CN107501438A - 一种小核菌胶的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小核菌胶的生产方法，首先获得小核菌发酵液，经过乙醇沉淀得到粗品，将粗品溶解后，经过蛋白质变性、活性炭吸附、醇沉、干燥等步骤获得小核菌胶粉末。本发明的小核菌胶生产方法解决了小核菌胶颜色差和透光率低的问题，制备的小核菌白度≥80%，凝胶透光率高于90%，可广泛用于日化领域。

Description

一种小核菌胶的生产方法
技术领域
本发明涉及一种小核菌胶的生产方法，具体涉及一种通过发酵液生产小核菌胶的方法。
背景技术
小核菌胶或称硬葡聚糖、小核菌多糖，是小核菌属(Sclerotium spp.)发酵形成的胞外多糖生物聚合物，其中以齐整小核菌最为典型。小核菌胶主链由β-1,3-D-吡喃葡糖构成，每隔三个葡萄糖单元有一个β-1,6-D-吡喃葡糖单元侧基。
小核菌胶溶液在高温下稳定性强，在广泛的pH值范围内有很好的适用性，对于存在溶液的多种电解质有很大的耐受性，具有高度的假塑性，溶液的粘度随温度升降而引起的变化不大。研究表明，小核菌胶具有出色的保湿、抗过敏和皮肤修护功能。与其他保湿剂相比，小核菌胶的特点是周围环境的相对湿度对其保湿性的影响较小。小核菌胶溶液在相对湿度较低时（33%）吸湿量相对最高，在相对湿度较高时（75%）吸湿量相对最低。这种独特的性质适合不同季节、不同环境湿度（如干燥的冬季和潮湿的夏季）皮肤对化妆品保湿作用的要求。抗敏消炎也是小核菌胶在化妆品中另外一项重要作用。实验证明小核菌胶在0.2%浓度时与含有1.0%氢化可的松的化妆品中可具有同样的消炎作用；可以明显降低由果酸等有刺激性的活性成分所引起的皮肤过敏炎症的作用。同时小核菌胶还具有清除自由基，抗紫外线伤害等作用，也拓宽了小核菌胶在化妆领域的应用。小核菌胶作为一种纯天然生物高分子保湿剂，兼具保湿、修护、消炎、抗氧化等作用，性质稳定，水溶性好，长效保湿，已广泛应用于化妆品行业，市场需求大。目前市场上的小核菌胶存在颜色偏黄，溶液透光差等缺点。然而高纯度小核菌胶的生产制备方法研究较少；因此，制备高品质的小核菌胶具有广阔市场前景。
发明内容
为解决目前小核菌胶颜色偏黄，透光率低的问题，本发明提供了一种通过齐整小核菌发酵液生产高白度、高透光的高品质小核菌胶的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种小核菌胶的生产方法，采用以下步骤：
（1）粗品制备：将小核菌发酵液用乙醇沉淀，即为小核菌胶粗品；
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解成溶液后加热；
（3）活性炭吸附：将步骤（2）的溶液调pH值为5.0-7.0，加入活性炭吸附0.5-2h，再次调节pH值至8.0以上过滤得上清液；
（4）醇沉：将步骤（3）的上清液调pH值为5.0-7.0，加入乙醇，得到小核菌胶纤维状沉淀；
（5）干燥：将小核菌胶纤维状沉淀真空干燥，得小核菌胶粉末。
所述步骤（1）小核菌发酵液粘度≥10000 mPa.s。
所述步骤（2）溶液的小核菌胶浓度为0.25-1%（w/v）；加热温度为85-95℃，维持10-30min。
所述步骤（3）活性炭的量为0.5-1.5%（w/v）；吸附温度为55-70℃，时间为0.5-2h；吸附前调节pH值为5.0-7.0，吸附后调节pH值为8.0以上。
所述步骤（4）调节后pH值为5.0-7.0。
所述步骤（1）与步骤（4）中乙醇浓度为90-100%（v/v），乙醇用量为溶液体积的1.5-2倍。
所述步骤（5）干燥温度为60-65℃；小核菌胶粉末白度为80%以上，其1%的溶液黏度为1500-2500mPa.s，透光度为90%以上。
所述步骤（1）的小核菌发酵液，采用以下步骤生产：
(1) 菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基，恒温培养2-3d。
(2) 种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；将菌悬液接入液体培养基中摇匀，恒温摇床振荡培养2-3d，得到种子培养液。
(3) 发酵液制备：将种子培养液接种入液体培养基，通气恒温搅拌条件下培养3-7d，发酵过程中控制pH值，间歇式补糖，发酵结束得到小核菌发酵液。
所述培养基包含20-50 g/L葡萄糖，1 g/L酵母膏，2-4 g/L硝酸钠，0.5-2 g/L磷酸二氢钾，0.3-1 g/L硫酸镁，pH值为4.0-5.0。
所述培养温度为28±2℃；接种量为5-10%（v/v）。
所述摇床转速为200rpm。
所述5L的的发酵罐装液量为4L，发酵培养搅拌速度为200-300rpm，通气量为4L/min，pH值为4.0-6.0。
一种上述方法生产的小核菌胶在制备抗氧化功能的化妆品和食品中的用途。
本发明具有以下优点：
