CN114920938B - 精氨酸偶联植物源聚糖与多肽合成共聚物的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了精氨酸偶联不同分子量植物源聚糖与多肽合成共聚的制备方法和应用,属于现代声化技术、酶分子机器技术、超滤技术三者集成的生物医药领域。首先是应用声化辅助有机合成技术,在超声波的空化传质作用下实现氨解,使精氨酸偶联不同分子量植物源聚糖,其次是仍在超声波空化传质作用辅助下,应用微生物来源的MTGase作为生物催化剂,经体外酶促合成——在精氨酸偶联不同分子量植物源聚糖的氨基上与多肽合成共聚,形成一类新化合物集群。植物源聚糖包括但不限于不同分子量直链甘露聚糖、直链半乳聚糖、β‑葡聚糖等,多肽指植物源多肽。这些产品是抗癌症、抗病毒、增强人体免疫力等生物创新药的苗头物或先导物。
Description
技术领域
本发明涉及声化技术和酶分子机器技术集成的生物医药领域,公开了一种精氨酸偶联植物源不同分子量聚糖与多肽合成共聚物的制备及应用。更确切地说是应用超声波空化传质作用,辅助精氨酸偶联植物源不同分子量聚糖,再在超声波空化传质的辅助作用下,经MTGase(转谷氨酰胺酶)酶促合成,使精氨酸偶联植物源不同分子量聚糖与多肽生物合成共聚,形成一类新化合物集群。
背景技术
从20世纪50年代对真菌多糖抗癌效果的发现以来,人们开始了对植物源多(聚)糖的化学、物理、生物学等方面的系统研究。一般地,聚糖比多糖的分子量要小,本发明以聚糖指称多糖。植物源聚糖没有细胞毒性,应用于生物体毒副作用小。目前已有报道的植物源聚糖约有200多种,因此对植物源聚糖的研究已成为医药界的热门领域(申利红等,2011.2,<植物多糖的研究及应用进展>)。在植物源聚糖中,来源广泛的品种有甘露聚糖、半乳聚糖、β-葡聚糖、铁皮石斛多糖、天麻多糖、枸杞多糖等,大多具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性,但其药学功能均不具显著或极显著,也就是药学功能的天花板较低(王曼宇等,2011.11,<植物源性多糖提取及生物活性研究进展>)。而目前研究趋势是植物源聚糖与蛋白多肽的共聚结合后形成新化合物,有望获得显著或极显著的药学功能。
在生物医药领域,随着分子生物学特别是细胞生物学的快速发展,糖缀合物即糖链和蛋白质分子以共价键相连所形成的化合物参与许多重要的生物活动。基于此,科学家们多年在多糖健合多肽/蛋白键结合多糖方面进行了很多研究,取得了一些重大成果。如方亮等在1982.2月报道了关于“多抗甲素产生菌的筛选及33#菌株的生物化学特性(‘多抗甲素’后更名为’甘露聚糖肽’)”;宋刚等2007.12月发表了“甘露聚糖肽生物活性的研究进展”的综述;毛跟年等于2016年发表了“魔芋甘露聚糖肽制备工艺研究”的论文;胡卫珍等,2007.5月报道了云芝糖肽的液体发酵研究成果。中国专利:甘露聚糖肽及其制备工艺和用途(CN1440980 A,2003.3)等。
自2000年以来,抗体药物(发明人称其为糖基化蛋白或蛋白聚糖药物)在抗癌症药物中逐年大幅增长,已占据50%的比例(SFDA,2008)。而抗体药物的本质是糖基化蛋白(寡糖修饰抗体蛋白)的免疫治疗药物,从专业分类的大类来说,也属于糖肽的研究成果。研究表明,人们在研究菌种发酵和细胞培养产出糖肽和蛋白聚糖的同时,也广泛进行了氨基化多糖、酶促糖肽接枝等体外合成技术的实验,积累了大量的研究成果(李宏涛,200.5,氨基甘露聚糖的制备、理化性质及应用的研究;张昊等,2018.2月,L-精氨酸改性淀粉的制备及其抗菌薄膜的性能;王建坤等,2018.11月,张胜明等,2009.8,中国专利:CN101624427A,一种高取代度精氨酸-壳聚糖及其制备方法和应用;王建坤等,2018.11,氨基化淀粉螯合材料的制备及其在吸附Zn(Ⅱ)和Co(Ⅱ)中的应用;帅放文等,2014.4月,一种蛋白质接枝天然多糖及其制备方法,中国专利:CN103980500B;邹胜琼,2017.5,羟丙基壳聚糖接枝多肽的制备研究;高冬梅等,2015.9,超声波在有机合成中的应用,等等。
但无论是来自于微生物发酵的甘露聚糖肽,还是用魔芋飞粉制备的魔芋甘露聚糖肽,乃至于寡糖修饰蛋白的抗体药物,都不重视聚糖与蛋白多肽的量比关系,与生理功效之间的复杂构效关系,即药物定量构效关系(QSAR),也包括抗体蛋白与寡糖之间量比关系与生理功效的之间的复杂构效关系,而这些复杂的构效关系的研究与调整却是丰富和扩展QSAR理论的重要内容,或可称为定量构效关系-2.0。
生物学常识告诉我们,人体是由无数细胞构成的,蛋白质则是细胞的主要成份,近年来蛋白质组学和糖组学更深刻地揭示出,造成人体机体、器官、细胞的内生或外源侵袭而来的病变物质本质是各种不同类型的糖基化蛋白或糖缀合物。因此研究出与这些人体内受体相适配的配体物质就具有十分重要的意义。换言之,研究出与人体内生的癌细胞,心脑血栓,AD病症中的β-粥样蛋白,以及外源的细菌和病毒的核心成份相适配的植物源糖基化多肽和蛋白(多肽)与多糖合成共聚就是生物医药科技人员的重要任务。
发明内容
本发明从植物源聚糖和蛋白肽量比关系的理论思考出发,借鉴现有技术如氨基化多糖\聚糖技术,多糖\聚糖接枝多肽技术,以及膜筛分技术等,并在系统集成的基础上,创造性地提出了精氨酸偶联不同分子量(段)植物源聚糖并与多肽合成共聚的技术方案,即,应用现代声化技术,即利用超声波的空化作用辅助于有机精细合成听氨解技术、酶分子机器技术等制备出精氨酸偶联直链甘露聚糖并与多肽合成共聚的方法。超声波在有机合成方面的作用,是声学与化学边缘交叉学科,其原理是主要是利用超声的空化现象,即空化泡崩溃产生局部的高温、高压和强烈的冲击波及射流,为一般条件下难以实现或不可能实现的化学反应提供了一种新的非常特殊的物理化学环境,在有机精细合成和分解反应中已成为成熟技术。
近20年来,已有文献曾报道了应用超声波的空化作用氨基化甘露聚糖的研究成果,但该成果所宣称的甘露聚糖却是葡甘露聚糖(glucomannan),是葡萄糖和甘露糖以大约1:1.6的比例交织组成的杂多糖,既有其特殊的生理功能,又使其生理功能受到了很大的束缚。
还有不少的文献报道了精氨酸修饰壳聚糖及壳聚糖接枝蛋白的研究成果,其意义在于壳聚糖的C2位上有一个天生的氨基(NH2),虽然能方便地与其它氨基酸或蛋白接枝,但却丧失掉一个天生的氨基(NH2),使以后的结构优化遭遇很大的困难。
