CN103435711B - 一种黑丑多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑丑多糖的提取方法，包括，原料除杂，粉碎过筛，脱脂脱色，热水提取，离心，浓缩，脱蛋白，干燥，得粗多糖，复溶，分级醇沉，离心，冻干，得白色黑丑多糖，经试验并修正得最佳提取条件为提取温度85℃、提取时间4.25h、液料比为51∶1(mL/g)，具有方案工艺简单，操作便捷，多糖的得率较高，可达25.5％，经过分级醇沉后多糖的纯度也很高，有望实现工业化的应用的优点。

Description

一种黑丑多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及一种植物多糖提取方法，特别涉及一种黑丑多糖的提取方法。

背景技术

研究证实植物多糖能够增强机体的特异性和非特异性免疫力，直接或间接激活B淋巴细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞，对肿瘤、高血脂、高血压、糖尿病等疾病具有治疗和抑制作用。目前在国内象茶多糖、香菇多糖、黄芪多糖、芦荟多糖、南瓜多糖等已经在临床或保健市场得到了广泛的应用。

黑丑是植物牵牛(Pharbitisnil(Linn.)Choisy)成熟干燥的种子，在我国传统医学里常用来治疗大小便不利、水肿腹胀等症。张虹等的《黑丑提取物的体内外抗肿瘤活性及其初步机制》曾报道黑丑的乙醇提取物具有抗肿瘤的功效。杨广成等在《牵牛子(黑丑)挥发油成分研究》中对黑丑中的挥发油成分进行了分析。林文群等在《牵牛子(黑丑)化学成分的初步研究》中，对黑丑中的脂肪酸成分、氨基酸组成及矿物元素进行了研究。然而目前尚未见到有关黑丑多糖研究的报道。也未有关于黑丑多糖提取的相关方法报道。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提出一种黑丑多糖的提取方法，方案工艺简单，操作便捷，多糖的得率较高，可达25.5％，经过分级醇沉后多糖的纯度也很高，有望实现工业化的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种黑丑多糖的提取方法，其步骤为：

1)、将黑丑经过手工除杂，粉碎过筛，粉末依次经30-60℃的石油醚、95％乙醇回流处理3h，再经80±2℃干燥24h，即得脱脂脱色黑丑粉末，装棕色玻璃瓶置于干燥器内保存备用；

2)、按照液料比51∶1(mL/g)进行浸提，水温维持85±-1℃，提取4小时15分钟，离心收回上清液；

3)、在真空度低于0.1MPa，50～55℃条件下将上清液浓缩到原体积的1/4～1/3，得浓缩液；加入浓缩液体积20％的氯仿和4％的正丁醇，间歇振荡15min，离心10min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复步骤三直到无沉淀生成；

4)、上清液经喷雾干燥后得灰白色粗多糖。

所述的粗黑丑多糖经复溶后，缓缓加入无水乙醇，使乙醇浓度达到30％，静置6h后，离心得30％醇沉多糖；上清液里继续加入乙醇至浓度达50％，静置6h后，离心得50％醇沉多糖；再向上清液中加乙醇使浓度达80％，静置离心后得80％醇沉多糖；分别冷冻干燥后均为白色粉末。

本发明的有益效果是提出了一种黑丑多糖的提取方法，方案工艺简单，操作便捷，多糖的得率较高，可达25.5％，经过分级醇沉后多糖的纯度也很高，有望实现工业化的应用。

附图说明

图1为本发明的流程框图。

图2为原料颗粒度对多糖得率的影响图。

图3为温度对黑丑多糖得率的影响图。

图4为浸提时间对多糖得率的影响图。

图5为料液比对多糖得率的影响图。

图6为各因素间交互影响图：

a为时间和温度对多糖得率的影响图；

b为液料比和温度对多糖得率的影响图：

c为液料比和时间对多糖得率的影响图。

图7为黑丑多糖的红外吸收光谱图。

图8为黑丑多糖对DPPH自由基的清除效果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述：

如图1所示，一种黑丑多糖的提取方法，其步骤为：

1)、将黑丑经过手工除杂，粉碎过筛，粉末依次经30-60℃的石油醚、95％乙醇回流处理3h，再经80±2℃干燥24h，即得脱脂脱色黑丑粉末，装棕色玻璃瓶置于干燥器内保存备用。

2)、按照液料比51∶1(mL/g)进行浸提，水温维持85±-1℃，提取4小时15分钟，离心收回上清液。

3)、在真空度低于0.1MPa，50～55℃条件下将上清液浓缩到原体积的1/4～1/3，得浓缩液；加入浓缩液体积20％的氯仿和4％的正丁醇，间歇振荡15min，离心10min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复步骤三直到无沉淀生成。