本发明以小核菌胶发酵液为原料，经乙醇沉淀得到粗品，粗品经溶解、蛋白质变性、活性炭吸附、过滤、乙醇沉淀、干燥等工艺得到白度较高的小核菌胶粉末。本发明采用活性炭脱色和乙醇沉淀解决了小核菌胶的颜色要求，通过高温变性和碱变性去除蛋白质，提高了小核菌胶的纯度。本发明可制得高品质高白度的小核菌胶粉末，其白度大于80%，凝胶透光率高于90%。因此，本发明的小核菌胶的生产方法解决了小核菌胶颜色差和透光率低的问题，工艺简单，便于工业化生产。
附图说明
图1为小核菌胶和透明质酸对DPPH自由基的清除作用。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 小核菌胶的制备
1.发酵液制备：
（1）菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基（g/L：葡萄糖20，酵母膏1，硝酸钠2，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3和琼脂粉10，pH值＝5），28±2℃恒温培养2d。
（2）种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；按10%的接种量将菌悬液接入液体培养基（g/L：葡萄糖20，酵母膏1，硝酸钠2，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3，pH值＝5）中摇匀，在28±2℃的恒温摇床200rpm振荡培养3d，得到种子培养液。
（3）将种子培养液按10%的体积接种于4L液体培养基（g/L：葡萄糖20，酵母膏1，硝酸钠2，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.3，pH值＝5）中，在温度为28±2℃、搅拌速率为200rpm、通气量为4L/min条件下培养6d，发酵过程中控制pH值＝4.0-6.0，间歇式进行补糖，发酵结束得到小核菌发酵液，黏度为13800mPa.s，pH值为6.5。
2.小核菌胶的生产：
（1）粗品制备：以发酵液2倍体积的95%的乙醇沉淀小核菌发酵液，得到小核菌胶粗品。
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解为0.25%溶液，升温至90℃，维持20min。
（3）活性炭吸附：加入溶液体积1%的活性炭，然后在pH值为6.0，温度为60℃条件下，吸附1h；调pH值为8.2，过滤得上清液。
（4）醇沉：将上清液调pH值为6.0，加入1.5倍体积95%的乙醇醇沉。
（5）干燥：将上述醇沉制得的固形物于60℃下真空干燥，得小核菌胶粉末S1。
实施例2 小核菌胶的制备
1.发酵液制备：
（1）菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5和琼脂粉0.5，pH＝4.5），28±2℃恒温培养2d。
（2）种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；按10%的接种量将菌悬液接入液体培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH值＝4.5）中摇匀，在28±2℃的恒温摇床200rpm振荡培养3d，得到种子培养液。
（3）将种子培养液按10%的体积接种于4L液体培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH值＝4.5）中，在温度为28±2℃、搅拌速率为200rpm、通气量为4L/min条件下培养6d，发酵过程中控制pH值＝4.0-6.0，间歇式进行补糖，发酵结束得到小核菌发酵液，黏度为16000mPa.s，pH值为7.0。
2.小核菌胶的生产：
（1）粗品制备：用发酵液2倍体积的95%乙醇沉淀小核菌发酵液，得到小核菌胶粗品。
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解为0.3%溶液，升温至90℃，维持20 min。
（3）活性炭吸附：加入溶液体积0.8%的活性炭，在pH值为6.5，温度为65℃条件下，吸附1h；调pH值为8.3，过滤的上清液。
（4）醇沉：将上清液调pH值为6.0，加入上清液2倍体积的95%乙醇醇沉。
（5）干燥：将上述醇沉制得的固形物于60℃下真空干燥，得小核菌胶粉末S2。
实施例3 小核菌胶的制备
1.发酵液制备：
（1）菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基（g/L：葡萄糖40，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾2，硫酸镁1和琼脂粉10，pH值＝5），28±2℃恒温培养2d。
（2）种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；按10%的接种量将菌悬液接入液体培养基（g/L：葡萄糖40，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾2，硫酸镁1，pH值＝5）中摇匀，在28±2℃的恒温摇床200rpm振荡培养3d，得到种子培养液。