与前述研究成果的作用对象和功能指向不同,本发明的目的是提出了一种精氨酸偶联植物源聚糖并与多肽合成共聚为药物先导物的制备方法。本发明在参照超声波空化作用于氨基化多糖和酶促合成共聚为糖肽的现有技术的基础上,首先是应用声化技术辅助作用下实现氨解,使精氨酸偶联植物源聚糖,其次是仍在超声波的空化传质辅助下,应用微生物来源的MTGase作为生物催化剂,酶促合成糖肽。
本发明公开的精氨酸偶联植物源聚糖,其糖基主要包括直链甘露聚糖,直链半乳甘露聚糖,β-葡聚糖;植物源糖基还包括铁皮石斛,天麻,枸杞等;所述的多肽包括不同分子量植物源多肽,如亚聚多肽(20~40kDa),次聚多肽(10~20kDa)等。本发明基于聚糖多肽间量比关系与生理功效关联关系的研究与制备出的产品,既能针对人体器官和细胞的特异性病变受体,适配出精氨酸-不同分子量(段)植物源聚糖-多肽,更由于产品中引入了带胍基的精氨酸具强正电荷,可大大增强其与人体内多数的器官和细胞病变受体(内源性抗原)的阴离子负电荷之间静电引力的相互作用,这种由表到里,由物理属性到化学结构,形成全方位,立体式,多维度对病变物质的重力抗击,从技术层面贯彻了本发明关于聚糖和多肽量比关系引致相应生理功效变化的科学设计将扩展药物定量构效关系——QSAR的理论内涵,并为建构QSAR模型-2.0奠定了技术与标本基础。
本发明在此以精氨酸偶联直链甘露聚糖为糖基,并与多肽合成共聚为药物先导物为例来阐述本专利的发明思想:
1、精氨酸偶联直链甘露聚糖与特异性多肽合成共聚技术原理是:
注:Arg(精氨酸);Linear Mannans(直链甘露聚糖);Peptide(多肽)。
在超声波空化作用下氨解,使精氨酸偶联到植物源中的直链甘露聚糖C6上;再在超声波空化作用下,经MTGase催化,多肽与直链甘露聚糖C6上偶联的精氨酸另一游离氨基合成共聚(Arg-LiMa-PP)。
名词解释
1、精氨酸偶联直链甘露聚糖接枝多肽的英文及缩写:Arg Coupled LinearMannans Grafting Peptides(Arg-LiMa-Pp)。数均分子量:>100kDa;
2、精氨酸偶联直链甘露次亚聚糖接枝次亚聚多肽的英文及缩写:Arg CoupledLinear CYJ Mannans Grafting CYJ Peptides(Arg-LiCYJMa-CYJPp),数均分子量:50~80kDa;
3、精氨酸偶联直链甘露次聚糖接枝次聚多肽的英文及缩写:Arg Coupled LinearCJ Mannans Grafting CJ Peptides(Arg-LiCJMa-CJPp),数均分子量:30~60kDa;
4、精氨酸偶联直链中分子甘露聚糖接枝中分子多肽的英文缩写:Arg-LiMMMa-MMPp,数均分子量:16~30kDa;精氨酸偶联直链小分子甘露聚糖接枝小分子多肽的英文缩写:Arg-LiSMMa-SMPp,数均分子量:8~16kDa;
5、精氨酸偶联直链半乳亚聚糖接枝特异性多肽的英文及缩写:Arg CoupledLinear Galactan Grafting Specificity Peptides(Arg-LiGa-SPPP)。数均分子量:>100kDa;
6、精氨酸偶联直链半乳次亚聚糖接枝次亚聚多肽的英文及缩写:Arg CoupledLinear ZYJ Galactan Grafting ZYJ peptides(Arg-LiZYJGa-ZYJPP),数均分子量:50~80kDa;
7、精氨酸偶联直链半乳次聚糖接枝次聚多肽的英文及缩写:Arg Coupled LinearZJ Galactan Grafting ZJ peptides(Arg-LiZJGa-ZJPP),数均分子量:30~60kDa;
8、精氨酸偶联直链中分子半乳聚糖接枝中分子多肽的英文缩写:Arg-LiMMGa-MMPP,数均分子量:16~30kDa;精氨酸偶联直链小分子半乳聚糖接枝小分子多肽的英文缩写:Arg-LiSMGa-SMPP,数均分子量:8~16kDa;
9、精氨酸-β-亚聚葡聚糖接枝特异性多肽的英文及缩写:Arg Coupled YJβ-dextran Grafting Specificity Peptides(Arg-β-Dex-SpPP)。数均分子量:>100kDa;
10、精氨酸偶联次亚聚β-葡聚糖接枝次亚聚多肽的英文及缩写:Arg Coupled CYJβ-dextran Grafting CYJ Peptides(Arg-CYJβ-Dex-CYJPp),数均分子量:50~80kDa;
11、精氨酸偶联次聚β-葡聚糖接枝次聚多肽的英文及缩写:Arg Coupled CJβ-dextran Grafting CJ Peptides(Arg-CJβ-Dex-CJPp),数均分子量:30~60kDa;
12、精氨酸偶联中分子β-葡聚糖接枝中分子多肽的英文缩写:Arg-MMβ-Dex-MMPp,数均分子量:16~30kDa;精氨酸偶联小分子β-葡聚糖接枝小分子多肽的英文缩写:Arg-SMβ-Dex-SMPp,数均分子量:8~16kDa。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案,以LiMa为原料时:
1、参照现有技术,经声化技术辅助氨解反应制备出精氨酸偶联直链甘露聚糖(Arg-LiMa):取100g LiMa分散于1000ml纯水中,加200g Arg,用5%的氨水调节pH至9;再用超声波装置于30MHz、强度40%处理60min,使Arg与LiMa偶联(Arg-LiMa)。
所述的LiMa包括不同分子量(段)产品,如直链次亚聚甘露聚糖,直链次聚甘露聚糖,直链大分子甘露聚糖,直链小分子甘露聚糖,直链大分子甘露寡糖等,所述的不同分子量(段)直链甘露聚糖系市售食品级商品。
2、将Arg-LiMa溶液置于真空离心机,设定温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5后备用。
3、用1kDa分子量超滤膜除去溶液中的游离Arg,反应结束以无水乙醇沉淀Arg-LiMa,再以体积分数70%乙醇溶液离心洗涤至上层清液无坂口反应。因为聚糖接枝多肽的关键步骤是把聚糖上的游离OH与Arg发生氨解反应,所以测定Arg偶联聚糖的偶联率(Cr)就显得十分重要;反应结束后测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)均值为54.0%,电导率均值为280μs/cm(该指标确认了Arg偶联到了LiMa糖分子上),称为“1#产物”。
