CN115536761A - 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法 - Google Patents

一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115536761A
CN115536761A CN202211326885.5A CN202211326885A CN115536761A CN 115536761 A CN115536761 A CN 115536761A CN 202211326885 A CN202211326885 A CN 202211326885A CN 115536761 A CN115536761 A CN 115536761A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
csfp
degradation
pholiota
degraded
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211326885.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115536761B (zh
Inventor
程艳芬
常明昌
孟俊龙
耿雪冉
徐丽婧
王术荣
郭蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Agricultural University
Original Assignee
Shanxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Agricultural University filed Critical Shanxi Agricultural University
Priority to CN202211326885.5A priority Critical patent/CN115536761B/zh
Publication of CN115536761A publication Critical patent/CN115536761A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115536761B publication Critical patent/CN115536761B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法。所述方法为在水中对鳞杯伞多糖进行超声辅助过氧化氢降解反应得到鳞杯伞降解多糖，其中鳞杯伞多糖浓度为5mg/mL、超声温度65℃、过氧化氢质量分数2.0％、超声时间2.5h。实验结果表明超声辅助H2O2降解法制得的鳞杯伞降解多糖的体外抗氧化活性和抗炎活性高。

Description

一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法。
背景技术
鳞杯伞(Clitocybe squamulosa)又名黑水皮香蕈，隶属于伞菌目，白蘑科，杯伞属，主要生长于五台管涔山的云杉、落叶松林内的草地上。鳞杯伞子实体营养丰富、质地韧嫩、干香味浓、风味独特，长期食用能够降低胆固醇，防止动脉硬化，提高免疫力。已有研究者对鳞杯伞子实体的主要营养成分进行分析，发现鳞杯伞子实体中碳水化合物含量40.96％，蛋白质38.57％，脂肪3.27％，粗纤维8.16％，而且富含Mg、Ca、K、Fe、Zn、Cu、Mn等多种人体所需的矿质元素。也有一些研究者采用水提醇沉法提取其可溶性多糖并优化提取工艺，对其进行理化性质和结构的初步解析；并通过模拟体外消化与厌氧发酵实验，探究鳞杯伞碱溶性多糖的消化特性以及对肠道内短链脂肪酸含量的影响，发现鳞杯伞碱溶性多糖可以被人体肠道菌群有效吸收利用。
目前，关于食用菌多糖的研究发现其具有许多潜在药理和治疗作用，如抗氧化、抗癌、降糖、抗菌、降脂到免疫调节等。但是目前关于鳞杯伞多糖活性方面的研究却罕有报道。天然的鳞杯伞多糖由于分子量大、结构复杂，限制了其在生物体内功能结构域的暴露，导致其生物利用度低。[张海芸,贺亮,李琴,等.降解对植物多糖理化性质以及生物活性影响的研究[J].食品与发酵科技,2019,55(03):15-19.https://kns.cnki.net.]。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种制备鳞杯伞降解多糖的方法。
本发明所提供的制备鳞杯伞降解多糖的方法，为：在水中，对鳞杯伞多糖进行超声辅助过氧化氢降解反应，得到鳞杯伞降解多糖。
其中，反应体系中，鳞杯伞多糖的质量浓度为2.5-7.5mg/mL，优选5.0mg/mL；
所述反应的温度可为60℃-75℃，优选65℃；
反应体系中的过氧化氢质量分数为1.0％-2.0％，优选1.5％-2.0％，更优选2.0％，
所述反应的时间可为2.0h-3.0h，优选2.5h。
超声波的功率为40KHz。
所述鳞杯伞多糖通过包括如下步骤的方法制备得到：
