CN107446825B - 一株银耳菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明筛选出一株高产银耳多糖的银耳（Tremella fuciformis）孢子菌株HX5‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2017271。本发明还提供了一种利用银耳孢子HX5‑1发酵生产高分子银耳多糖的方法，采用种子液制备、三阶段通气发酵、醇沉、脱色、除蛋白、精制、干燥等步骤得到银耳多糖产品。本发明通过三阶段通气发酵，银耳多糖产率可达18 g/L；经过纯化、精制得到银耳多糖产品，总糖含量大于80%，分子量大于1500 KDa，蛋白质含量小于0.5%，含量高、分子量大，在银耳多糖工业化生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株银耳菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株银耳孢子及该菌种在生产高分子量银耳多糖的应用，属于微生物发酵工程领域。
背景技术
银耳多糖是一种酸性杂多糖，从银耳(Tremella fuciformis Berk)子实体、银耳孢子或银耳包子发酵液中得到的，其主链结构是由α-(1→3)糖苷键连接的甘露聚糖，支链由葡萄糖醛酸和木糖组成。
银耳多糖具有改善机体免疫功能及提升白细胞的作用：可显著提高实验动物网状内皮细胞的吞噬功能，有促进非特异性免疫作用，提高免疫球蛋白、血清总补体的水平。银耳多糖还能增加脑和肝组织中的SOD活力，具有延缓衰老的作用。此外，银耳多糖还能保护胰岛β细胞，降低高血压大鼠的血清中胆固醇水平，降低血小板粘附率和血液粘度，具有降血糖、调节血脂预防血栓的功效。另外，银耳多糖还能够保护胃粘膜，用于治疗急性胃溃疡。因此，银耳多糖广泛应用于医药及保健品中。
银耳多糖具有卓越的保湿锁水能力，应用于护肤类化妆品，具有修复表皮、增加表皮含水量的功能，提高角质层水分含量，提高皮肤电导率积分值，保水能力，降低水释放常数，能提高皮肤的屏障功能，防止水分从皮肤的蒸发。而且，银耳多糖具有良好的润滑性和成膜性，添加银耳多糖的护肤品涂抹时润滑感明显，具有良好的手感，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，使皮肤具有良好的滑爽感和湿润感，不收缩，干爽不紧绷，对皮肤起到保护作用。在护发品产品中，可以在头发表面形成一层保护膜，起到保湿、润滑，消除静电。此外，银耳多糖还具有一定的清除羟基自由基的能力，可作为抗衰老成分应用到化妆品中。银耳多糖是一种天然保湿原料，不但能够高效保湿，而且具有抗衰老、抗氧化的作用，因此往往被用于高档化妆品中。
市面上获得银耳多糖的方法为子实体提取法，相比提取法，银耳孢子发酵法具有生产周期短，多糖纯度高，易产业化等优点。目前孢子发酵法生产银耳多糖，分子量低，产率低，无法满足市场对大分子银耳多糖的需求。
发明内容
为解决孢子发酵法生产银耳多糖，分子量低，产率低的问题，本发明提供了一株从自然界中筛选的银耳（银耳芽孢）5-1及该菌株在发酵法生产银耳多糖中的应用。
本发明的另一目的是提供一种工业化银耳孢子发酵培养基。
本发明的再一目的是提供一种发酵法生产高分子量银耳多糖的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一株银耳（银耳芽孢）（Tremella fuciformis）5-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2017271。
所述银耳（银耳芽孢）的ITS序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
所述银耳（银耳芽孢）5-1在生产银耳子实体中的应用。
所述银耳（银耳芽孢）5-1在生产银耳多糖中的应用。
一种银耳孢子发酵培养基，包括以下组分：大麦蛋白胨3-8g/L，酵母蛋白胨 3-8g/L，葡萄糖10-20g/L，磷酸二氢钾 1-5 g/L，硫酸镁 1-3 g/L和VB110-20 mg/L。
一种发酵法生产高分子量银耳多糖的方法，采用以下步骤：
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1接入种子培养基，摇瓶发酵，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液接入发酵罐培养基中，通气搅拌培养，流加方式间歇补料，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液；
（3）醇沉：将氯化钠加入步骤（2）发酵液中溶解，以乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，离心，将上清液用活性炭吸附后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值，处理后过滤，得到精滤液；
（6）精制：加入氯化钠，充分溶解，用乙醇沉淀精滤液，并用乙醇反复洗涤沉淀；
（7）干燥：将洗涤后的沉淀进行真空干燥得高分子量银耳多糖产品。
所述步骤（1）的种子培养基为银耳发酵培养基，pH值为5.0-7.0；转速为200-500rpm，发酵时间为2-3天。
所述步骤（2）的液体培养基为银耳发酵培养基，发酵期间用40% NaOH调控pH值为5.0-7.0；所述接种量为1-10%，优选为3-5%；温度为26-35℃，优选为28-32℃。
所述步骤（2）的搅拌速度为100-300rpm；通气量为：初始1-2vvm，24h后1-3vvm，48h后2-5vvm至发酵结束；发酵结束时，发酵液的pH值为6.0-7.0，粘度大于15000mPa·s，银耳多糖的含量为10-20 g/L。