4)、上清液经喷雾干燥后得灰白色粗多糖。

所述的粗黑丑多糖经复溶后，缓缓加入无水乙醇，使乙醇浓度达到30％，静置6h后，离心得30％醇沉多糖；上清液里继续加入乙醇至浓度达50％，静置6h后，离心得50％醇沉多糖；再向上清液中加乙醇使浓度达80％，静置离心后得80％醇沉多糖；分别冷冻干燥后均为白色粉末。

本发明的具体实现原理如下：

试验例：

1.1材料

黑丑购买自新乡市健民大药房，产地产于河南。经简单手工除杂后，粉碎过筛，将黑丑粉末依次经石油醚(30-60℃)、95％乙醇回流处理3h，再经80±2℃干燥24h，即得脱脂脱色黑丑粉末，装棕色玻璃瓶置于干燥器内保存备用。DPPH(二苯基苦基苯肼)、葡萄糖标准品，sigma公司；石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚等均为国产分析纯，除苯酚使用前经过重新蒸馏外，其他试剂未进行任何处理。实验中用水均为去离子水。

1.2主要仪器

UV2550紫外可见分光光度计，岛津(日本)；R-206旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；FA2104电子分析天平，上海跃平仪器有限公司；HH-S.Z恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；FD-1A-80真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1黑丑多糖提取工艺脱脂脱色黑丑粉末→热水提取→离心→浓缩→脱蛋白→干燥→粗多糖→复溶→分级醇沉→离心→冻干→白色黑丑多糖

1.3.2标准曲线的绘制称取0.1002g已干燥至恒重的D-葡萄糖标准品，用水定容至100mL，得1mg/mL葡萄糖标准品储备液。取10mL储备液加水定容到100mL，得0.1mg/mL的葡萄糖标准液。分别取0、0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mL标准液置10mL容量瓶中用水定容至刻度，摇匀，分别取1.0mL置刻度试管中，再依次加入5％苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，振荡混匀后于室温下反应30min，然后以0管为参比，于490nm波长下测定吸光度A值，平行测定三次，对平均值进行线形回归，得回归方程：A＝0.09737×C-0.00306(R＝0.99986；SD＝6.15％；C的单位为μg/mL)

1.3.3多糖提取率吸取样品液1.0mL，按上述步骤测定吸光度值，以标准曲线方程计算总糖含量。

1.3.4单因素试验影响多糖得率的因素比较多，本试验主要从原料粒度、提取温度、提取时间、料液比等几方面进行单因素试验。原料粒度选择≤85、85～60、60～40、＞40目四个水平，提取温度选择60、70、80、90、100℃五个水平，提取时间选取2、3、4、5、6、7h六个水平，料液比选取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60五个水平。分别进行试验。

1.3.5响应面分析的实验方案和因素水平根据Box-Behnken中心组合试验原理，以提取时间、浸提温度和液料比三个因子为自变量，以多糖提取率为响应值采用三因素三水平的响应分析法进行试验设计。

2.结果与讨论

2.1单因素试验对多糖得率的影响

由图2可知，随着颗粒度的减小，多糖的得率在增大，但粒度太小无论是过滤还是离心都不方便，而且各因素间差别不大，故不再对颗粒度做进一步的研究。

由图3可知，随着温度的升高多糖的得率也相应升高，尤其是当温度低于80℃时变化更为明显。虽然在100℃时有较高的多糖得率，但考虑到温度过高提取液的散失较为严重，而且操作起来也不方便，因此选取80℃作为合适的提取温度。

由图4可知，在4个小时以内黑丑多糖的得率会随着提取时间的延长而显著提高，当超过4小时后，得率会有小幅度下降，可能与加热时间的延长支链淀粉膨胀糊化，当冷却时有部分多糖被吸附有关。因此选择4小时作为适当的浸提时间。

由图5可知，黑丑多糖得率会随着溶剂体积的增加而相应增大，并且在1∶50时达到最大，这可能是因为在该料液比条件下多糖的溶出达到了一个最大值，此后随着溶剂体积的增加多糖的得率会相应减小，可能与随着溶剂体积的增加在后处理过程中造成的损失较多有关。

2.2响应面法优化提取工艺

在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析法，试验因子编码及水平见表2.