4、Arg-LiMa之偶联率测定
⑴因为Arg-LiMa与多肽体外生物合成共聚的关键步骤是把LiMa上的游离OH与Arg发生氨解反应,之后才能使多肽中的游离α-羧基和精氨酸上的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键即-CO-NH-,当2个氨基之间发生氨酰基共价反应后,Arg-LiMa才能成功与多肽生物合成共聚,所以测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)就显得十分重要;
⑵在碱性次卤酸盐的存在下,Arg的侧基胍基可与α-萘酚结合生成红色物质,称为坂口反应。由于Arg是20余种氨基酸中唯一含胍基的氨基酸,因此坂口反应是Arg的特殊颜色反应,专门用于Arg的定性与定量检测。故借助坂口反应的原理来测定Arg-LiMa的偶联率,是一种快速方便而又准确的方法。
⑶偶联率计算公式:
式中:Cr为偶联率(平均值,%);W1为Arg-LiMa样品中水解Arg的含量,单位为mg;W2为Arg-LiMa样品质量,单位为g。
⑷具体步骤为:准确称取0.2g绝干的Arg-LiMa样品,溶于50mL 2N的盐酸溶液,在95℃下加热回流3小时,使Arg-LiMa彻底水解,随后通过坂口反应,采用分光光度法测定溶液中游离Arg的含量为108mg,再通过公式(1)计算产物偶联率(平均值):
上述反应结束后测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)为54.0%,电导率为280μs/cm(该指标从侧面确认了Arg偶联到了LiMa糖分子上。
进一步的技术方案,本发明还提供了一种Arg-LiMa与多肽经体外酶法合成为共聚物的方法,当以Arg-LiMa为糖基与多肽合成共聚时——在微生物来源的MTGase(转谷氨酰胺酶)的催化下,用“1#产物”与多肽生物合成共聚:
1、参照现有技术,纯化微生物来源的转谷氨酰胺酶(MTGase):将一定量的MTGase溶解在0.2mol HCl/LKH2PO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.5)中,以4000rpm的速度离心10分钟,用1.0mol/L HCl将上清液调节至pH=5.6,除去不溶部分后,然后用1.0mol/l HCl将上清液调节至pH=4.2,再用离心机离心,接着将所得上清液透析纯化3天,将透析后的MTGase冻干,得到纯化的MTGase粉末,称为“中间产物Ⅰ”。
2、Arg-LiMa与多肽混合液的配制——以Arg-LiMa为糖基,加入多肽(不同分子量<段>多肽),配成不同重量比的Arg-LiMa+多肽混合物(液),糖肽和水溶液的比例为1:10,如:①亚聚糖:亚聚多肽=1:1.6;②次亚聚糖:次聚多肽=1:2.4;③次聚糖:次聚多肽=1:2.0;④次聚糖:中分子多肽=1:2.0;⑤中分子聚糖:中分子多肽=1:1.8;⑹小分子聚糖:小分子多肽=1:1.6;⑺大分子寡糖:大分子寡肽=1:1.8;⑻小分子寡糖:小分子寡肽=1:2.2;所述的不同分子量<段>多肽指植物源多肽,称为“中间产物II”。
3、Arg-LiMa与多肽体外合成共聚——参照现有技术,经超声波的空化作用辅助,在MTGase的催化下,使Arg-LiMa+多肽经生物合成共聚为糖肽药物先导物:
⑴将“中间产物II”400ml用氨水调节pH至8.5;用超声波装置于25MHz、强度30%的超声波处理30min,该产物称为“中间产物Ⅲ”;
⑵将经超声处理过的“中间产物Ⅲ”置于真空离心机,在温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5,干燥后室温放置2h;
⑶将上述经超声处理过的“中间产物Ⅲ”400ml和纯化的“中间产物Ⅰ”4~6g一并加入15000ml 0.2mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(PBS,pH=6.0)中溶解,于40℃,磁力搅拌180min;以完成糖肽酶促合成共聚;
⑷上述反应结束后迅速升温至130℃,3~5s瞬时灭酶,随后迅速冷却至室温;
⑸将上述溶液抽滤后透析3天,最后将透析的产物冷冻干燥,得到Arg-LiMa-特异性多肽生物合成共聚物,称为“2#产物”。
进一步的技术方案,取“2#产物”之一作代表用傅里叶变换红外光谱仪在波长为400-4000cm-1的范围内对样品进行扫描,得到样品的傅里叶红外光谱图。该图说明Arg-LiMa和多肽已成功合成共聚。
用凯氏定氮法测定样品的含氮量来确定共聚率,即分别测定Arg-LiMa和Arg-LiMa-特异性多肽的含氮量,再按下式计算共聚率:
式中:GP为共聚率(%);W1为Arg-LiMa-多肽合成共聚物中的氮含量,mg;W2为Arg-LiMa-多肽合成共聚物样品的质量,g;
准确称取0.2gArg-LiMa-多肽共聚物样品,测定其平均氮含量为133.0mg,由此计算:
上述共聚率的含义是指平均值为67.0%的Arg-LiMa与多肽发生了共聚,而相对于起始物质——LiMa来说,则聚糖多肽共聚的平均值只有37.0%。
进一步的技术方案,将“2#产物”中的2~80kDa Arg-LiMa与多肽合成共聚的液体分别浓缩成含固量24~26%的产品,主要产物有12个,统称为“3#产物”,检测其总糖:≥45.0~55.0%,总氮≥45.0~50.0%;其核心产物是:
⑴Arg-直链甘露次亚聚糖-次聚多肽(50~80kDa),占7#产物”的15.0%;
⑵Arg-直链甘露次聚糖-次聚多肽(30~60kDa),占7#产物”的30.0%;
⑶Arg-直链中分子甘露聚糖-中分子多肽(16~30kDa),占7#产物”的20.0%;
⑷Arg-直链小分子甘露聚糖-小分子多肽(8~16kDa),占7#产物”的15.0%;
所述核心产物统称为“4#产物”,占精氨酸-不同分子段聚合度直链甘露聚糖-多肽产品群的80.0%,纯度≥95%,上述技术方案中,所述%为质量百分含量。