所述步骤（3）的氯化钠添加量为发酵液的1-5% （w/v）；乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为发酵液的2-3倍。
所述步骤（4）的粗品用2-5倍水溶解，使其粘度为100-120 mPa.s；离心条件为5000-10000 r/min，10-30 min；活性炭粒径为200目，用量为0.5-1.5%（w/v）；吸附时间为0.5-2h，吸附温度为40-60℃。
所述步骤（5）滤液pH值为大于10.5，处理时间为1-2h；精滤介质为孔径0.45μm的滤芯。
所述步骤（6）氯化钠的添加量为精滤液的1-5% （w/v）；乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为精滤液体积的3-4倍。
所述步骤（7）真空干燥的温度为小于60℃；干燥至失重小于10%；所述高分子量银耳多糖产品，总糖含量大于80%，分子量大于1500 KDa，蛋白质含量小于0.5 %。
本发明具有以下优点：
本发明发酵培养基采用筛选得到大麦蛋白胨，较利于银耳（银耳芽孢）HX5-1生产高分子银耳多糖；同时相对分子质量较小，易于被微生物生长所吸收，且其碳水化合物总含量较高，能提供更多的营养物质以及荚膜的形成，进而提高微生物的生长浓度和产糖量。而酵母蛋白胨营养丰富，可促进微生物的生长和代谢，提高生产效率。植物蛋白胨和酵母蛋白胨相较于动物源蛋白胨无可能存在致病性和风俗禁忌问题的弊端，此种配方利用范围更加广泛。本发明通过三阶段控制通气量，利于银耳孢子生长及高分子量银耳多糖的积累，银耳多糖高产量。
发酵法生产的银耳多糖液，杂质多为蛋白质及发酵液残留物质，本发明经初步乙醇沉淀得到的多糖粗品，可去除培养基中残留的小分子杂质；通过活性炭吸附可去除颜色物质等杂质；在吸附过程中进行加热，可对大分子蛋白质进行热变性絮凝为沉淀，经过滤可去除。
本发明的银耳（银耳芽孢）5-1菌株通过三阶段通气发酵，银耳多糖产量高；通过醇沉-脱色-除蛋白-精制-干燥，可获得总糖含量大于80%、分子量大于1500 KDa、蛋白质含量小于0.5 %的高分子量银耳多糖产品，含量高、杂质少，分子量大，在银耳多糖工业化生产中具有广阔的应用前景。
菌种保存信息
银耳（银耳芽孢）（Tremella fuciformis）5-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保存地址为：中国武汉 武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017271，保存日期为2017年5月17日。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 菌株的分离纯化与鉴定
选择种耳：在全国各地采集挑选朵大、色白、肉厚、展片正常、无杂菌和病虫感染及成熟度达80 -90 % 的野生银耳分别编号后作为种耳。将种耳以无菌水消毒后，除去孢子上的杂菌，用无菌纱布或吸水纸擦干耳片表面。
弹射孢子：取一小片选好的种耳，使其悬在三角瓶的中间，不触及瓶壁或瓶下面的培养基，种耳距培养基表面4-5 cm。将三角瓶置于培养箱内，30℃培养2天，当培养基表面长有雾状的孢子及小菌落时，取出种耳，塞棉塞，继续培养。2-3 天后，在培养基表面可见到乳白色、半透明、略有光泽、表面粘稠、边缘光滑、中间隆起的芽孢菌落，此即银耳孢子。
根据上述菌落特征，筛选出14株菌。在基础培养基（成分为：大豆蛋白胨 10 g/L、葡萄糖 20g/L、磷酸二氢钾3 g/L、硫酸镁1.5 g/L、VB1 15mg/L、pH值 7.0）进行摇瓶发酵，装液量为300mL，30℃培养8天，发酵结束，测定其黏度和多糖含量。其结果如下表所示：
表1 各菌种产多糖性状
由上表看出，采集自四川省通江的银耳（银耳芽孢）5-1菌株银耳多糖产量最高、分子量最大，具有产业化应用价值。上述菌株的ITS基因序列如SEQ ID NO:1所示，与GenBank中银耳Tremella fuciformis的ITS序列相似度为100%。
实施例2 菌株发酵液体培养基选择
2.1 氮源种类
将银耳（银耳芽孢）5-1的孢子接入基础培养基（胰蛋白胨 10 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得工作种子液；
将工作种子液以3%接种量接入装液量为300 mL的三角瓶中，培养基配方如下表所示，30℃，转速200 r/min，培养144 h后结束发酵，并测定其黏度及多糖含量。
表2 不同氮源培养基产多糖量
注：（1）大豆蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB115mg/L；
（2）酵母蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB1 15mg/L；
（3）大麦蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB1 15mg/L；
（4）大豆蛋白胨5g/L，酵母蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB1 15mg/L；
（5）大豆蛋白胨5g/L，大麦蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB1 15mg/L；
（6）酵母蛋白胨5g/L，大麦蛋白胨5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L和VB1 15mg/L；
上述培养基pH值均为6.0。
由上表看出，银耳（银耳芽孢）5-1菌株的孢子在含酵母蛋白胨与大麦蛋白胨的培养基中多糖含量最高，因此确定其培养基采用酵母蛋白胨与大麦蛋白胨作为氮源。