鳞杯伞(五台山野生鳞杯伞)子实体粉末以料液(蒸馏水)比1:3(w/v)的用量在超声波清洗器中浸提40min，温度为80℃，功率为200W，用16层纱布过滤2次，取上清液，旋蒸至原体积的1/5，再离心6500g15min，取上清液，用乙酸锌-亚铁氰化钾法脱蛋白后，6500g离心15min，保留上清液，采用3kD透析袋流水透析1d，蒸馏水透析1d，至电导率<20μS·cm-1，加入4倍体积透析液的无水乙醇4℃静置24h，6500g离心15min，收集沉淀，冷冻干燥得鳞杯伞多糖CSFP。
由上述方法制得的鳞杯伞降解多糖的降解率最高达87.95％。
上述鳞杯伞降解多糖在制备抗炎和抗氧化产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明以五台山野生鳞杯伞为原料，首先制备出鳞杯伞多糖，再通过三种降解方法(超声波降解法、H2O2降解法、超声辅助H2O2降解法)对鳞杯伞多糖进行降解，改善鳞杯伞多糖分子量大、结构复杂、生物利用度低等缺点，比较三种方法制得的降解多糖的理化性质和活性差异，结果显示超声辅助H2O2降解法制得的鳞杯伞降解多糖的体外抗氧化活性显著高于另两种降解方法制得的产物。
附图说明
图1为本发明实施例1中葡萄糖标准曲线。
图2表明本发明实施例3中多糖质量浓度对降解率的影响。
图3表明本发明实施例3中反应时间对鳞杯伞多糖降解率的影响。
图4表明本发明实施例3中H2O2质量分数对鳞杯伞多糖降解率的影响。
图5表明本发明实施例3中反应温度对鳞杯伞多糖降解率的影响。
图6为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其三种降解多糖的HPGPC色谱图。
图7为本发明实施例4中标准单糖、CSFP及其降解多糖的离子色谱图，其中，1.盐酸氨基葡萄糖2.半乳糖3.葡萄糖4.木糖5.甘露糖。
图8表明本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖的总还原力。
图9为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖对DPPH自由基的清除率。
图10为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖对ABTS自由基的清除率。
图11为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖对·OH自由基的清除率。
图12为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖对RAW264.7细胞存活力的影响。
图13为本发明实施例4中CSFP及其降解多糖对巨噬细胞RAW264.7的吞噬指数影响结果。
图14为本发明实施例4中鳞杯伞多糖及其降解多糖对巨噬细胞RAW264.7炎症因子TNF-α、1L-6、1L-10、TGF-β分泌的影响
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用的鳞杯伞多糖通过如下方法制备得到：
鳞杯伞(五台山野生鳞杯伞)子实体粉末以料液(蒸馏水)比1:3(w/v)的用量在超声波清洗器中浸提40min，温度为80℃，功率为200W，用16层纱布过滤2次，取上清液，旋蒸至原体积的1/5，再离心6500g15min，取上清液，用乙酸锌-亚铁氰化钾法脱蛋白后，6500g离心15min，保留上清液，采用3kD透析袋流水透析1d，蒸馏水透析1d，至电导率<20μS·cm-1，加入4倍体积透析液的无水乙醇4℃静置24h，6500g离心15min，收集沉淀，冷冻干燥得鳞杯伞多糖CSFP。
实施例1、鳞杯伞多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定鳞杯伞多糖的含量
葡萄糖标准曲线的建立：准确称取标准葡萄糖10mg于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。分别吸取标准溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1mL于试管内，用蒸馏水补至2mL，摇匀。吸取400uL葡萄糖样液，加入5％苯酚200uL，和浓硫酸1mL，涡旋震荡，用小型的震荡机，置于30℃水浴锅中反应30min，冷却到室温，在490nm处检测吸光值。以葡萄糖溶液的浓度为X轴，吸光值为Y轴，绘制回归曲线，得回归方程。
苯酚-硫酸试剂与游离的糖类起显色反应，最大吸收峰值在490nm处，吸收值与糖浓度呈线性关系。根据测定结果做线性回归，可得浓度c与吸光值A关系。
图1为葡萄糖标准曲线。
曲线的回归方程：Y＝0.1645X-0.1922,相关系数R2＝0.996。
样品中鳞杯伞多糖含量的确定：准确称取50mg鳞杯伞多糖样品，加入少量蒸馏水使其溶解，定容于10mL小离心管中，配制成浓度为5mg/mL的鳞杯伞多糖样品溶液。按0,5,10,20,30,40,50,60倍的稀释倍数稀释。吸取溶液400uL，苯酚200uL，硫酸1uL，金属浴30℃，反应30min。于490nm处测吸光度值，代入标准曲线测定多糖的含量，粗提的鳞杯伞多糖含量为52.61％。空白组由蒸馏水取代多糖样品，其余步骤不变。