进一步的技术方案,本发明还提供了以直链半乳聚糖为原料,应用声化技术制备精氨酸偶联直链半乳聚糖(Arg-LiGa),其工艺步骤、检测方法同上述的Arg-LiMa,该产物称为“5#产物”;及应用声化技术和酶分子机器技术制备精氨酸偶联直链半乳聚糖与多肽合成共聚(Arg-LiGa-PP),该产物称为“6#产物”;其工艺步骤、检测方法同上述的Arg-LiMa-PP;所用的Arg、LiGa、多肽与酶制剂都是市售食品级商品;精氨酸偶联直链半乳聚糖与多肽合成共聚技术原理是:
注:①Arg(精氨酸);Linear Galactan(直链半乳聚糖);Peptide(多肽);
②在超声波空化作用下辅助氨解,使精氨酸偶联到直链半乳聚糖的C6上;再在超声波空化作用下,经MTGase催化,多肽与聚糖C6上偶联的精氨酸另一游离氨基合成共聚。
所述的直链半乳聚糖包括包括不同分子量(段)直链半乳聚糖,如直链次亚聚半乳聚糖,直链次聚半乳聚糖,直链大分子半服聚糖,直链小分子半乳聚糖,直链大分子半乳寡糖等,所述的不同分子量(段)直链半乳聚糖系市售食品级商品。
进一步的技术方案,本发明还提供了以β-葡聚糖(β-dex)为原料,应用声化技术制备精氨酸偶联β-葡聚糖(Arg-β-dex),该产物称为“7#产物”;及应用声化技术和酶分子机器技术制备精氨酸偶联β-葡聚糖与多肽合成共聚(Arg-β-dex-PP),该产物称为“8#产物”;所用的Arg、β-dex、多肽与酶制剂都是市售食品级商品,精氨酸偶联β-葡聚糖与多肽合成共聚技术原理是:
注:①Arg(精氨酸);β-dextran(β-葡聚糖);Peptides(多肽);
②在超声波空化作用下辅助氨解,使精氨酸偶联到β-葡聚糖的C6上;再在超声波空化作用下,经MTGase催化,多肽与聚糖C6上偶联的精氨酸另一游离氨基合成共聚。
1、采用β-葡聚糖酶来酶解β-葡聚糖,以生成不同分子量(段)β-dex混合液。
2、酶解准备,按底物浓度12~15%,配制β-dex溶液,调节pH为7.5~8.0,在500L酶解罐中,按有效容量350kg计,酶底比1:10加入β-葡聚糖酶液。
3、酶解反应,温度45~50℃,pH 7.5~8.0,搅拌40~60r/min,时间:2.5~3.5小时,取样测定酶解物控制在800~1000mPa·s)时,停止酶解反应。
4、离心分离,用薄板换热器升温至130℃,3~5s瞬间灭酶,当酶解液温度降至80℃时,加入酶解液总量0.2‰~0.3‰的琼脂絮凝,沉淀蛋白等非β-dex的大分子物质,上清液经过滤澄清;此时的β-dex酶解液粘度为600~700mPa·s。
5、采用离子交换装置脱盐,为下工序纳滤的污染防治创造条件。
6、前述β-dex酶解液不同分子量混合物为2~60kDa,β-dex转化率为95%。
进一步的技术方案,本发明还提供了应用超滤技术筛分不同分子量(段)β-dex的方法:
1、应用中空纤维超滤膜装置,设60kDa,40kDa,20kDa,10kDa,6kDa,2kDa,共6套截留不同分子量的超滤膜组件,在超滤压力为0.25~0.30MPa,待超滤液pH为7.5~8.0,温度为25~28℃的条件下,对β-dex酶解液进行超滤。
2、所述的酶分子机器技术制备不同分子量(段)β-dex的方法,可以筛分出不同分子量(段)的产品,A类产品为β-葡亚聚糖,分子量>60kDa,约占超滤产物的5.0%,B类产品为β-葡次亚聚糖(40~60kDa),约占超滤产物的10.0%,C类产品为β-葡次聚糖(20~40kDa),约占超滤产物的30.0%,D类产品为中分子β-葡聚糖(10~20kDa),约占超滤产物的25.0%,E类产品为小分子β-葡聚糖(6~10kDa),约占超滤产物的15.0%,F类产品为大分子β-葡寡聚糖(2~6kDa),约占超滤产物的10%,G类产品为小分子β-葡寡聚糖(<2kDa)约占超滤产物的5.0%;将2~40kDa不同分子量(段)聚合度β-葡聚糖液分别经浓缩成含固量24~26%的产品,>60kDa的β-葡聚糖和<2kDa的小分子β-葡寡聚糖另作他用。
进一步的技术方案,所述的精氨酸偶联植物源多糖与多肽合成共聚的多糖原料还包括并不限于铁皮石斛多糖,天麻多糖,枸杞多糖等;其工艺步骤是先先酶解为不同分子量混合物,再经膜技术筛分,然后才能与精氨酸偶联,最终与多肽合成共聚。其与精氨酸偶联,及与多肽合成共聚的方法同前述Arg-LiMa和Arg-LiMa-PP技术方案。
进一步的技术方案,本发明所述的不同分子量植物源聚糖基包括并不限于铁皮石斛多糖、天麻多糖、枸杞多糖与特异性多肽体外生物合成为共聚物,其工艺步骤同Arg-β-dex为糖基与与多肽经体外酶法合成为共聚物的方法。
进一步的技术方案,所述的植物源聚糖中,以Arg-LiMa与多肽合成共聚制备出的产品可分别作为抗癌症、抗病毒、抗AD等重大病患创新药的苗头化合物或先导化合物的前体物质,以及高效增加免疫力的能食品和特医食品的关键组份。
本发明的创新点(有益效果)
——本发明在系统集成并扩展了聚糖接枝多肽的生物合成技术基础上,经迭代创新,制备出Arg-植物源聚糖-PP共聚物的系列产品,是一类新化合物集群。
——本发明从技术设计层面入手,贯彻了本申请关于聚糖和多肽量比关系引致相应生理功效变化的科学设计将构建升级版药物定量构效关系(QSAR)的理论思考,进而为扩展QSAR理论,或建构QSAR模型-2.0奠定了技术与物质(标本)基础。由此也跨出了由被动接受天然产物向主动创造新化合物之生物学新理念的关键一步。
——本发明公开的精氨酸-植物源聚糖-特异性多肽合成聚合的制备及系列产品作为优良的药物配体,其产品中引入了带胍基的精氨酸具强正电荷,可与人体内源性病变物质中带负电的表面及内部的功能性糖蛋白、DNA、RNA等作用,从而表现出极强的抗病变性能,工艺简单,操作容易,原料广泛,适合批量生产,经济而富有效率,较完美地演绎了创新技术赋能经济价值的深刻内涵。
附图说明
作为说明书的组成部分,说明书附图扩展了本发明实施例的内涵,并且与说明书一起,进一步用于解释本发明的原理以及使所属领域技术人员能够使用本发明的技术方案。
1、说明书附图1是本发明精氨酸偶联植物源聚糖中的直链甘露聚糖与多肽合成共聚的技术原理图,包括:
(1)式1是Arg分子结构图:①Arg含1个胍基;②Arg有2个氨基,2个亚氨基,正电性极强;
(2)式2是LiMa的分子结构图:①LiMa在C2,3,6位上有游离羟基;②LiMa的C6位上的羟基最活跃,将竞争性与Arg偶联;
(3)式3是Arg-LiMa:①在超声波的空化作用下,Arg的1个氨基偶联LiMa,还有1个氨基与多肽接枝;②Arg的偶联率为54%;
