呈现出多种生物活性。灵芝多糖是其主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂等功效。目前已经从不同来源的灵芝中分离出200多种灵芝多糖，主要包括葡聚糖和由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等组成的杂多糖等等。葡聚糖是由葡萄糖单体聚合而成的一类高分子多糖，可分为α型和β型。常见的α-葡聚糖主要存在于淀粉、糊精和糖原，β-葡聚糖主要存在于微生物和食药用菌等真菌中。
灵芝β-葡聚糖是一类以β-1,3-糖苷键连接为主链、β-1,6-糖苷键为支链的葡聚糖，作为灵芝中主要的活性多糖之一，在免疫调节、抗肿瘤、抗炎等方面活性显著，然而该多糖因分子量较大且具有特殊的三股螺旋构象，经提取干燥后其溶解性较差，影响了对灵芝β-葡聚糖的进一步开发利用。
因此需要寻找能有效提升灵芝β-葡聚糖溶解度和活性的方法，为灵芝β-葡聚糖的研究和应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的灵芝β-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：
称取灵芝β-葡聚糖(灵芝β-葡聚糖是采用专利CN105175575B实施例1方法制备所得)，加水90-100℃下充分搅拌1-3小时，采用高压纳米均质机均质处理，离心去除残渣，即得到灵芝β-葡聚糖均质液，冷冻干燥即得到新的灵芝β-葡聚糖；
所述加水搅拌的料液比为1：150～300(g:mL)；
所述高压纳米均质机均质处理条件为50HZ、400-1200bar。
具体的说，本发明提供的一种新的灵芝β-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：将灵芝β-葡聚糖按照料液比1：150～300(g:mL)加水100℃充分搅拌2小时，采用高压纳米均质机均质处理50HZ、400-1200bar，离心去除残渣，即得到灵芝β-葡聚糖均质液，冷冻干燥即得到新的灵芝β-葡聚糖。
优选的，高压纳米均质机参数如下：50HZ；400bar、800bar、1200bar；均质2次。
优选的，将均质后灵芝β-葡聚糖溶液离心处理，离心机参数如下：9000rpm、时间20分钟。去除沉淀，得到灵芝β-葡聚糖均质液。
本发明还提供了上述方法制备得到的新的灵芝β-葡聚糖，所制备得到新的灵芝β-葡聚糖的溶解度明显提高，免疫活性明显增强。
采用本发明提供的制备方法可以解决现有技术中灵芝β-葡聚糖溶解性低的问题，进而提高其在后续研究、开发和应用中的可行性，提高其应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例1～3及对比例灵芝β-葡聚糖HPSEC洗脱曲线对比。
图2实施例1～3及对比例灵芝β-葡聚糖免疫活性对比
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
新的灵芝β-葡聚糖的制备，步骤如下：
称取灵芝β-葡聚糖(采用专利CN105175575B实施例1方法制备所得)，按照料液比为1：200(g:mL)加水，100℃下充分搅拌2小时后，采用GA-10H型高压纳米均质机(朗灏孚纳米科技(上海)有限公司)均质处理，高压纳米均质机参数如下：50HZ；400bar，均质2次。将均质后灵芝β-葡聚糖溶液离心处理，离心机参数如下：9000rpm、时间20分钟。去除沉淀，得到灵芝β-葡聚糖均质溶液，冷冻干燥得到新的灵芝β-葡聚糖，用干燥质量除以均质溶液体积计算溶解度。
实施例2
采用实施例1中的方法制备，区别在于，高压纳米均质机参数，压力为800bar。
步骤如下：
称取灵芝β-葡聚糖(采用专利CN105175575B实施例1方法制备所得)，料液比为1：200(g:mL)加水，100℃下充分搅拌2小时后，采用高压纳米均质机均质处理，高压纳米均质机参数如下：50HZ；800bar，均质2次。将均质后灵芝β-葡聚糖溶液离心处理，离心机参数如下：9000rpm、时间20分钟。去除沉淀，得到灵芝β-葡聚糖均质溶液，冷冻干燥得到新的灵芝β-葡聚糖，用干燥质量除以均质溶液体积计算溶解度。
实施例3
采用实施例1中的方法制备，区别在于，高压纳米均质机参数，压力为1200bar。
步骤如下：
称取灵芝β-葡聚糖(采用专利CN105175575B实施例1方法制备所得)，料液比为1：200(g:mL)加水，100℃下充分搅拌2小时后，采用高压纳米均质机均质处理，高压纳米均质机参数如下：50HZ；1200bar，均质2次。将均质后灵芝β-葡聚糖溶液离心处理，离心机参数如下：9000rpm、时间20分钟。去除沉淀，得到灵芝β-葡聚糖均质溶液，冷冻干燥得到新的灵芝β-葡聚糖，用干燥质量除以均质溶液体积计算溶解度。
对比例
称取灵芝β-葡聚糖(采用专利CN105175575B实施例1方法制备所得)，料液比为1：200加水，100℃下充分搅拌2小时，将灵芝β-葡聚糖溶液离心处理，离心机参数如下：9000rpm、时间20分钟。去除沉淀，得到灵芝β-葡聚糖溶液，冷冻干燥得到灵芝β-葡聚糖，用干燥质量除以溶液体积计算溶解度。
实施例4
(一)溶解度比较
对实施例1、实施例2、实施例3和对比例中灵芝β-葡聚糖的溶解度进行比较(表1)，发现经高压均质处理后，灵芝β-葡聚糖的溶解度从0.58mg/mL提升到4.62mg/mL以上，溶解度提升了近7倍，且随着均质压力的升高，溶解度有明显提升，在实施例3的1200bar条件下处理所得均质产物溶解度达到5.52mg/mL。