实施例2、多糖相对黏度的测定及降解率的计算
鳞杯伞多糖溶液相对黏度的测定
使用流变仪测定在25±0.2℃条件下超声协助过氧化氢降解前后鳞杯伞多糖溶液的相对黏度。
降解率的测定
式中η0为降解前测得相对黏度，ηt为降解后测得相对黏度。
降解率计算公式：
降解率(％)＝(η0-ηt)/η0×％ (1-1)
实施例3、考察参数的设置对鳞杯伞多糖降解率的影响
1、单因素试验
以多糖质量浓度，反应温度，过氧化氢质量分数和反应时间为影响因素，进行超声(超声波功率恒定为40KHz)辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖的试验。以相对黏度为指标，初步确定适用于超声辅助过氧化氢法降解鳞杯伞多糖的各因素及水平，固定条件：多糖质量浓度为5mg/mL，过氧化氢质量分数为2.0％，反应时间为2.0h,反应温度为55℃。
1.1多糖质量浓度对降解鳞杯伞多糖的影响
在反应温度为55℃、过氧化氢质量分数为2.0％、反应时间为2h的条件下准确称取20mg两份,40mg两份，60mg两份，80mg两份，100mg两份的鳞杯伞多糖置于50mL的离心管中，使用规格分别为1mL和20uL的移液枪，分别加入7.515mL，7.514mL，7.513mL，7.510mL得水再按照顺序加入过氧化氢溶液0.485mL，0.486mL，0.487mL，0.490mL另外一份全部加8mL的水。以比较不同多糖质量浓度(2.5mg/mL、5.0mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL)对超声辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖试验的影响。
图2表明多糖质量浓度对鳞杯伞多糖降解率的影响。
由图2可知多糖质量浓度对鳞杯伞多糖的降解有一定影响，多糖质量浓度为2.5mg/mL时，降解率为28.28％增大多糖质量浓度到5.0mg/mL时，降解率最大为51.92％，当浓度超过5.0mg/mL后降解率逐渐下降，多糖质量浓度为7.5mg/mL、10.0mg/mL、12.5mg/mL时降解率分别为39.61％、36.77％、30.33％。结果表明，适度提高多糖质量浓度可以提高多糖的降解率，这可能是由于多糖的浓度增大，超声产生的能量密度减小，使反应速率减慢。此处考虑选取鳞杯伞多糖质量浓度为5mg/mL。
1.2反应时间对降解鳞杯伞多糖的影响
在多糖质量浓度为5mg/mL、在反应温度为55℃、过氧化氢质量分数为2.0％的条件下，准确称取40mg鳞杯伞多糖五份分别置于50mL的离心管中，再使用规格分别为1mL和20uL的移液枪加入7.514mL的水和0.486mL的过氧化氢溶液。比较了不同反应时间(1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h)对超声辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖试验的影响。
图3表明反应时间对鳞杯伞多糖降解率的影响。
由图3可知反应时间从1.0h延长至1.5h的时候，降解率升幅明显，往后趋于平缓达到2.5h时为峰值，反应时间为1.0时降解率为51.50％，延长反应时间为1.5h时降解率上升为73.32％，反应时间延长为2.0h时，降解率上升为83.50％，当反应时间延长为2.5h时，降解率仅上升为86.45％，而当反应时间延长为3.0h时，降解率更是有下降的趋势，仅为84.37％。根据实验结果，此处考虑选取反应时间为2.0-3.0h均可。
1.3过氧化氢质量分数对降解鳞杯伞多糖的影响
在反应温度为55℃、反应时间为2h的条件下，准确称取鳞杯伞多糖40mg五份分别置于50mg离心管中，使用规格分别为1mL和20uL的移液枪分别加入0.242mL,0.364mL,0.486mL,0.606mL,0.710mL的过氧化氢溶液，再加入7.758mL,7.636mL,7.514mL,7.394mL，7.290mL的水。比较了不同过氧化氢质量分数(1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％)对超声辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖试验的影响。
图4表明H2O2质量分数对鳞杯伞多糖降解率的影响。
由图4可知，随着过氧化氢质量分数的增加，降解率于过氧化氢质量分数为1.5％时达到峰值，为84.10％。降解率整体呈先上升后下降的趋势。过氧化氢质量分数为1.0％时，降解率为72.37％。当过氧化氢质量分数上升至2.0％、2.5％、3.0％时，降解率分别为77.58％、53.06％、46.33％。根据试验结果，此处考虑选取过氧化氢质量分数为1.5％-2.0％。
1.4反应温度对降解磷杯伞多糖的影响