(4)式4是Arg-LiMa与PP合成共聚。①超声波辅助合成,Arg-LiMa与多肽合成共聚,在此基础上,采用微生物来源的MTGase为催化剂,在Arg-LiMa的Arg氨基上与多肽合成共聚;Arg-LiMa与PP的合成共聚为67%,相对于LiMa为37%。
(5)因LiMa、LiGa和β-dex的分子结构基本相同,且相互是同分异构体,故说明书附图1只列举LiMa。
2、说明书附图2是Arg-LiMa与多肽合成共聚的制备工艺流程图,包括:
(1)2-1示例氨解:Arg-LiMa;
(2)2-2示例纯化来源于微生物的MTGase——以用作糖肽共聚的生物催化剂;
(3)2-3示例精氨酸-不同分子量LiMa与特异性多肽合成共聚,生成产物2。
※※※因Arg-LiGa与多肽合成共聚的工艺流程与Arg-LiMa基本相似,故略去。
3、说明书附图3是Arg-不同分子量β-Dex与PP合成共聚的制备工艺流程图,包括:
(1)3-1示例酶解Dex生成不同分子量β-dex混合物;
⑵3-2示例超滤筛分出不同分子量β-Dex;
⑶3-3示例氨解:Arg-β-Dex;
⑷3-4示例纯化来源于微生物的MTGase——用作糖肽共聚的生物催化剂;
⑸3-5示例精氨酸-不同分子量β-Dex与多肽合成共聚。
4、说明书附图4是不同分子量LiMa与PP合成共聚的分子量检测色谱图,包括:
⑴4-1示例LiCJMa与CJPp合成共聚的分子量检测色谱图;
⑵4-2示例LiMMMa与SMPp合成共聚的分子量检测色谱图;
⑶4-3示例SMMa与SMPp合成共聚的分子量检测色谱图;
从附图3可以看出,随着聚糖多肽分子量的减小,出峰时间从左至右越来越靠后,这说明采用超滤膜分离筛分的技术方法是确实可行的。
5、说明书附图5是Arg-LiMa和Arg-LiMa与多肽合成共聚物的傅里叶红外光谱图:
从红外光谱图上可以看到:在Arg-LiMa的红外谱图中,1631cm-1处的峰归属于Arg的胍基,在1657cm-1出现了Arg-LiMa与多肽合成共聚C=O酰基的弯曲振动带。
由Arg-LiMa与多肽合成共聚的红外谱图与Arg-LiMa谱图相比,可看出,在1631cm-1和1415em-1处出现了Arg的特征峰,在Arg-LiMa与多肽合成共聚物中也出现了吡喃环的特征伸缩振动带,在1526cm-1出现的吸收峰归属于由聚糖多肽相互反应生成的酰胺键。该图说明多肽已成功合成共聚到Arg-LiMa糖链上。
具体实施方式
下面以实施例对本发明进一步说明。在进行描述之前,应当理解的是,在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义,而应当在允许发明人根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此,这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的,并非意图限制本发明的范围。在不偏离本发明的精神和范围的情况下,其它技术人员由其获得的其他改进方式和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1
以植物源聚糖中的直链甘露聚糖为原料先偶联精氨酸,再与多肽酶法合成为共聚物。
1、参照现有声化技术,本发明略作改进。声化技术辅助氨解反应制备出Arg-LiMa,所述的不同分子量(段)LiMa包括但不限于直链次亚聚甘露聚糖,直链次聚甘露聚糖,直链大分子甘露聚糖,直链小分子甘露聚糖,直链大分子甘露寡糖,直链小分子甘露寡糖。
2、通过氨解反应制备出Arg-LiMa:取100g任意分子量(段)LiMa分散于1000mL蒸馏水中,加200g精氨酸,用5%的氨水调节pH至9;再用超声波装置于30MHz、强度40%处理60min,制备出Arg偶联不同分子量LiMa。
3、将Arg-LiMa溶液置于真空离心机,设定温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5后备用。
4、用1kDa分子量超滤膜或纳滤膜除去溶液中的游离精氨酸,反应结束后,以无水乙醇沉淀Arg-LiMa,再以体积分数为70%乙醇溶液离心洗涤至上层清液无坂口反应。因为聚糖接枝多肽的关键步骤是把聚糖上的游离OH与精氨酸发生氨解反应,所以测定Arg偶联聚糖的偶联率(Cr)就显得十分重要;上述反应结束后测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)均值为54.0%,电导率均值为280μs/cm(该指标确认Arg偶联到LiMa分子上,称为“1#产物”。
5、Arg-LiMa之偶联率测定:
⑴因为Arg-LiMa与多肽合成共聚的关键步骤是把LiMa上的游离OH与Arg发生氨解反应,之后才能使多肽中的游离α-羧基和精氨酸上的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键即-CO-NH-,当2个氨基之间发生氨酰基共价反应后,聚糖才能成功接枝多肽,所以测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)就显得十分重要;
⑵在碱性次卤酸盐的存在下,Arg的侧基胍基可与α-萘酚结合生成红色物质,称为坂口反应。由于Arg是20余种氨基酸中唯一含胍基的氨基酸,因此坂口反应是Arg的特殊颜色反应,专门用于Arg的定性与定量检测。故借助坂口反应的原理来测定Arg-LiMa的偶联率,是一种快速方便而又准确的方法;
⑶偶联率计算公式:
式中:Cr为偶联率(%,均值;W1为Arg-LiMa样品中水解Arg的含量,单位为mg;W2为Arg-LiMa样品质量,单位为g;
⑷具体步骤为:准确称取0.2g绝干的任意分子量Arg-LiMa样品,溶于50mL 2N的盐酸溶液,在95℃下加热回流3小时,使精Arg-LiMa彻底水解,随后通过坂口反应,采用分光光度法测定溶液中游离Arg的含量为108mg,再通过公式(1)计算产物偶联率:
上述反应结束后测定Arg-LiMa的偶联率(Cr)均值为54.0%,电导率均值为280μs/cm(该指标从侧面确认了Arg偶联到了LiMa糖分子上),称为“1#产物”。
6、应用声化技术和酶分子机器技术制备Arg-LiMa与多肽酶法合成为共聚物:
⑴参照现有技术,纯化微生物来源的转谷氨酰胺酶(MTGase):将一定量的MTGase溶解在0.2mol HCl/LKH2PO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.5)中,以4000rpm的速度离心10分钟,用1.0mol/L将上清液调节至pH=5.6,除去不溶部分后,然后用1.0mol/l HCl将上清液调节至pH=4.2,再用离心机离心,接着将所得上清液透析纯化3天,将透析后的MTGase冻干,得到纯化的MTGase粉末,称为“中间产物Ⅰ”;
⑵Arg-LiMa与多肽混合溶液的配制——以Arg-LiMa为糖基,加入不同分子量(段)多肽,配成不同重量比的聚糖+多肽混合物,糖肽和水溶液的比例为1:10,如:①亚聚糖:亚聚多肽=1:1.6;②次亚聚糖:次聚多肽=1:2.4;③次聚糖:次聚多肽=1:2.0;④次聚糖:中分子多肽=1:2.0;⑤中分子聚糖:中分子多肽=1:1.8;⑹小分子聚糖:小分子多肽=1:1.6;⑺大分子寡糖:大分子寡肽=1:1.8;⑻小分子寡糖:小分子寡肽=1:2.2;所述的不同分子量<段>多肽指植物源多肽,所述的糖肽混合液称为“中间产物II”;
⑶Arg-iLMa与多肽合成共聚——经超声波的空化作用辅助,在MTGase的催化下,使Arg-LiMa+多肽混合物体外生物合成为共聚物:
①将Arg-LiMa+特异性多肽混合物(液)400ml用氨水调节pH至8.5;用超声波装置于25MHz、强度30%的超声波处理30min,称为“中间产物Ⅲ”;
②将经超声处理过的“中间产物Ⅲ”置于真空离心机,在温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5,干燥后室温放置2h;
③将上述经超声处理过Arg-LiMa与多肽混合液400ml和纯化的MTGase粉末4~6g一并加入15000ml 0.2mol/LNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液(PBS,pH=6.0)中溶解,于40℃,磁力搅拌180min;以完成Arg-LiMa与多肽的酶促合成共聚;
④上述反应结束后迅速升温至130℃,3~5s瞬时灭酶,随后迅速冷却至室温;
⑤将上述溶液抽滤后透析3天,最后将透析的产物冷冻干燥,得到Arg-LiMa与多肽酶法合成的共聚物,称为“2#产物”。
7、将“2#产物”中的2~80kDa Arg-LiMa与多肽合成共聚的液体分别经真空浓缩、冻干得到Arg-糖肽产品群,主要产物有12个,统称为“3#产物”,检测其总糖:≥45.0~55.0%,总氮≥45.0~50.0%,精氨酸-直链聚糖与多肽的共聚率以Arg-LiMa-多肽为代表的均值是67.0%:其中,核心产物有4个:
⑴Arg-直链甘露次亚聚糖-次聚多肽(50~80kDa),占7#产物”的15.0%;
⑵Arg-直链甘露次聚糖-次聚多肽(30~60kDa),占7#产物”的30.0%;
⑶Arg-直链中分子甘露聚糖-中分子多肽(16~30kDa),占7#产物”的20.0%;
⑷Arg-直链小分子甘露聚糖-小分子多肽(8~16kDa),占7#产物”的15.0%;
所述核心产物统称为“4#产物”,占Arg-LiMa-多肽产品群的80.0%,纯度≥95%;上述技术方案中,所述%为质量百分含量。
实施例2
甘露聚糖多肽共聚率计算和红外光谱扫描分析
1、用凯氏定氮法测定样品的含氮量来确定甘露聚糖多肽共聚率,即分别测定任意分子量Arg-LiMa和Arg-LiMa-多肽的含氮量,再按下式计算共聚率(平均值):
式中:GP为共聚率(%);W1为Arg-LiMa-多肽合成共聚物中的含氮量;W2为Arg-LiMa的含氮量,单位%。
准确称取0.2g Arg-LiMa-多肽共聚物样品,测定其平均含氮量为133.0mg:
上述共聚率的含义是指平均值为67.0%的Arg-LiMa与多肽合成共聚,而相对于起始物质——LiMa来说,则与多肽合成共聚的均值只有37.0%。
2、取“4#产物”之一用傅里叶变换红外光谱仪在波长为4000-500cm-1的范围内对Arg-LiMa和Arg-LiMa与多肽合成共聚物样品进行扫描,得到傅里叶红外光谱图,见说明书附图5,该图说明多肽已成功合成共聚到Arg-LiMa糖链上。
实施例3
参照现有技术,应用声化技术制备精氨酸偶联直链半乳聚糖(Arg-LiGa),产物称为“5#产物”;及应用声化技术和酶分子机器技术制备(Arg-LiG与多肽酶法合成共聚,产物称为“6#产物”(Arg-LiGa-PP),所用的Arg、LiGa、多肽与酶制剂都是市售食品级商品,其工艺步骤、检测方法同实施例1,计算出偶联率均值为52.5%,共聚率均值为64.6%。
实施例4
参照现有技术,应用声化技术,酶分子机器技术制备Arg-β-葡聚糖与多肽合成共聚(Arg-β-dex-PP):
1、采用β-葡聚糖酶酶解β-dex,以生成不同分子量(段)β-dex混合溶液;
⑴酶解准备,按底物浓度12~15%,配制β-dex溶液,调节pH为7.5~8.0,在500L酶解罐中,按有效容量350kg计,酶底比1:10加入β-葡聚糖酶液;
⑵酶解反应,温度45~50℃,pH 7.5~8.0,搅拌40~60r/min,时间:2.5~3.5小时,取样测定酶解物控制在800~1000mPa·s)时,停止酶解反应;
⑶离心分离,用薄板换热器升温至130℃,3~5s瞬间灭酶,当酶解液温度降至80℃时,加入酶解液总量0.2‰~0.3‰的琼脂絮凝,沉淀蛋白等非β-dex的大分子物质,上清液经过滤澄清;此时的β-dex酶解液粘度为600~700mPa·s;
⑷采用离子交换装置脱盐,为下工序纳滤的污染防治创造条件;
⑸所述β-dex不同分子量混合液为2~60kDa,称为“中间产物Ⅲ”其转化率为95%。
2、应用超滤技术筛分不同分子量(段)β-dex的方法:
⑴应用中空纤维超滤膜装置,设60kDa,40kDa,20kDa,10kDa,6kDa,2kDa,共6套截留不同分子量的超滤膜组件,在超滤压力为0.25~0.30MPa,待超滤液pH为7.5~8.0,温度为25~28℃的条件下,对“中间产物Ⅰ”(β-dex混合液)进行超滤。