（3）将种子培养液按10%的体积接种于4L液体培养基（g/L：葡萄糖40，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾2，硫酸镁1，pH值＝5）中，在温度为28±2℃、搅拌速率为200rpm、通气量为4L/min条件下培养6d，发酵过程中控制pH值＝4.0-6.0，间歇式进行补糖，发酵结束得到小核菌发酵液，黏度为15600mPa.s，pH值为7.0。
2.小核菌胶的生产：
（1）粗品制备：用发酵液2倍体积90%的乙醇沉淀小核菌发酵液，得到小核菌胶粗品。
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解为0.4%溶液，升温至95℃，维持20 min。
（3）活性炭吸附：加入溶液体积0.8%的活性炭，在pH值为6.5，温度为65℃条件下，吸附45min；调pH值为8.2，过滤得上清液。
（4）醇沉：将上清液调pH值为6.0，加入上清液2倍体积90%的乙醇醇沉。
（5）干燥：将上述醇沉制得的固形物于60℃真空干燥，得小核菌胶粉末S3。
实施例4 小核菌胶的制备
1.发酵液制备：
（1）菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基（g/L：葡萄糖50，酵母膏1，硝酸钠4，磷酸二氢钾0.8，硫酸镁0.3和琼脂粉10，pH值＝4），28±2℃恒温培养2d。
（2）种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；按10%的接种量将菌悬液接入液体培养基（g/L：葡萄糖50，酵母膏1，硝酸钠4，磷酸二氢钾0.8，硫酸镁0.3，pH值＝4）中摇匀，在28±2℃的恒温摇床200rpm振荡培养3d，得到种子培养液。
（3）将种子培养液按10%的体积接种于4L液体培养基（g/L：葡萄糖50，酵母膏1，硝酸钠4，磷酸二氢钾0.8，硫酸镁0.3，pH值＝4）中，在温度为28±2℃、搅拌速率为200rpm、通气量为4L/min条件下培养6d，发酵过程中控制pH值＝4.0-6.0，间歇式进行补糖，发酵结束得到小核菌发酵液，黏度为14000mPa.s，pH为7.2。
2.小核菌胶的生产：
（1）粗品制备：以发酵液1.5倍体积95%的乙醇沉淀小核菌发酵液，得到小核菌胶粗品。
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解为0.4%溶液，升温至95℃，维持20 min。
（3）活性炭吸附：加入溶液体积1%的活性炭，在pH值为6.0，温度为65℃条件下，吸附1h；调pH值为8.4，过滤得上清液。
（4）醇沉：将上清液调pH值为6.0，加入上清液2倍体积的95%乙醇醇沉。
（5）干燥：将上述醇沉制得的固形物于60℃真空干燥，得小核菌胶粉末S4。
实施例5 小核菌胶的制备
1.发酵液制备：
（1）菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5和琼脂粉10，pH值＝4.5），28±2℃恒温培养2d。
（2）种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；按10%的接种量将菌悬液接入液体培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH值＝4.5）中摇匀，在28±2℃的恒温摇床200rpm振荡培养3d，得到种子培养液。
（3）将种子培养液按10%的体积接种于4L液体培养基（g/L：葡萄糖30，酵母膏1，硝酸钠3，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH值＝4.5）中，在温度为28±2℃、搅拌速率为200rpm、通气量为4L/min条件下培养6d，发酵过程中控制pH＝4.0-6.0，间歇式进行补糖，发酵结束得到小核菌发酵液，黏度为17000mPa.s，pH值为7.1。
2.小核菌胶的生产：
（1）粗品制备：用发酵液1.5倍体积的100%乙醇沉淀小核菌发酵液，得到小核菌胶粗品。
（2）蛋白质变性：将含有小核菌胶粗品用水溶解为0.25%的溶液，升温至90℃，维持20 min。
（3）活性炭吸附：向步骤（2）加入溶液体积0.8%的活性炭，在pH值为6.0，温度为65℃条件下，吸附1h；调pH值为8.3，过滤得上清液。
（4）醇沉：将上清液调pH值为6.0，加入上清液1.5倍体积的100%乙醇醇沉。
（5）干燥：将上述醇沉制得的固形物于60℃真空干燥，得小核菌胶粉末S5。
实施例6小核菌胶的产品质量检测
6.1黏度测定
参照《中华人民共和国药典》（2015年版）通则0633第三法中的规定，取本品粉末1.0g，加纯净水100mL，搅拌使之完全溶解。用NDJ-1型旋转式粘度计，在25℃时测定样品黏度。
6.2白度测定
用白度仪在波长425nm处对样品进行测定，首先用标准白板进行校正，然后将样品制成白板，最后进行测定，记录白度值。
6.3 透光度测定