在过氧化氢质量分数为2.0％、反应时间为2h的条件下，准确称取40mg鳞杯伞多糖五份分别置于50mL的离心管中，再使用规格分别为1mL和20uL的移液枪加入7.514mL的水和0.486mL的过氧化氢溶液。以比较不同反应温度(35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)对超声辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖试验的影响。
图5表明反应温度对鳞杯伞多糖降解率的影响。
由图5可知，当反应温度从35℃上升至65℃时，降解率也随之增大。但当反应温度超过65℃达到75℃时，降解率反而有轻微的下降。反应温度为35℃时，降解率为13.04％。反应温度为45℃时，降解率为19.62％。反应温度为55℃时降解率增幅明显，此时降解率为51.92％。反应温度为65℃时，降解率达到峰值为57.75％。反应温度为75℃时，降解率下降至55.33％。根据试验结果，此处考虑选取反应温度为60-75℃。
2正交试验
对单因素实验的结果进行分析，选取影响较大的单因素进行工艺优化。设计正交试验L9(34)因素水平表，继续以相对黏度为指标，对降解最佳条件进行优化，以确定最佳工艺参数。实验安排如表1所示。
表1正交试验因素水平表
Figure BDA0003908743140000061
根据四个单因素试验的结果，采用正交表L9(34)进行正交试验，以鳞杯伞多糖溶液的相对黏度为指标进行鳞杯伞多糖的降解工艺优化。得鳞杯伞多糖降解过程的正交试验结果，见表2。从表中我们可以看出，不同降解条件下，降解率存在一定差异，在9个试验设计组中，第5组降解率最高为87.955％。由方差分析可知，各因素对降解率的影响程度依次为A(多糖浓度)>C(过氧化氢质量分数)>B(超声温度)>D(超声时间)。由表3可知，超声辅助过氧化氢降解鳞杯伞多糖的最佳组合A2B2C3D2，即多糖浓度为5mg/mL、超声温度65℃、过氧化氢质量分数2.0％、超声时间2.5h。
表2正交试验设计及结果
Figure BDA0003908743140000062
Figure BDA0003908743140000071
表3方差分析结果
Figure BDA0003908743140000072
实施例4
制备降解多糖UH-CSFP，精确称量CSFP样品于50mL离心管中，蒸馏水溶解，使得多糖质量浓度为5mg/mL，加入一定体积30％H2O2溶液，使其质量浓度为2％，超声波功率40KHz，反应温度65℃，反应时间2.5h；制备H-CSFP，条件：多糖质量浓度为5mg/mL，2％H2O2，反应温度65℃，反应时间2.5h；制备U-CSFP，条件：多糖质量浓度为5mg/mL，超声波功率40KHz，反应温度65℃，反应时间为2.5h。
反应完后流水冷却至室温，制备UH-CSFP和H-CSFP需加入NaHSO3溶液去除H2O2，采用水杨酸法检测H2O2残留；采用3kD透析袋流水透析1d，蒸馏水透析1d，至到电导率<20μS/cm，加入4倍体积透析液的无水乙醇4℃静置沉淀24h，离心(6500×g，20min)，冻干后得到3种鳞杯伞降解多糖。
分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对鳞杯伞多糖及其降解多糖进行重均分子量Mw的测定，参考何坤明等方法色谱条件：Agilent1260Infinity高效液相色谱仪串联超水凝胶线性凝胶过滤色谱柱，检测器为RID；将鳞杯伞多糖及其降解多糖配制成一定浓度的溶液，离心，上清液过0.45μm滤膜；进样量：20μL；流动相：0.1moL/LNaNO3，流速：0.5mL/min；柱温：35℃。用不同分子量的T-右旋糖酐标品(T-3，T-10，T-40，T-70，T-110)制作标准曲线，根据标准曲线计算样品分子量。
图6为鳞杯伞多糖及其三种降解多糖的HPGPC色谱图。
由图6可以看出，鳞杯伞多糖及其降解产物的HPGPC图谱主峰呈现出不均一性，都有3种组分。由表4可知，未降解多糖CSFP三个组分的重均分子量范围是5.346×103Da～4.176×106Da，而三种降解多糖H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP重均分子量范围分别是4.998×103Da～4.088×106Da、5.124×103Da～3.997×106Da、4.930×103Da～3.918×106Da，表明鳞杯伞多糖经过这三种方法降解后，分子量有不同程度的降低，降解条件温和，数量级没有发生变化。从峰面积占比角度分析可知，CSFP经过这三种方法降解后，峰1的分子量普遍减小，但峰面积占比变大，说明降解使得该组分得到富集，其中联合降解法所得多糖UH-CSFP的分子量最低，峰面积比最大，说明了联合降解法较单一降解法对分子量的影响大。峰3在三种组分中所占峰面积比最小，且经过这三种方法降解所得多糖的分子量和峰面积比都减小，说明CSFP经过降解后小分子量多糖占比减少。峰2是这四种多糖中峰面积比最大的组分，降解后，峰面积比减小，但分子量有明显增加。
