CN109694416B

CN109694416B - 一种高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法

Info

Publication number: CN109694416B
Application number: CN201910003450.9A
Authority: CN
Inventors: 殷朝敏; 高虹; 姚芬; 史德芳; 范秀芝; 程薇; 陈浙娅; 乔鑫; 马昆; 薛淑静; 沈汪洋; 程士伦; 刘大青; 李海蓝
Original assignee: Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Farm Product Processing and Nuclear Agricultural Technology Institute of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CN109694416A

Abstract

本发明提供了一种高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，该方法包括将食用菌干燥粉碎后放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，然后加水进行复合酶酶解、超高速剪切‑超声一体化处理后，除去不溶物得提取液；提取液浓缩后加入无水乙醇，充分搅拌后静置、离心，所得沉淀物经洗涤、干燥即得。相对于传统的热水浸提法以及不辐照处理，本发明方法显著提高了多糖的溶出率、纯度和溶解性，并且经过辐照菇粉提取的多糖生物活性也得到了较大的提高。

Description

一种高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法

技术领域

本发明属于食用菌深加工技术领域，具体而言，涉及一种高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖提取制备方法。

背景技术

食用菌多糖是一类从食用菌子实体、菌丝体或发酵液中分离的并由10个以上的单糖以糖苷键形式连接而成的天然高分子化合物。研究表明，食用菌多糖具有调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗菌、降血脂、降血糖、抗炎、护肝、抗疲劳和抗衰老等功效，目前已经广泛应用于保健食品和药品中。

传统的食用菌多糖制备方法主要采用热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法提取等，这些方法制备的食用菌多糖提取率比较低，而且提取的多糖样品中杂质多，纯度不到30％；另外，这些方法需要长时间高温处理，会影响多糖的活性。除此之外，现有方法获得的多糖因分子量较大，易形成黏度高、溶解度低的复合物，限制了在生物体内的扩散和吸收，影响其临床应用效果，既而限制了多糖的应用。

多糖的分子修饰是运用物理、化学、生物等方法对其主链或侧链的某些特殊结构或功能基团进行修饰，使多糖的某些物理化学性质和空间结构发生改变，从而提高其生物学活性的方法。目前应用较多的修饰方法主要包括羧甲基化修饰、硫酸化修饰、硒化修饰、磷酸化修饰以及辐照修饰等。多糖的辐照修饰是对多糖进行电离辐射，引发多糖分子的电离和激发，发生辐照交联或辐照断裂，从而改变多糖的物理和化学性能，包括分子量、聚合度、分子结构、分子基团组成等。与化学修饰方法相比，辐照改性具有不需要添加催化剂、反应程序可控等优点，因此可用辐照修饰法对食用菌多糖进行修饰。

目前，多糖辐照修饰主要是将提取好的食用菌多糖进行辐照处理，这种处理也可以降低多糖分子量、增加多糖的溶解性，但对多糖的生物活性影响较大，部分多糖经过辐照处理，生物活性会完全丧失。因此，在辐照处理获得低分子量、高溶解性多糖的同时又不损失多糖的生物活性成为了一个技术难题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种适用于多种食用菌多糖的提取方法，采用该方法提取的食用菌多糖具有高纯度、高溶解性和高生物活性，非常适合应用于保健食品和药品中。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终结合γ射线(⁶⁰Co)辐照改性、生物酶复合酶解、超高速剪切处理等手段，大大提高食用菌多糖的溶出率和纯度，制备的多糖水溶性好，生物活性高。具体地，本发明的技术方案概况如下：

一种高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将食用菌原料干燥、粉碎并过筛，所得料粉放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为4～20kGy；

(2)取辐照后的料粉，加入10～30倍量的水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为5.8～6.2，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100～400万U、纤维素酶4.5～30万U及果胶酶10～50万U，36～37℃条件下酶解3～5h；

(3)将酶解液置于超高速剪切-超声一体制备装置中，设置剪切刀头转速8000～12000r/min，超声功率为300～350W，提取温度为75～90℃，处理时间为8～20min；

(4)超高速剪切处理后过滤，上清液保留，滤渣中加入10～30倍量的水重复步骤(3)后取上清，重复1～3次，合并上清液；

(5)将上清液浓缩后，加入无水乙醇至终浓度为60～80％，3～5℃静置过夜；

(6)离心获得多糖沉淀，沉淀经60％～70％乙醇溶液搅拌悬浮洗涤后离心，并真空干燥、粉碎，得高纯度食用菌多糖。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中步骤(1)中粉碎后的食用菌原料过80～160目筛。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中步骤(1)中辐照强度为12～18kGy。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中步骤(2)中酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶350～400万U、纤维素酶4.5～15万U及果胶酶12.5～15万U。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中步骤(3)中设置剪切刀头转速8000～10000r/min，超声功率为330～350W，提取温度为75～80℃，处理时间为8～15min。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中步骤(3)中离心的转速是7500～9000r/min。