表2响应面因素水平设计

对黑丑多糖提取工艺进行响应面分析，具体试验方案见表3

表3响应面设计方案与试验结果

实验号	A	B	C	得率(％)
					1	-1	-1	0	10.56
2	1	-1	0	11.30
					3	-1	1	0	15.98
4	1	1	0	22.27
					5	-1	0	-1	11.43
6	1	0	-1	16.30
					7	-1	0	1	19.57
8	1	0	1	26.29
					9	0	-1	-1	11.52
10	0	1	-1	13.83
					11	0	-1	1	19.00
12	0	1	1	18.03
					13	0	0	0	24.16
14	0	0	0	25.06
					15	0	0	0	20.58
16	0	0	0	22.51
					17	0	0	0	21.04

因素间的交互影响固定任何一个因素在其编码值为0的水平，分析另外两个因素交互对多糖得率的影响，结果如图6所示。

图6直观地反映了各因素交互作用对黑丑多糖得率的影响，比较三组图可以得知，液料比因素曲线较陡峭，对多糖得率的影响最为显著，其次是提取温度，最后是提取时间。

2.3方程求解及最佳条件对表3进行方差分析后，回归拟合得回归方程为：

Y＝22.67+2.33A+2.22B+3.73C+1.39AB+0.46AC-0.82BC-2.42A²-5.22B²-1.85C²

对回归方程取一阶偏导等于0，整理得方程组：

$\left\{\begin{array}{c}2.33-4.84A+1.39B+0.46C=0\\ 2.22+1.39A-10.44B-0.82C=0\\ 3.73+0.46A-0.82B-3.70C=0\end{array}\right.$

解方程组得：A＝0.64；B＝0.22；C＝1.04，即最佳提取条件为86.4℃，时间4.22h，液料比为50.4∶1(mL/g)。考虑到实际操作的方便性，将最佳提取条件修正为：提取温度85℃、提取时间4.25h、液料比为51∶1(mL/g)。

为了验证响应面法的可行性，采用上述最优提取条件进行黑丑多糖得率验证试验，5次平行试验得到实际得率为25.29％，与理论预测值25.52％误差约为0.91％，表明该优化条件参数可靠，具有实用价值。验证试验结果见表4。

表4验证性试验结果

3.黑丑多糖的纯化与精制

将粗黑丑多糖复溶后，向溶液里缓缓加入无水乙醇，使乙醇浓度达到30％(V/V，下同)，静置6h后，离心得30％醇沉多糖；向上清液里继续添加乙醇使其浓度达50％，静置6h后，离心得50％醇沉多糖；再向上清液中加乙醇使浓度达80％，静置离心后得80％醇沉多糖。分别冷冻干燥后均为白色粉末，它们的红外光谱图如图7所示。

4.黑丑多糖的抗氧化活性研究

将三种多糖分别配成10、20、40、60、80、100mg/L的溶液，取1.0mL多糖溶液加入到2.0mL0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液中，混匀后于25℃避光浴孵30min，然后在517nm波长下测混合液的吸光度值，记为A₁。以等体积的水代替多糖溶液，其吸光度值分别记为A₀。多糖对DPPH的清除率按式Sc(％)＝(1-A₁/A₀)×100进行计算。

由图8可知，黑丑多糖对DPPH自由基具有一定的清除活性，而且随着质量浓度增大清除活性也在增强，但其清除活性比同浓度的Vc要低的多。

Claims (1)

1.一种黑丑多糖的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将黑丑经过手工除杂，粉碎过筛，粉末依次经30-60℃的石油醚、95％乙醇回流处理3h，再经80±2℃干燥24h，即得脱脂脱色黑丑粉末，装棕色玻璃瓶置于干燥器内保存备用;

步骤二、按照液料比51：1(mL/g)进行浸提，水温维持85±1℃，提取4小时15分钟，离心收回上清液;

步骤三、在真空度低于0.1MPa，50～55℃条件下将上清液浓缩到原体积的1/4～1/3，得浓缩液；加入浓缩液体积20％的氯仿和4％的正丁醇，间歇振荡15min，离心10min，合并上清液测其体积，继续加相应体积的氯仿和正丁醇，并重复步骤三直到无沉淀生成;

步骤四、上清液经喷雾干燥后得灰白色粗多糖;

所述的灰白色粗多糖经复溶后，缓缓加入无水乙醇，使乙醇浓度达到30％，静置6h后，离心得30％醇沉多糖；上清液里继续加入乙醇至浓度达50％，静置6h后，离心得50％醇沉多糖；再向上清液中加乙醇使浓度达80％，静置离心后得80％醇沉多糖；分别冷冻干燥后均为白色粉末。