2.2 浓度选择
按照培养基组分大麦蛋白胨1、3、5、8、10 g/L，酵母蛋白胨1、3、5、8、10 g/L，葡萄糖10、15、20 g/L，磷酸二氢钾 1、3、5g/L，硫酸镁 1、2、3g/L和VB110、15、20mg/L，设计正交试验确定各组分浓度。通过对产多糖量分析，大麦蛋白胨、酵母蛋白胨、葡萄糖、VB1含量及大麦蛋白胨与葡萄糖的交互、酵母蛋白胨与葡萄糖的交互对孢子产多糖量影响显著；大麦蛋白胨3、5、8 g/L，酵母蛋白胨3、5、8 g/L，葡萄糖10、15、20 g/L和VB110、15、20mg/L产多糖量显著优于其他浓度；其中，在大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L的培养基中产多糖量最多。
实施例3 高分子量银耳多糖的生产
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1接入液体培养基（大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液以3%接种量接入10 L发酵罐中，培养基配方如步骤（1），30℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为：初始10 L/min，24 h 后15 L/min，48h后20 L/min至发酵结束，发酵过程用40% NaOH调节pH值为 6.0-7.0，通过流加方式间歇补料，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液（粘度为20000 mPa·s，高分子银耳多糖的含量为15 g/L）；
（3）醇沉：将4%氯化钠加入发酵液中溶解，以发酵液2倍体积的95%乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，其黏度为110 mPa·s，8000 r/min，离心15 min，上清液加1%的200目活性炭，在60℃下吸附1h后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值为10.5，1h后，以板框过滤，得到粗滤液；粗滤液经0.45μm的聚丙烯滤芯精滤，得精滤液；
（6）精制：将5%氯化钠加入精滤液溶解，用精滤液体积3倍的95%乙醇沉淀，并以95%乙醇洗涤沉淀3次；
（7）干燥：将洗涤后的沉淀于40℃进行真空干燥，得高分子量银耳多糖产品S1。
实施例4 高分子量银耳多糖的生产
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1接入液体培养基（大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液以3%接种量接入10 L发酵罐中，培养基配方如步骤（1），30℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为：初始10 L/min，24 h 后15 L/min，48h后20 L/min至发酵结束，发酵过程用40% NaOH调节pH值为 6.0-7.0，通过流加方式间歇补糖，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液（粘度为32000 mPa·s，高分子银耳多糖的含量为16 g/L）；
（3）醇沉：将4%氯化钠加入发酵液中溶解，以发酵液3倍体积的95%乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，其黏度为110 mPa·s，8000 r/min，离心15 min，上清液加1.5%的100-200目活性炭，在40-60℃下吸附0.5-2h后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值为10.5，1h后，以板框过滤，得到粗滤液；粗滤液经0.45μm的聚丙烯滤芯精滤，得精滤液；
（6）精制：将5%氯化钠加入精滤液溶解，用精滤液体积3倍的95%乙醇沉淀，并以95%乙醇洗涤沉淀3次；
（6）干燥：将洗涤后的沉淀于40℃进行真空干燥，得高分子量银耳多糖产品S2。
实施例5 高分子量银耳多糖的生产
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1接入液体培养基（大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得种子液；
（2）三段通气发酵：将种子液以3%接种量接入10L发酵罐中，培养基配方如步骤（1），30℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为：初始10 L/min，24 h 后15 L/min，48h后20 L/min至发酵结束，发酵过程用40% NaOH调节pH值为 6.0-7.0，通过流加方式间歇补糖，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液（粘度为40000 mPa·s，高分子银耳多糖的含量为18 g/L）；
（3）醇沉：将3%氯化钠加入发酵液中溶解，以发酵液3倍体积的95%乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，其粘度为120 mPa·s，8000 r/min，离心15 min，上清液加1.2%的200目活性炭，在40℃下吸附2h后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值为10.5，1h后，以板框过滤，得到粗滤液；粗滤液经孔0.45μm的聚丙烯滤芯精滤，得精滤液；
（6）精制：将4%氯化钠加入精滤液溶解，用精滤液体积3.5倍的95%乙醇沉淀精滤液，并以95%乙醇洗涤沉淀3次；