进一步优选地，如上所述高纯度、高溶解性、高活性的食用菌多糖制备方法，其中所述的原料选自如下的任何一种或多种：平菇、猴头菇、裂褶菌、香菇、杏鲍菇、双孢蘑菇、香菇，蛹虫草的子实体、菌丝体、菌柄及其培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果和进步性体现在：将食用菌原料进行γ射线(⁶⁰Co)处理，并结合生物酶复合酶解、超高速剪切等技术，使得食用菌多糖的溶出率提高20％以上，从而大幅度提高了产品收率；用γ射线(⁶⁰Co)处理的菇粉提取的食用菌多糖纯度比不处理的多糖纯度提高10～20％；此外，γ射线(⁶⁰Co)处理的菇粉提取的食用菌多糖生物活性显著提高。

附图说明

图1不同辐照剂量菇粉提取的多糖在不同温度下所需时间的变化曲线；

图2不同辐照剂量菇粉提取的多糖对人前列腺癌细胞22RV1抑制效果；

图3不同辐照剂量菇粉提取的多糖对人宫颈癌细胞HeLa抑制效果；

图4不同辐照剂量菇粉提取的多糖对人肝癌细胞HepG2抑制效果；

图5不同辐照剂量菇粉提取的多糖对人非小细胞肺癌细胞A549抑制效果。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进行详细描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，但并不以任何方式限制本发明。在不背离本发明的技术解决方案前提下，凡是利用本发明说明书内容所作的、本领域普通科技人员易于实现的任何改动或改变都将包括在本发明的专利保护范围内。

实施例1

从平菇子实体中提取平菇多糖：平菇菌柄干燥后粉碎，过80目筛子。称取100g干粉，放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为18kGy；完成后取出，加20倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含0.4g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；0.9g纤维素酶，酶活15000U/g；0.7g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解4h。酶解结束后，将混合液置于超高速剪切-超声一体仪中，设置剪切刀头转速10000r/min，超声功率为350W，提取温度为90℃，处理时间为20min；混合液过滤后取上清，残渣中加20倍量水重复超高速剪切-超声提取，合并2次上清液，减压浓缩至100mL。加无水乙醇400mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体6.1g，多糖纯度52.3％。

实施例2

从裂褶菌子实体中提取裂褶菌多糖：裂褶菌子实体干燥后粉碎，过80目筛子。称取200g干粉，放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为20kGy；完成后取出，加30倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含0.6g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；0.6g纤维素酶，酶活15000U/g；0.5g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解3h。酶解结束后，将混合液置于超高速剪切-超声一体仪中，设置剪切刀头转速8000r/min，超声功率为300W，提取温度为95℃，处理时间为15min；混合液过滤后取上清，残渣中加30倍量水重复超高速剪切-超声提取，合并2次上清液，减压浓缩至150mL。加无水乙醇500mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体7.1g，多糖纯度68.42％。

对比例1：省略⁶⁰Co辐照装置γ射线处理步骤

从裂褶菌子实体中提取裂褶菌多糖：裂褶菌子实体干燥后粉碎，过80目筛子。称取200g干粉，加30倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含0.6g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；0.6g纤维素酶，酶活15000U/g；0.5g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解3h。酶解结束后，将混合液置于超高速剪切-超声一体仪中，设置剪切刀头转速8000r/min，超声功率为300W，提取温度为95℃，处理时间为15min；混合液过滤后取上清，残渣中加30倍量水重复超高速剪切-超声提取，合并2次上清液，减压浓缩至150mL。加无水乙醇500mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体6.8g，多糖纯度41.49％。

对比例2：省略超高速剪切-超声处理步骤

从裂褶菌子实体中提取裂褶菌多糖：裂褶菌子实体干燥后粉碎，过80目筛子。称取200g干粉，放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为20kGy；完成后取出，加30倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含0.6g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；0.6g纤维素酶，酶活15000U/g；0.5g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解3h。酶解结束后，混合液过滤后取上清，上清液减压浓缩至150mL。加无水乙醇500mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体2.1g，多糖纯度64.31％。

实施例3

从猴头菇子实体和菌丝体混合物中提取猴头菇多糖：猴头菇子实体和菌丝体混合物干燥后粉碎，过80目筛子。称取100g干粉，放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为15kGy；完成后取出，加20倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含0.5g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；1.0g纤维素酶，酶活15000U/g；0.3g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解4.5h。酶解结束后，将混合液置于超高速剪切-超声一体仪中，设置剪切刀头转速10000r/min，超声功率为350W，提取温度为80℃，处理时间为8min；混合液过滤后取上清，残渣中加20倍量水重复超高速剪切-超声提取，合并2次上清液，减压浓缩至100mL。加无水乙醇400mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体4.4g，多糖纯度71.61％。