表4鳞杯伞多糖及其降解多糖的分子量
Figure BDA0003908743140000081
单糖组成测定
采用Thermo ICS5000离子色谱系统进行单糖组成的测定。以岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖等为标准品。精密称量10mg样品置于安瓿瓶中，加入3moL/L TFA10mL，120℃水解3h。完全反应后，冷却并将水解液与甲醇混合后用氮气吹干。用去离子水溶解样品，12000g离心5min。色谱柱：DionexTM CarbopacTMPA 20(3*150)；流动相：A：H2O；B：15mmol/L NaOH；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
图7为标准单糖、CSFP及其降解多糖的离子色谱图，其中1.盐酸氨基葡萄糖2.半乳糖3.葡萄糖4.木糖5.甘露糖
表5鳞杯伞多糖及其降解多糖的单糖组成
Figure BDA0003908743140000091
CSFP及其降解多糖的单糖组成结果见图7与表5。结果表明，这四种多糖样品单糖种类没有变化，均为中性杂多糖，主要由葡萄糖，甘露糖，半乳糖，木糖以及盐酸氨基葡萄糖组成，但是摩尔比不同。说明降解处理没有改变多糖的单糖类型。降解处理后，三种降解多糖的葡萄糖摩尔比均降低，甘露糖和半乳糖摩尔比升高。可能原因是α-D-葡萄糖，β-D-葡萄糖，D-甘露糖和D-半乳糖四种单糖分子式相同并且分子空间结构相近，属于同分异构体，在降解的过程中，葡萄糖空间构象发生转变使其摩尔比下降，其他单糖摩尔比增加，降解前后盐酸氨基葡萄糖摩尔比基本不变。
总还原力测定
根据YUJB等方法，进行总还原力能力的测定。
总还原力(S3)计算公式为：(S3)＝A1-A2-A0
式中：A1为多糖溶液、K3Fe(CN)6溶液、三氯乙酸溶液、FeCl3溶液的吸光值；A2为磷酸盐缓冲溶液(0.2moL/L，pH＝6.6)分别代替K3Fe(CN)6溶液、三氯乙酸溶液、FeCl3溶液的吸光值；A0为蒸馏水代替多糖溶液的吸光值。
图8表明鳞杯伞多糖及其降解多糖的总还原力。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
由图8可知，在1.0-10.0mg/mL浓度范围内，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP的总还原力与浓度呈正相关。当浓度为10.0mg/mL时，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP的总还原力分别为0.468±0.016、0.629±0.018、0.767±0.049、0.965±0.027。虽然在试验浓度范围内，UH-CSFP的还原力都低于同等浓度下的抗坏血酸，但UH-CSFP仍表现出了比CSFP更强的还原能力。
DPPH自由基测定
称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。分别取2mL不同浓度(0.25，0.5，1，2，4mg/mL)的溶液，加入2mLDPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用Vc作为阳性对照。样品对DPPH自由基的清除率(S1)用以下公式计算：
Figure BDA0003908743140000101
式中：A0为蒸馏水、DPPH和甲醇的吸光值；A1为多糖溶液、DPPH和甲醇的吸光值；A2为多糖溶液和甲醇的吸光值。
图9为鳞杯伞多糖及其降解多糖对DPPH自由基的清除率。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
由图9可知，多糖浓度在0.25～4.00mg/mL范围内，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP抗氧化活性与其浓度呈正相关，对DPPH自由基的IC50分别为0.830±0.002、0.767±0.046、0.622±0.030、0.412±0.048mg/mL；0.832±0.005、0.724±0.004、0.621±0.008、0.613±0.017mg/mL，说明UH-CSFP具有更好的抗氧化活性。
ABTS自由基测定
ABTS自由基清除能力的测定按照ABTS试剂盒说明书进行，按照试剂盒说明书进行计算，VC作阳性对照。
总还原力(S3)计算公式为：(S3)＝A1-A2-A0
式中：A1为多糖溶液、K3Fe(CN)6溶液、三氯乙酸溶液、FeCl3溶液的吸光值；A2为磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH＝6.6)分别代替K3Fe(CN)6溶液、三氯乙酸溶液、FeCl3溶液的吸光值；A0为蒸馏水代替多糖溶液的吸光值。
图10为鳞杯伞多糖及其降解多糖对ABTS自由基的清除率。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