（7）干燥：将洗涤后的沉淀于30℃进行真空干燥，得高分子量银耳多糖产品S3。
实施例6 高分子量银耳多糖的生产
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1接入液体培养基（大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液以3%接种量接入10L发酵罐中，培养基配方如步骤（1），30℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为：初始10 L/min，24 h 后15 L/min，48h后20 L/min至发酵结束，发酵过程用40% NaOH调节pH值为 6.0-7.0，通过流加方式间歇补糖，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液（粘度为17000 mPa·s，高分子银耳多糖的含量为14 g/L）；
（3）醇沉：将4%氯化钠加入发酵液中溶解，以发酵液2倍体积的93%乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，其粘度为100 mPa·s，8000 r/min，离心15 min，上清液加1%的200目活性炭在50℃下吸附1h后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值为10.5，1h后，以板框过滤，得到粗滤液；粗滤液经0.45μm的聚丙烯滤芯精滤，得精滤液；
（6）精制：将4%氯化钠加入精滤液溶解，用精滤液体积3.5倍的93%乙醇沉淀精滤液，并以93%乙醇洗涤沉淀3次；
（6）干燥：将洗涤后的沉淀于30℃进行真空干燥，得高分子量银耳多糖产品S4。
实施例7 高分子量银耳多糖的生产
（1）种子液制备：将银耳（银耳芽孢）5-1按接入液体培养基（大麦蛋白胨 5 g/L，酵母蛋白胨 5 g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 3g/L，硫酸镁 1.5g/L和VB1 15mg/L；pH值为6.0），30℃下200 r/min摇瓶发酵3天，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液以3%接种量接入10L发酵罐中，培养基配方如步骤（1），30℃下通气搅拌培养，转速200 r/min，通气量为：初始10 L/min，24 h 后15 L/min，48h后20 L/min至发酵结束，发酵过程用40% NaOH调节pH值为 6.0-7.0，通过流加方式间歇补糖，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液（粘度为15000 mPa·s，发酵液中高分子银耳多糖的含量为13 g/L）；
（3）醇沉：将4%氯化钠加入发酵液中溶解，以发酵液2倍体积的95%乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，粘度为100 mPa.s，8000 r/min，离心15 min，上清液加0.8%的200目活性炭在60℃下吸附0.5h后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值为10.5，1h后以板框过滤，得到粗滤液；粗滤液经0.45μm的聚丙烯滤芯精滤，得精滤液；
（6）精制：将3%氯化钠加入精滤液溶解，用精滤液体积4倍的95%乙醇沉淀精滤液，并以95%乙醇洗涤沉淀；
（7）干燥：将洗涤后的沉淀于25℃进行真空干燥，得高分子量银耳多糖产品S5。
实施例8产品质量检验
6.1 银耳多糖分子量测定
采用多角度光散射（MALS）法测定产品中高分子量银耳多糖重均相对分子量（Mw）。
6.2 银耳多糖含量测定
采用苯酚硫酸法测定产品中高分子量银耳多糖含量。
标曲制备：准确称取葡萄糖100mg，加入20mL蒸馏水溶解，转移至250mL容量瓶中，加水至刻度，用前稀释10倍，分别吸取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于具塞试管中，各以蒸馏水补至2.0mL。
样品制备：称取250mg样品加入20mL蒸馏水溶解，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度作为贮备液，用前量取贮备液4mL，置50mL容量瓶中，加水至刻度，测前稀释10倍，取2mL于具塞试管中。
测定：将以上标准溶液与样品稀释液，加入6%重蒸酚1.0 mL及浓H2SO4 5.0mL，摇匀冷却。室温反应20min后于490 nm测OD，以2.0mL水按同样显色操作为空白，以糖浓度为纵坐标，以吸光度值为横坐标，得标准曲线及回归方程：y=83.468x-7.433 (R2=0.9996)。由标曲得多糖浓度，计算产品中高分子量银耳多糖含量。
6.3 蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝法测定产品中蛋白质含量：取考马斯亮蓝G250 0.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀使用前过滤。取牛血清白蛋白，加水溶解并制成每l mL中含l mg的溶液。
精密量取对照品溶液0.00mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.10 mL，分别置具塞试管中，各加水至0.1mL，再分别加入考马斯亮蓝G250液5.0mL，混匀，在595 nm的波长处测定吸光度；同时无蛋白液试管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程：y=0.0089x+0.03905 (R2=0.9991)。精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
