CN101117356A - 一种水不溶性β-1,3/1,6-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水不溶性β－1，3/1，6－葡聚糖的制备方法。该方法，包括下述步骤：1)将酵母细胞壁的悬浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，离心收集沉淀；2)将步骤1)得到的产物，在NaOH溶液中，在75～90℃下，进行搅拌处理，然后离心收集沉淀；3)将步骤2)得到的沉淀在体积百分浓度为2～8％的乙酸溶液中，搅拌处理，离心收集沉淀；4)将步骤3)酸处理后离心得到的沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次重悬搅拌洗涤，乙醚处理后静置12～24小时，离心收集沉淀干燥得到水不溶性β－1，3/1，6－葡聚糖。本发明方法操作简单，获得的β－1，3－葡聚糖和1，6－葡聚糖产品具有较高的纯度和得率，产物中蛋白含量、脂肪含量均小于1％。

Description

一种水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法。

背景技术

酵母是一种单细胞真菌，是迄今为止人类使用最广泛、经济价值最高的微生物。国际FDA认可啤酒酵母为安全的微生物，已经在饮料和食品的生产中广泛应用。目前，我国年消耗酵母约2000吨，产生约3吨的废酵母泥。由于酵母细胞壁是啤酒制造产业的主要副产物，而且现今对其的主要处理方法就是作为粗饲料廉价售出或者直接排放，给环境造成很大的资源浪费和污染。

已经有多个研究结果表明，纯净的酵母细胞壁对动物具有明显的免疫促进作用，而且还表现出促进生长作用。进一步的证据表明，其主要机理是其中含有的β-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖具有相应的免疫和生长促进作用，已有大量试验研究结果表明，β-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖是效果显著的动物机体功能调节剂。而且，随着饲用抗生素的逐渐禁用，安全、可替代的生物饲料添加剂正逐渐成为行业主流。

β-1，3/1，6-葡聚糖是酵母β-葡聚糖的正式学名。其结构为：葡萄糖分子以β-1，3-糖苷键连接形成主链，以β-1，6-糖苷键连接形成支链。葡萄糖分子从主链上以β-1，6连接发出分枝。

-[-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-(1，3)-β-D-G-]-

   |1，6

β-D-G-(1，6)-β-D-G-(1，6)-β-D-G

国际国内制备饲料用免疫调节剂β-1，3/1，6-葡聚糖的主要方法为化学提取法。但采用化学方法提取的β-1，3/1，6-葡聚糖的得率偏低(＜17％)、β-1，3/1，6-葡聚糖产品纯度不高(＜85％)以及成本较高。在美国，饲料用β-1，3/1，6-葡聚糖的价格大概为2000～5000美元/千克(视产品纯度而定，有些甚至可达到10000美元/千克)。甘露聚糖的主要生产方式则多为微生物发酵方法，费时、费力、结果不稳定(纯度＜75％，得率＜15％)且成本较高。

酵母细胞壁中直接提取的β-1，3/1，6-葡聚糖为水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖，其提取方法主要包括碱提取一步法、酸提取一步法和酸碱复合提取法等三类方法。

碱一步提取法以suphantharika等(2003)方法为代表，其旨在优化提取工艺，提高提取效率，综合考虑碱浓度、提取时间、提取温度以及碱溶液与底物酵母细胞壁的混合比例。该方法采用逐步确定参数法，分别考虑各个影响因素。得出各参数分别为：混合比例为1∶5(酵母细胞壁∶碱液)、提取时间1h、温度为90℃、碱浓度为4％(NaOH)，得到产品的得率为19～22％。此方法工艺简单、提取物得率较高、产物中蛋白含量也较低，但提取物中β-1，3/1，6-葡聚糖的含量也较低。

酸一步提取法的方法范围较广，主要是所采用的酸的种类和浓度都变化很大。但酸提取的主要缺点就是提取产物中β-葡聚糖的含量也较低，原因是在提取过程中为酸所水解(降解)的β-葡聚糖较多。-般情况下不采用酸提取法。

近些年来各国主要采用的方法主要集中于酸碱复合方法的建立、改进和参数优化上。β-葡聚糖得率、纯度等随工艺流程变化有很大不同。比较有代表性的主要是Stefan等(2003)研究的结果，其工艺温和、pH无严格限制，旨在尽可能保持细胞壁中β-葡聚糖的结构，同时提高提取物得率。其提取物经检测可得，β-葡聚糖的含量为85％，甘露糖为6％，蛋白质含量为5％，含微量的脂类，该工艺得率可达细胞壁干重的26％。由于其在中试条件下的结果表明，葡聚糖含量还可进一步提高，甘露聚糖和蛋白含量进一步下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法。