⑵所述的酶分子机器技术制备不同分子量(段)β-dex的方法,可以筛分出不同分子量(段)的产品,A类产品为β-葡亚聚糖,分子量>60kDa,约占超滤产物的5.0%,B类产品为β-葡次亚聚糖(40~60kDa),约占超滤产物的10.0%,C类产品为β-葡次聚糖(20~40kDa),约占超滤产物的30.0%,D类产品为中分子β-葡聚糖(10~20kDa),约占超滤产物的25.0%,E类产品为小分子β-葡聚糖(6~10kDa),约占超滤产物的15.0%,F类产品为大分子β-葡寡聚糖(2~6kDa),约占超滤产物的10%,G类产品为小分子β-葡寡聚糖(<2kDa)约占超滤产物的5.0%;将2~40kDa不同分子量(段)聚合度β-葡聚糖液分别经浓缩干燥产出糖粉成品,称为“中间产物Ⅳ”>60kDa的β-葡聚糖和<2kDa的小分子β-葡寡聚糖另作他用。
3、参照现有技术,应用声化技术制备精氨酸偶联β-葡聚糖(Arg-β-dex),其工艺步骤、检测方法同实施例1,计算出偶联率均值为53.3%,称为“7#产物”,参见说明书附图2-3。
4、参照现有技术,应用声化技术和酶分子机器技术制备Arg-β-dex与多肽酶法合成共聚(Arg-β-dex-PP),本发明略作改进;所用的原料都是市售食品级商品,其工艺步骤、检测方法同实施例1,计算出共聚率平均值为64.7%,产物称为“8#产物”。
实施例5
参照现有成熟技术,应用声化技术和和酶分子机器技术制备精氨酸偶联铁皮石斛多糖,天麻多糖,枸杞多糖,及精氨酸偶联铁皮石斛多糖,天麻多糖,枸杞多糖与多肽酶法合成为共聚物的工艺步骤、检测方法都按实施例3所述技术方法进行制备。
实施例6
1、发明人所在公司的化验室对上述实施例有关指标进行了检测,此处仅摘录Arg-LiMa及Arg-LiMa与特异性多肽合成共聚的结果,见表1:
注:①根据Arg-直链甘露聚糖与多肽接枝时,加入的聚糖与多肽的克分子重量关系、聚糖与子量比值、及总糖和总氮比值等多种因素推算出聚糖与多肽的量比关系。②核心成份得率即8~80kDa占直链甘露聚糖的比率。
6、精氨酸-植物源聚糖-多肽的相关检测,此处以精氨酸-直链甘露聚糖-多肽(Arg-LiMas-PP)的相关检测实例来说明本专利发明内容:
⑴精氨酸-直链甘露聚糖-多肽(Arg-LiMas-PP)的定性检测;
聚糖成分的定性检测采用蒽酮比色法;多肽成分的定性检测采用双缩脲法;
将精氨酸-直链甘露聚糖-多肽样品分成2份,1份滴加蒽酮试剂检测,样品液呈蓝绿色,说明其中含有聚糖类物质;另1份滴加双缩脲试剂检测,样品液呈紫红色,说明其中含有类似于双缩脲的结构,即肽键结构。因此,上述样品属聚糖多肽类共聚物质;
⑵精氨酸-直链甘露聚糖-多肽(A-LiMa-PP)分子量检测;采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法对A-LiMa-PP数均分子量进行了检测;
采用Waters 2695型高效液相色谱仪;wanters 2410示差折光检测器;Waters专用工作站;
采用多糖专用凝胶柱TSKG3000SWXL,理论塔板数以葡萄糖峰计算为10260,葡萄糖保留时问为20.37min;柱温35℃;以0.2mol·L-1硫酸钠溶液为流动相;进样量50μL;流速0.5ml·min-1,用GPC凝胶色谱软件(药典版)处理;
精确称取(A-LMAN-SPPP)样品1g,加水搅匀,移入100mL容量瓶中,60℃超声溶解10min,冷却加水至刻度,摇匀,过滤。精确量取4mL滤液,加12mL无水乙醇搅匀,10000rpm离心10min,弃上清液,沉淀用流动相溶解至1.5mI,0.45μm柱头滤器滤过,取50μL滤液供HPGPC供测。次聚甘露聚糖-次聚多肽,中分子甘露聚糖-中分子多肽,小分子甘露聚糖-小分子多肽的色谱图见说明书附图4。
(3)氨基酸成分的检测;
用氨基酸自动分析仪对Arg-LiCJMa-CJPP进行了检测,结果见下表:
氨基酸成份自动分析结果
表2、精氨酸-直链甘露次聚糖-瓜尔豆粕次聚多肽
注:1、市售药用甘露聚糖肽;2、Arg-LiCJMa-CJPP是精氨酸-直链甘露次聚糖-次聚多肽的英文缩写,该次聚多肽为植物源之瓜尔豆粕蛋白酶解超滤筛分产物;3、精氨酸的含量比其它氨基酸高很多,是因为本发明中使用了精氨酸偶联直链甘露聚糖所致;4、本发明产出的Arg-LiCJMa-CJPP中的氨基酸比药用甘露聚糖肽高46.81倍,体现出聚糖接枝多肽的优异效果;
实施例7
药学功能实验——精氨酸-直链甘露次亚聚糖-次亚聚多肽(Arg-LiCYJMa-CYJPP)<体外细胞抗肿瘤活性实验>:
Arg-LiCYJMa-CYJPP(50~80kDa)抗肿瘤活性的实验,分别取处于对数期生长的Hela和HL-60、SPCA-1和BGC-832细胞株采用MTT(四氮唑盐)比色法进行试验,通过埋板、加药培养,MTT法检测等一系列试验步骤。
在490nm处用酶联免疫检测仪测定各孔OD值,计算抑制率。我们选择了临床上应用比较成熟且抗肿瘤效果较好的CDDP(顺铂)注射液作为阳性对照,采用抑制率(IR,%)方法评价;初筛抑制率(IR%)如下表:
表3在100ug/ml浓度下样品对肿瘤细胞抑制率
结论:Arg-LiCYJMa-CYJPP(50~80kDa)在体外对肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用,其抑制率高于甘露聚糖肽药物,虽低于阳性对照组,因其只是药物先导化合物,不是候选药物组合物,但其大于或接近70%的抑制率还是展现出了Arg-LiCYJMa-CYJPP(50~80kDa)抗肿瘤的良好愿景。
实施例8
应用精氨酸-直链甘露次聚糖与次聚多肽(Arg-LiCJMa-CJPp,<30~60kD>)共聚物抗病毒——体外抑制HepG2-2.2.15细胞分泌HBsAg的作用:
取Arg-LiCJMa-CJPp样品实施体外抑制HepG 2-2.2.15细胞分泌HBsAg的作用体外试验,HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞HepG 2-2.2.15细胞,购自中国科学院武汉病毒研究所。
HepG 2-2.2.15细胞接种到24孔细胞培养板,细胞密度为2*105个/mL,48h换液,用PBS液洗涤,用药物的最大无毒浓度(TD0)为第1孔,再以含2%胎牛血清DMEM液作2倍系列稀释4个浓度,分别加入余下孔内,每孔1mL,每1个浓度设4个复孔,并设相应细胞对照组。在第24,72,120,168h分别吸取细胞上清液,-20℃冰冻保存,采用ELISA法检测HBsAg;结果见下表:
表4 Arg-LiCJMa-CJPp对HepG2-2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率(n=6,)
注:通常在HBV复制过程中,丝状及螺旋状空壳HBsAg的清除过程较困难,需要更长的抑制时间
该表说明,Arg-LiCJMa-CJPp在HepG2-2.2.15细胞培养中对HBsAg均有抑制作用。作用168h,4种浓度A-LSMMA-OPP抑制率分别为(86.68±4.62)%、(61.18±4.77)%、(44.50±3.48)%、(36.43±2.54)%。同一时间,随着试样浓度的增加,Arg-LiCJMa-CJPp抑制率随之增加;同一浓度,随着Arg-LiCJMa-CJPp作用时间的延长,其抑制率亦增加;本发明研制的Arg-LiCJMa-CJPp的抗病毒作用表现出显著的量效与时效关系。Arg-LiCJMa-CJPp对BsAg的抑制效果要优于对照组药物IFN A-2bc。
实施例9
精氨酸-直链中分子半乳聚糖与中分子多肽(Arg-LiMMGa-MMPp,<16~30kD>)共聚物调节人体免疫功能的对比试验——对单核—巨噬细胞功能的影响:
Arg-LiMMMa-MMPp对单核-巨噬细胞功能的影响(表5)
项目 | 中剂量对照组 | 本发明中剂量组 |
吞噬率% | 43.0±3.0 | 55.78±2.4 |
吞噬指数 | 0.4±0.01 | 0.56±0.02 |
吞噬指数a | 5.97±0.52 | 7.34±0.43 |
注:①中剂量对照组是已授权专利CN 102373256 B中的相关内容:
②本发明中剂量组的产品为Arg-LiMMGa-MMPp日服:1.5g;
③与对照组比较,本发明中剂量组能显著提高吞噬率\吞噬指数和碳廓清指数;
结论:精氨酸-直链中分子半乳聚糖-中分子多肽有显著的免疫调节功能。
实施例10
精氨酸-小分子β-葡聚糖与小分子多肽(Arg-SMβ-Ma-SMPp,<16~30kD>)共聚物调节人体免疫功能的对比试验——对NK细胞活性的影响:
Arg-LiSMMa-SMPp(8~16kDa)对NK细胞活性的影响(表6)
项目 | 已授权专利中剂量对照组 | 本发明中剂量组 |
NK细胞活性% | 27.98±6.68 | 38.92±6.74 |
注:①中剂量对照组是已授权专利CN 102373256 B中的相关内容:
②本发明中剂量组的产品为Arg-LiSMMa-SMPp(8~16kDa),日服:1.5g;
③与对照组比较,表明本发明中剂量组能显著增强NK细胞活性。
结论:精氨酸-直链小分子甘露聚糖-小分子多肽都有显著的免疫调节功能。
Claims (1)
1.应用声化技术和酶分子机器技术制备精氨酸(Arg)偶联不同分子量植物源聚糖并与多肽合成共聚的方法,其特征在于:所述的植物源聚糖以直链甘露聚糖LiMA为糖基时:
⑴通过超声波的声化作用辅助氨解反应制备出精氨酸偶联不同分子量直链甘露聚糖,以下简称为Arg-LiMa;取100g任意分子量LiMa分散于1000ml纯水中,加200g Arg,用5%的氨水调节pH至9;再用超声波装置于30MHz、强度40%处理60min,制备出Arg-LiMa;
所述的不同分子量直链甘露聚糖包括直链次亚聚甘露聚糖,直链次聚甘露聚糖,直链大分子甘露寡糖,直链小分子甘露寡糖,所述的不同分子量直链甘露聚糖系市售食品级商品;
⑵将Arg-LiMa溶液置于真空离心机,设定温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5,室温放置2h后备用;
⑶用1kDa分子量超滤膜或纳滤膜除去溶液中的游离精氨酸,反应结束后,以无水乙醇沉淀Arg-LiMa,再以体积分数为70%乙醇溶液离心洗涤至上层清液无坂口反应;上述反应结束后测定Arg-LiMa的偶联率Cr均值为54.0%,电导率均值为280μs/cm,称为“1#产物”;
以上述方法制备得到的Arg-LiMa与多肽经生物合成共聚:
⑴纯化微生物来源的转谷氨酰胺酶MTGase:将一定量的MTGase溶解在0.2mol HCl/LKH2PO4-NaOH缓冲溶液中,缓冲液pH=6.5,以4000rpm的速度离心10分钟,用1.0mol/L将上清液调节至pH=5.6,除去不溶部分后,然后用1.0mol/lHCl将上清液调节至pH=4.2,再用离心机离心,接着将所得上清液透析纯化3天,将透析后的MTGase冻干,得到纯化的MTGase粉末,称为糖肽合成共聚的“中间产物Ⅰ”;
⑵Arg-LiMa与多肽混合溶液的配制——以Arg-LiMa为糖基,加入不同分子量多肽,配成不同重量比的Arg-LiMa+多肽混合物,所配制的糖肽混合液称为糖肽合成的“中间产物II”;
⑶Arg-LiMa与多肽合成共聚——经超声波的空化作用辅助,在“中间产物Ⅰ的催化下,使中间产物II经生物合成共聚为糖肽药物先导物:
①中间产物II400ml用氨水调节pH至8.5;用超声波装置于25MHz、强度30%的超声波处理30min,该产物称为“中间产物Ⅲ”;
②将经超声处理过的“中间产物Ⅲ”置于真空离心机,设定温度30℃,1400rpm,离心去除少量的游离氨,用2.0%乙酸溶液调节pH至8.0~8.5后备用;
③将上述经超声处理过的“中间产物Ⅲ”400ml和纯化后的MTGase粉末4~6g一并加入15000ml0.2mol/LNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液PBS中溶解,缓冲液pH=6.0,于40℃,磁力搅拌180min;以完成Arg-LiMa与多肽的酶促合成共聚;
④上述反应结束后迅速升温至130℃,3~5s瞬时灭酶,随后迅速冷却至室温;
⑤将上述溶液抽滤后透析3天,最后将透析的产物冷冻干燥,得到Arg-LiMa-特异性多肽生物合成共聚物,称为“2#产物”;
⑷取“2#产物”用傅里叶变换红外光谱仪在波长为400-4000cm-1的范围内对样品进行扫描,得到样品的傅里叶红外光谱图;
用凯氏定氮法测定样品的含氮量来确定共聚率,即分别测定Arg-LiMa和Arg-LiMa-多肽的含氮量,并计算出“2#产物”的共聚率平均值为67%,而相对于起始物质——LiMa来说,聚糖多肽共聚的平均值只有37.0%。
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