表3 发酵法生产高分子量银耳多糖的指标
由上表数据可知，发酵法生产的银耳多糖含量高、分子量大，具有产业化应用价值。
<110> 华熙福瑞达生物医药有限公司,山东华熙海御生物医药有限公司
<120> 一株银耳菌株及其应用
<130> 20170606
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> 银耳（Tremella fuciformis）
<400> 1
gcggaaggat catttgagat tacaccgggc cacgaggccc ttccaaaccc tgtgcacatc 60
ggaccgcgcc cccgggccgg gccgccttca cacaaacata tgtcaagaac gtaatgcatc 120
ataacatgaa acaactttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag 180
cgaattgcga aaagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 240
ccttgcgcct tttggtattc cgaaaggcat gcctgtttga gtgtcatgta gactcaaccc 300
cctgggtttc tgacccggcg gtgttggatt tgggccctgc ctctctggct ggccttaaat 360
gcgttagtgg tttcacgcag acgtcgtaag ttacgcgtcg actgtgggcc gctcacaacc 420
ccctttactt ttgcactctg gcctcaaatc aggtagggct acccgctgaa cttaagcata 480
tca 483

Claims (9)

1.一株银耳（Tremella fuciformis）孢子菌株HX5-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC M 2017271。
2.一种发酵法生产高分子量银耳多糖的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）种子液制备：将银耳菌种HX5-1接入种子培养基，摇瓶发酵，获得种子液；
（2）三阶段通气发酵：将种子液接入发酵罐培养基中，通气搅拌培养，流加方式间歇补料，发酵至无残糖时结束发酵，获得发酵液；
（3）醇沉：将氯化钠加入步骤（2）发酵液中溶解，用乙醇沉淀获得粗品；
（4）脱色：将粗品用水溶解，离心，将上清液用活性炭吸附后过滤，得滤液；
（5）除蛋白：调节滤液pH值，处理后过滤，得精滤液；
（6）精制：加入氯化钠，充分溶解，用乙醇沉淀精滤液，并用乙醇反复洗涤沉淀；
（7）干燥：将洗涤后的沉淀进行真空干燥得高分子量银耳多糖产品；
所述银耳菌种HX5-1的保藏编号为CCTCC M 2017271。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）的液体培养基为银耳发酵培养基，pH值为5.0-7.0；转速为100-200rpm，发酵时间为2-3天；
所述银耳发酵培养基，包括以下组分：大麦蛋白胨3-8g/L，酵母蛋白胨 3-8 g/L，葡萄糖10-20g/L，磷酸二氢钾 1-5 g/L，硫酸镁 1-3 g/L和VB110-20 mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）的液体培养基为银耳发酵培养基，培养期间用40%NaOH调控pH值为5.0-7.0；所述接种量为1-10%；温度为26-35℃；搅拌速度为100-300rpm；通气量为：初始1-2vvm，24h后1-3vvm，48h后2-5vvm至发酵结束；发酵结束时，发酵液pH值为6.0-7.0，粘度大于15000mPa·s，银耳多糖的含量为10-20 g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）的氯化钠添加量为发酵液的1-5%（w/v）；乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为发酵液的2-3倍。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）的粗品用2-5倍水溶解，使其粘度为100-120 mPa.s；离心条件为5000-10000 r/min，10-30 min；活性炭粒径为200目，用量为0.5-1.5%（w/v）；吸附时间为0.5-2h，吸附温度为40-60℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）滤液pH值为大于10.5，处理时间为1-2h；精滤介质为孔径0.45μm的滤芯。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（6）氯化钠的添加量为精滤液的1-5%（w/v）；乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为精滤液体积的3-4倍。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（7）真空干燥的温度为小于60℃；干燥至失重小于10%；所述高分子量银耳多糖产品，总糖含量大于80%，分子量大于1500 KDa，蛋白质含量小于0.5 %。
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