本发明所提供的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

1)酶解处理：将酵母细胞壁的悬浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解，离心收集沉淀；

2)碱处理：将步骤1)得到的酶解后的产物，在0.5～1.5mol/L的NaOH溶液中，在75～90℃下，进行搅拌处理2～3小时，然后离心收集沉淀并洗涤；

3)酸处理：将步骤2)得到的沉淀在体积百分浓度为2～8％的乙酸溶液中，在室温条件下，搅拌处理2～3小时，离心收集沉淀并洗涤；

4)脱脂、去除蛋白：将步骤3)酸处理后离心得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚依次重悬搅拌洗涤30分钟～1小时，然后静置12～24小时，离心收集沉淀干燥得到水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

所述方法中，所述步骤1)中，所述酶解温度优选为37℃。所述溶菌酶的添加量为0.5～3mg/g(10000～60000U/g)酵母细胞壁干重，优选为1mg/g(20000U/g)酵母细胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母细胞壁的悬浮液中的浓度为2000～12000U/ml，优选为4000U/ml。

所述方法中，所述步骤1)中，所述酶解时间可为30～60分钟，优选为30分钟。

所述方法中，所述步骤2)中，所述NaOH溶液的浓度优选为1mol/L；所述碱处理的温度优选为85℃，碱处理时间优选为3小时。

所述步骤2)中，所述酶解后的产物干重与所述NaOH溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml。优选为1g∶5-6ml。

所述方法中，所述步骤3)中，所述乙酸溶液的体积百分浓度优选为4％；所述室温条件为18～25℃；所述酸处理时间优选为2小时。

所述方法中，所述步骤3)中，所述步骤2)得到的沉淀干重与所述乙酸溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml，优选为1g∶10-11ml。

所述方法中，还可包括将所述步骤1)、2)和3)中收集的沉淀用水洗涤。

上述方法中所述步骤2)离心得到的上清液可以进一步提取得到甘露聚糖，所述提取甘露聚糖步骤可包括：①将所述步骤2)离心得到的上清液，调节pH值至中性，加入中性蛋白酶，在温度为37℃，酶解3小时得到棕黄色悬浊液，离心取上清液；或者将所述步骤2)离心得到的上清液调节pH值至5.5(所选酸为乙酸或稀盐酸，但酸的选择会影响最后甘露寡聚糖的得率和纯度，乙酸处理略好于盐酸，可依照成本自行决定)，得棕黄色悬浊液，离心(离心速度为2400rpm，离心时间为10min)取上清液；②将步骤①所得上清液、质量百分含量为16％的CTAB溶液和质量百分含量为0.5％硼酸钠-乙酸钠缓冲液按照体积比为20∶5∶10的比例配成混合溶液，室温静置时间为48h，离心(离心速度为3000rpm，离心时间为10min)，保留上清液进行喷雾干燥可得甘露聚糖(具体操作流程请见附图2)。

本发明基于酶针对特定底物具有高效催化活性这一特点，采用溶菌酶(工业化生产较易且成本低廉)这一特异性酶(β-1，4-糖苷键水解活性)，水解存在于酵母细胞壁中的几丁质成分(酵母细胞壁中的几丁质为β-1，4-糖苷键连接形式，与β-1，3-D-葡聚糖交联形成网状结构，使得酵母细胞壁不能溶于水、稀酸、碱和有机溶剂)。经溶菌酶水解破坏，原本坚固缔合的酵母细胞壁内的网状结构变得松散，在下一步的碱处理较易完成彻底破壁(浓碱也可完成较彻底的破壁，但其容易造成工业危险且易造成环境污染)。经验证，经过溶菌酶处理，酵母细胞壁的破壁效率达98％以上，再经过碱处理可达100％(直接碱处理最高只能达到85～90％左右)。本发明还降低了碱处理时碱的浓度(用量)，在改进破壁效率的同时降低了成本、减少了环境污染的危险。本发明采用了多重有机溶剂洗涤的方法，降低了最终产品中的蛋白质和脂肪含量，有利于产品在动物生产中发挥有益作用。

本发明方法操作简单，分别考虑各个影响因素，确定参数的优选数据范围，使获得的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖产品具有较高的纯度和得率，产物中蛋白含量为和脂肪含量较小。本发明的方法一次处理工业副产物——酵母细胞壁，可同时获得水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖。经动物试验验证均为适合动物生产实践中应用的免疫调节剂。