表1实施例1及对比例1～3中灵芝β-葡聚糖的溶解度
(二)分子量比较
对实施例1、实施例2、实施例3和对比例中灵芝β-葡聚糖进行分子量测定。分子量参考高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光仪散射-示差折光检测仪连用法(HPSEC-MALLS-RI)对灵芝β-葡聚糖样品进行测定。
仪器：Waters2695 HPLC泵、Wasters2414示差检测器(美国Waters公司)、氦-氖激光光源的DAWN8+激光光散射检测器(美国Wyatt公司)。色谱柱：TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL(7.8mm×300mm，日本TOSOH公司)串联。流动相:0.05mol/L硝酸钠、0.02％叠氮钠。柱温30℃，流速0.5mL/min，上样量100μL。使用Astra(version6.1.1)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算多糖重均分子量(Mw)。
灵芝β-葡聚糖HPSEC分析结果显示，经高压均质处理后的灵芝β-葡聚糖均呈现出均一对称峰，随着均质压力的增加，峰的保留时间有明显延迟。重均分子量比较结果(表2)显示，经高压均质处理后，灵芝β-葡聚糖分子量明显降低，且随着压力增加，降低幅度越明显。
表2实施例1～3及对比例中灵芝β-葡聚糖的重均分子量
(三)免疫活性比较
实施例1-3与对比例灵芝β-葡聚糖通过Dectin-1受体结合激活NF-κB途径增强免疫活性测定
试剂配制：
(1)生长培养基：DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，10％(v/v)胎牛血清(美国Invitrogen公司)，100U/mL青霉素(美国Sigma-Aldrich公司)和100μg/mL链霉素(美国Sigma-Aldrich公司)，100μg/mL Normocin(美国InvivoGen公司)。
(2)选择培养基：取50mL完全培养基，加入200μL HEK-Blue CLR Selection(美国InvivoGen公司)中，4℃条件下保存。
(3)检测培养基：将HEK-Blue Detection(美国InvivoGen公司)溶于50mL无菌水，4℃避光条件下保存。
细胞培养：用DMEM完全培养基培养HEK-Blue hDectin-1a细胞株(美国InvivoGen公司)，两代后在选择培养基中进行培养，培养箱条件均为5％CO2、37℃和饱和湿度。
测定方法：取对数生长期的HEK-Blue hDectin-1a细胞，用检测培养基调节其细胞密度为3×105个/mL，在96孔板中加入细胞悬液和不同样品液，以无菌水为阴性对照，样品终浓度为50μg/mL和200μg/mL，每个样品设置三个重复。置于培养箱中培养24h，用酶标仪在630nm波长处测定其吸光度值。
活性比较结果显示(图2)，对比例的灵芝β-葡聚糖和实施例1～3的灵芝β-葡聚糖均具有一定的激活NF-κB的活性，但活性强弱上有差异。实施例1～3的灵芝β-葡聚糖活性显著优于对比例的灵芝β-葡聚糖。
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的提取方法得到的灵芝β-葡聚糖可以解决灵芝β-葡聚糖在最初溶解性过低的问题；同时，本发明所述提取方法过程简便成本低，为后续的研究开发和应用提供更加完善的提取方法。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种新的灵芝β-葡聚糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
称取灵芝β-葡聚糖，加水90-100℃下充分搅拌1-3小时，采用高压纳米均质机均质处理，离心去除残渣，即得到灵芝β-葡聚糖均质液，冷冻干燥即得到新的灵芝β-葡聚糖；
所述加水搅拌的料液比为1：150～300，g:mL；
所述高压纳米均质机均质处理条件为50HZ、400-1200bar。
2.根据权利要求1所述的一种新的灵芝β-葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：将灵芝β-葡聚糖按照料液比1：150～300(g:mL)加水100℃充分搅拌2小时，采用高压纳米均质机均质处理50HZ、400-1200bar，离心去除残渣，即得到灵芝β-葡聚糖均质液，冷冻干燥即得到新的灵芝β-葡聚糖。
3.根据权利要求1或2任一项所述新的灵芝β-葡聚糖的制备方法，其中高压纳米均质机参数如下：50HZ；400bar、800bar、1200bar；均质2次。
4.权利要求1-3任一项所述方法制备得到的新的灵芝β-葡聚糖。
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| CN103059161A (zh) * | 2013-01-06 | 2013-04-24 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种提高酵母β-D-葡聚糖水溶性的方法 |
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