实施例4

从香菇子实体和菌柄混合物中提取香菇多糖：香菇子实体和菌柄混合物干燥后粉碎，过80目筛子。称取200g干粉，放入⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为20kGy；完成后取出，加30倍量水浸泡过夜。调节pH值至6.0，加入复合酶液(含1.0g木瓜蛋白酶，酶活800000U/g；1.2g纤维素酶，酶活15000U/g；0.5g果胶酶，酶活50000U/g)，37℃条件下酶解5h。酶解结束后，将混合液置于超高速剪切-超声一体仪中，设置剪切刀头转速10000r/min，超声功率为350W，提取温度为90℃，处理时间为20min；混合液过滤后取上清，残渣中加30倍量水重复超高速剪切-超声提取，合并2次上清液，减压浓缩至150mL。加无水乙醇600mL，4℃静置过夜。8000r/min离心获得多糖沉淀，沉淀用80％乙醇溶液洗涤后离心并真空干燥、粉碎得白色粉末状固体9.3g，多糖纯度60.01％。

实施例5

取不同辐照剂量处理的平菇菇粉，按照实施例1中提取方法制备平菇多糖。取平菇多糖0.5g，置于不同温度下的含有20mL蒸馏水的烧杯中，记录多糖完全溶解所需时间。每组测定3次并取其平均值，测定的结果如图1所示。

由图1中测定所得的结果可知，在同样的浓度条件下，经18kGy辐照的菇粉制备的平菇多糖溶解性显著高于低剂量辐照组和空白对照组。

实施例6

准确称量不同辐照剂量处理的裂褶菌菇粉，按照实施例4中提取方法制备裂褶菌多糖，准确称取多糖各1mg，溶于1mL去离子水里，采用高效凝胶渗透色谱测定多糖分子量。检测条件：GPC色谱仪型号：LC-10A型HPLC；检测器：示差检测器RID-10A；进样器：自动进样器SIL-10AD；色谱柱：Ultrahydrogel TM Linear，实验条件：流动相：超纯水；流速：0.5mL/min；柱温：40℃；柱操作压力：1.6MPa；样品浓度：1mg/mL；进样量：20μL。实验结果如下表1所示。

表1不同辐照剂量菇粉提取的多糖分子量大小

由表1中测定所得的数据结果可知，18kGy辐照处理的菇粉制备的裂褶菌多糖纯度显著提高，且分子量降低了，因此多糖溶解性提高了。

实施例7

取实施例2中的裂褶菌多糖，开展细胞增殖活性实验。试验方法：取对数生长期22RV1、A549、HeLa和HepG2细胞，调节细胞密度为10⁵个/mL，接种于96孔板内每孔加入100μL细胞悬液，置于二氧化碳培养箱中解育24小时。次日，加入不同浓度多糖溶液，每个浓度设6个复孔，用没有加任何药物的DMEM完全培养基作为空白对照，未加药处理组作为阴性对照，37℃、5％CO₂恒湿培养箱分别培养24、48、72小时。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，在培养箱中孵育4小时，移除上清液，加入150μL二甲基亚讽(DMSO)，充分摇匀直至蓝紫色结晶甲攒完全溶解，使用酶标仪测定各孔在570nm处吸光值。实验结果如图2-5所示

由图2-5中结果可知，裂褶菌菇粉经不同辐照处理后，提取的多糖对22RV1、A549、HeLa和HepG2等肿瘤细胞抑制率显著提升。

Claims

1.一种高纯度、高溶解性、高活性的裂褶菌多糖制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）将裂褶菌原料干燥、粉碎并过80～160目筛，所得料粉采用⁶⁰Co辐照装置中进行γ射线处理，辐照强度为12～18 kGy；

（2）取辐照后的料粉，加入10～30倍量的水浸泡，使粉末充分吸水膨胀，调节pH值为5.8～6.2，加入复合酶，酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶100～400万U、纤维素酶4.5～30万U及果胶酶10～50万U，36～37℃条件下酶解3～5h；

（3）将酶解液置于超高速剪切-超声一体制备装置中，设置剪切刀头转速8000～12000r/min，超声功率为300～350W，提取温度为75～90℃，处理时间为8～20min；

（4）超高速剪切处理后过滤，上清液保留，滤渣中加入10～30倍量的水重复步骤（3）后取上清液，重复1～3次，合并上清液；

（5）将上清液浓缩后，加入无水乙醇至终浓度为60～80%，3～5℃静置过夜；

（6）离心获得多糖沉淀，沉淀经60%～70%乙醇溶液搅拌悬浮洗涤后离心，并真空干燥、粉碎，得高纯度裂褶菌多糖。

2.根据权利要求1所述高纯度、高溶解性、高活性的裂褶菌多糖制备方法，其特征在于，步骤（2）中酶的用量为每千克原料加入木瓜蛋白酶350～400万U、纤维素酶4.5～15万U及果胶酶12.5～15万U。

3.根据权利要求1所述高纯度、高溶解性、高活性的裂褶菌多糖制备方法，其特征在于，步骤（3）中设置剪切刀头转速8000～10000 r/min，超声功率为330～350W，提取温度为75～80℃，处理时间为8～15min。

4.根据权利要求1所述高纯度、高溶解性、高活性的裂褶菌多糖制备方法，其特征在于，步骤（3）中离心的转速是7500～9000r/min。