附图说明

图1为水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法流程图。

图2为甘露聚糖的制备方法流程图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备及其副产物甘露聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将100g酵母细胞壁(产品购自湖北宜昌安琪酵母股份公司)、100mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合，37℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)离心20分钟去上清得到95.3g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得酵母细胞壁酶解后的产物95.3g加入500ml 1M NaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与1M NaOH溶液的质量/体积比约为1g∶5ml的比例添加)，在85℃条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为3小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到29.5g沉淀和上清液(可继续用于提取甘露聚糖)。将沉淀用水洗涤三遍，得到28.7g沉淀。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物28.7g加入300ml体积百分含量为4％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与4％乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到22.2g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到21.5g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(21.5g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为1小时，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为1小时，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为1小时，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到20.1g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，为91.5％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果为20.1％；分子量以改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weightusing SEC with calcofluor detection in cereal extracts.Cereal Chemistry,80(4)：485-490)测定，约为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-

-

   |1，6

   β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.15％、脂肪含量为0.43％。

二、甘露聚糖的制备

上述步骤一中步骤2所述的碱处理后离心得到的上清液用于制备甘露聚糖(具体操作流程请见图2)。具体步骤如下所述：

1、将步骤一中步骤2所述的碱处理后离心得到的上清液分成两份，用HCl调整pH值至中性。

2、将步骤1中得到的两份上清液，分别进行如下酶法处理或酸法处理：

酶法处理：在上清液中加入26.5g(927.5KU，3500U/ml上清液)中性蛋白酶(35000U/g)，匀速搅拌器中速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟，下同)，处理时间3小时，处理温度37℃，酶浓度0.1g/mL(3500U/ml)，得到棕黄色悬浊液，离心(离心速度3000rpm，离心时间10min，上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机，下同)取上清液待处理。

酸法处理：将上清液用乙酸溶液(体积百分含量为36％)调节pH值至5.5，得棕黄色悬浊液，离心(离心速度2400rpm，离心时间10min)取上清液待处理。

3、将步骤2酶法处理或酸法处理得到的上清液分别与质量百分含量为16％的CTAB溶液和含有质量百分含量为0.5％的硼酸钠和质量百分含量为0.5％的乙酸钠的硼酸钠-乙酸钠缓冲液按照体积比为20∶5∶10的比例配成混合溶液，室温静止48h，离心(离心速度3000rpm，离心时间10min)，分别取上清液进行喷雾干燥，结果酶法处理得到18.73g甘露聚糖粉末，酸法处理得到18.36g甘露聚糖粉末。

4、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，结果表明上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为88.49％；上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为88.71％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果表明上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的得率为18.73％；上述酸法处理得到的甘露聚糖粉末的得率为18.36％；；分子量以改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry,80(4)：485-490)测定，约为30KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G--

   |1，2

   α-D-G-(1，2)-(或者)α-D-G-(1，3)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为0.45％、脂肪含量为0.33％。

实施例2、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备及其副产物甘露聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将50g酵母细胞壁、100mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和250ml水混合，35℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为60分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机)离心25分钟去上清得到47.80g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得酵母细胞壁酶解后的产物47.80g加入500ml 0.5MNaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与Na0H溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在75℃条件下用匀速搅拌器中速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)，搅拌时间为3小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到上清液510ml继续用于提取甘露聚糖，和12.6g沉淀(用于提取水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖)。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物12.6g加入65ml体积百分含量为2％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶5ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到9.03g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到8.95g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(8.95g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为30分钟，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到8.66g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，为89.51％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果为17.31％；分子量按照改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecularweight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts.CerealChemistry,80(4)：485-490)测定，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的分子量为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-

-

   |1，6

   β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.14％、脂肪含量为0.52％。

二、甘露聚糖的制备

上述步骤一中步骤2所述的碱处理后离心得到的上清液按照实施例1步骤二的方法制备甘露聚糖(具体操作流程请见图2)，将得到的甘露聚糖粉末采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，结果表明上述酸法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为85.31％；上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为85.52％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果表明上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的得率为17.63％，上述酸法处理得到的甘露聚糖粉末的得率为16.95％；分子量以改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecularweight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts.CerealChemistry,80(4)：485-490)测定，约为30KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G-

-

   |1，2

   α-D-G-(1，2)-(或者)α-D-G-(1，3)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为0.54％、脂肪含量为0.39％。

实施例3、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备及其副产物甘露聚糖的制备

一、水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备

水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备操作流程如图1所示，具体步骤如下所述：

1、酵母细胞壁的酶解：将100g酵母细胞壁、300mg(20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合，40℃条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后以3000转/分钟(上海安亭科学仪器厂，DL6000B型冷冻离心机)离心20分钟去上清得到95.4g沉淀，即为酵母细胞壁酶解后的产物。

2、碱处理：将步骤1中所得酵母细胞壁酶解后的产物95.4g加入1000ml 1.0MNaOH溶液中(即按照破壁后的产物干重与NaOH溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在90℃条件下用匀速搅拌器中速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)，搅拌时间为2.5小时，然后以3600转/分钟离心20分钟，得到上清液510ml继续用于提取甘露聚糖，和28.7g沉淀(用于提取水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖)。