取本品0.50 g至盛有100 mL水的锥形瓶中，在冰箱中放置过夜，溶解后，以水作空白，用紫外-可见分光光度计在550 nm波长处测定溶液的透光率。
表1小核菌胶粉末理化指标
由表中数据，本发明制备的产品其中小核菌胶的黏度为1500-2500mPa.s，白度≥80%，透光度为≥90%，小核菌胶黏度高、杂质少，白度高、溶液透光度高，符合化妆品用小核菌胶的要求，在日化产品领域具有广泛用途。
实施例7小核菌胶清除DPPH自由基实验
7.1实验原理
二苯基苦味肼自由基（DPPH）是一种稳定的以氮为中心的自由基，DPPH的甲醇或乙醇溶液呈紫色，在510-530nm波长处有最大吸收，其浓度与吸光度呈线性关系。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对使其褪色，褪色程度与接收的电子呈定量关系，表现为溶液颜色变浅，吸光度减小。自由基清除剂的能力越强，吸光度越小。
7.2 实验过程
1. 溶液配制：分别精密量取DPPH溶液5.0mL和样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。
2. 操作步骤：分别精密量取DPPH溶液5.0mL和样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。
3. 计算方法
以自由基清除率为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得图1。如图1所示，DPPH自由基清除率随着小核菌胶浓度的增大呈线性上升趋势。在小核菌胶浓度为3.5-4.0时，DPPH自由基清除率达到最大值48.12%。与透明质酸钠相比，相同浓度下，小核菌胶具有更高的清除DPPH自由基的能力。

Claims (10)

1.一种小核菌胶的生产方法，其特征在于，采用以下步骤：
（1）粗品制备：将小核菌发酵液用乙醇沉淀，即为小核菌胶粗品；
（2）蛋白质变性：将小核菌胶粗品用水溶解成溶液后加热；
（3）活性炭吸附：将步骤（2）的溶液调pH值为5.0-7.0，加入活性炭吸附0.5-2h，再次调节pH值至8.0以上过滤得上清液；
（4）醇沉：将步骤（3）的上清液调pH值为5.0-7.0，加入乙醇沉淀，得到小核菌胶纤维状沉淀；
（5）干燥：将小核菌胶纤维状沉淀真空干燥，得小核菌胶粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）小核菌发酵液粘度≥10000mPa.s；乙醇浓度为90-100%（v/v），乙醇用量为发酵液体积的1.5-2倍。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）溶液的小核菌胶浓度为0.25-1%（w/v）；加热温度为85-95℃，维持10-30min。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）活性炭的量为0.5-1.5%（w/v）；吸附温度为55-70℃，时间为0.5-2h；吸附前调pH值为5.0-7.0，吸附后调pH值为8.0以上过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）调节后pH值为5.0-7.0；乙醇浓度为90-100%（v/v），乙醇用量为上清液体积的1.5-2倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）干燥温度为60-65℃；小核菌胶粉末白度为80%以上，其1%的溶液黏度为1500-2500mPa.s，透光度为90%以上。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的小核菌发酵液，采用以下步骤生产：
(1) 菌种活化：将小核菌接种于斜面培养基，恒温培养2-3d；
(2) 种子培养液制备：用无菌水冲洗培养好的菌种斜面，得到小核菌菌悬液；将菌悬液接入液体培养基中摇匀，恒温摇床振荡培养2-3d，得到种子培养液；
(3) 发酵液制备：将种子培养液接种入液体培养基，通气恒温搅拌条件下培养3-7d，发酵过程中控制pH值，间歇式补糖，发酵结束得到小核菌发酵液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养温度为28±2℃；摇床转速为200rpm；发酵培养搅拌速度为200-300rpm，通气量为0.5-1vvm，pH值为4.0-6.0；步骤（2）与步骤（3）所述接种量为5-10%（v/v）。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养基包含20-50 g/L葡萄糖，1 g/L酵母膏，2-4 g/L硝酸钠，0.5-2 g/L磷酸二氢钾，0.3-1 g/L硫酸镁，pH值为4.0-5.0。
10.一种如权利要求1所述所生产的小核菌胶，其特征在于，用于制备抗氧化功能的化妆品和食品。
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