3、酸处理：将步骤2中所得碱处理后的产物28.7g加入300ml体积百分含量为8％乙酸溶液中(即按照碱处理后的产物干重与乙酸溶液的质量/体积比约为1g∶10ml的比例添加)，在室温条件下用匀速搅拌器中速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，200～300转/分钟)搅拌，搅拌时间为2.5小时，之后以3000转/分钟离心20分钟去上清。得到20.1g沉淀，将沉淀用水洗涤三遍。将沉淀用水洗涤三遍，得到19.0g沉淀。

4、乙醇洗涤：将步骤3中所得酸处理后的产物(19.0g)按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水乙醇中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器中速搅拌，搅拌时间为50分钟，之后以3000转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

5、丙酮洗涤：将步骤4中所得乙醇洗涤后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量加入到无水丙酮中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速搅拌(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)，搅拌时间为40分钟，之后以2400转/分钟速度离心20分钟去上清，收集沉淀。

6、乙醚洗涤：将步骤5中所得丙酮处理后的沉淀产物按照0.2-0.25g产物(干重)/ml的量于通风橱中加入到无水乙醚中，室温(18～25℃)条件下用匀速搅拌器慢速(上海标本模型厂，骠马牌可调速搅拌器，100～150转/分钟)搅拌，搅拌时间为30分钟，之后将容器盖盖后室温静置12～24小时。然后，2400转/分钟离心20分钟去上清，干燥(气流吹干或减压蒸干或冷冻干燥)，得到18.5g水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

7、所得产物纯度采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，为90.37％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的得率为18.54％；分子量按照荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry,80(4)：485-490)测定，结果表明上述得到的水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的分子量为800～850KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-Glcp-(1，3)-β-D-GlcpNAc-

-

   |1，6

   β-D-Glcp-(1，6)-β-D-Quip-(1，6)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为1.04％、脂肪含量为0.40％。

二、甘露聚糖的制备

上述步骤一中步骤2所述的碱处理后离心得到的上清液按照实施例1步骤二的方法制备甘露聚糖(具体操作流程请见图2)，将得到的甘露聚糖粉末采用总糖测定法和薄层层析测定法确定，结果表明上述酸法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为86.63％；上述酶法处理得到的甘露聚糖粉末的纯度为86.47％；得率采用产物量/所用细胞壁量相比，结果为表明上述酶法得到的甘露聚糖粉末的得率为17.25％，酸法得率为17.13％；分子量以改进荧光法(Rinsten，L.，T.Stenberg and R.Andersson.2003.Determination of β-glucan molecular weight using SEC with calcofluordetection in cereal extracts.Cereal Chemistry,80(4)：485-490)测定，约为30KD。结构检测经红外光谱和核磁共振分析如下所示：

-「-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G-(1，6)-α-D-G-

-

   |1，2

   α-D-G-(1，2)-(或者)α-D-G-(1，3)

产品的蛋白质和脂肪含量采用国标方法进行，分别为：蛋白含量为0.41％、脂肪含量为0.39％。

Claims (9)

1.一种水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：

1)酶解处理：将酵母细胞壁的悬浮液中加入溶菌酶，在35～40℃下，酶解30～60分钟，离心收集沉淀；

2)碱处理：将步骤1)得到的酶解后的产物，在0.5～1.5mol/L的NaOH溶液中，在75～90℃下，进行搅拌处理2～3小时，然后离心收集沉淀；

3)酸处理：将步骤2)得到的沉淀在体积百分浓度为2～8％的乙酸溶液中，室温下，搅拌处理2～3小时，离心收集沉淀；

4)脱脂、去除蛋白：将步骤3)酸处理后离心得到的沉淀依次用无水乙醇、丙酮和乙醚依次重悬搅拌洗涤30～60分钟，乙醚处理完毕后静置12～24小时，离心收集沉淀干燥得到水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述酶解温度为37℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述溶菌酶的添加量为10000～60000U/g酵母细胞壁干重，优选为20000U/g酵母细胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母细胞壁的悬浮液中的浓度为2000～12000U/ml，优选为4000U/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述酶解时间为30～60分钟，优选为30分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述NaOH溶液的浓度为1mol/L；所述碱处理的温度为85℃，碱处理时间为3小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述酶解后的产物干重与所述NaOH溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml，优选为1g∶5-6ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述乙酸溶液的体积百分浓度为4％；所述酸处理温度室温条件为18～25℃，酸处理时间为2小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述步骤2)得到的沉淀干重与所述乙酸溶液的质量/体积比为1g∶5～12ml，优选为1g∶10-11ml。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将所述步骤1)、2)和3)中收集的沉淀用水洗涤。

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