由图10可知，多糖浓度在0.25～4.00mg/mL范围内，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP对ABTS自由基的清除能力随多糖浓度提高而增强，呈现浓度依赖性。他们的IC50分别为0.830±0.002、0.767±0.046、0.622±0.030、0.412±0.048mg/mL；0.832±0.005、0.724±0.004、0.621±0.008、0.613±0.017mg/mL，CSFP经过降解后，对ABTS自由基的清除能力显著提高(P<0.05)。
·OH自由基测定
50μL不同浓度的样品水溶液，依次加入50μLFeSO4(6Mmol),100μLH2O2(6Mmol)，充分摇匀后室温放置10min；加入50μL水杨酸(6Mmol，乙醇溶解)充分摇匀室温放置30min。510nm处测定吸光度值。重复3次取平均值；Vc作为阳性对照。
·OH自由基清除率(S2)计算公式为：
Figure BDA0003908743140000111
式中：A0为FeSO4溶液、水杨酸溶液、多糖溶液和蒸馏水的吸光值；A1为多糖溶液代替蒸馏水的吸光值；A2为蒸馏水和甲醇分别代替FeSO4溶液和水杨酸溶液的吸光值。
图11为鳞杯伞多糖及其降解多糖对·OH自由基的清除率。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
CSFP与降解多糖对·OH自由基的清除率的变化趋势与DPPH与ABTS自由基的一致。CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP对·OH自由基的IC50分别为2.231±0.003、1.625±0.034、1.252±0.040、1.075±0.028mg/mL。同一浓度下，UH-CSFP的总还原力、对DPPH、ABTS自由基以及·OH自由基的清除率均高于CSFP及其它降解多糖。抗氧化性从高到低为VC＞UH-CSFP＞U-CSFP＞H-CSFP＞CSFP。说明UH-CSFP能够作为外源性抗氧化剂，参与机体中自由基的清除，进而减缓氧化对机体的损伤。
对RAW264.7存活力影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，按照每孔150μL加入96孔细胞培养板中，在37℃，5％CO2条件下过夜培养12h，弃去培养基，向空位中替换150μL含有不同浓度多糖的DMEM完全培养基，设立正常组及空白培养基组，每组设置6个复孔，培养24h后，弃去上清液，每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，于37℃继续培养4h，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，使用多功能型酶标仪，测定490nm波长下的吸光值。
计算公式为：细胞存活率(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_正常组-A_空白组)×100
图12为鳞杯伞多糖及其降解多糖对RAW264.7细胞存活力的影响。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
从图12可以看出，CSFP及其降解多糖对巨噬细胞RAW264.7的增殖活力影响不同。多糖浓度在0～1000μg/mL范围内，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP均可促进RAW264.7细胞的生长。当这四种多糖的浓度高于2000μg/mL时，抑制细胞增殖。值得注意的是，当多糖浓度在100～400μg/mL之间，U-CSFP和UH-CSFP对RAW264.7的增殖作用显著高于CSFP(P<0.05)，当多糖浓度为400ug/mL时，UH-CSFP对RAW264.7的增殖作用最高，达到181.5％±6.84％。研究表明，鳞杯伞多糖和其降解多糖均能促进RAW264.7细胞的增殖，从而提高免疫力。
对RAW264.7吞噬力影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，按照每孔150μL加入96孔细胞培养板中，在37℃，5％CO2条件下过夜培养12h，弃去培养基，向空位中替换150μL含有不同浓度多糖的DMEM完全培养基，每组设置4个复孔，并且设立正常组及空白培养基组，各实验组设6个复孔，培养24h后，将上清液舍弃，加入100μL0.075％中性红PBS溶液，并继续培养2h，弃去上清液，用PBS清洗3次，每孔加100μL细胞裂解液，4℃静置过夜，使用酶标仪在540nm波长处测定吸光值，LPS为阳性对照。
计算公式为：细胞吞噬率(％)＝(A_实验组-A_空白组)/(A_正常组-A_空白组)×100
图13为鳞杯伞多糖及其降解多糖对RAW264.7细胞吞噬活性的影响。注：字母不同表示组内和组间差异显著(P<0.05)
图13为CSFP及其降解多糖对巨噬细胞RAW264.7的吞噬指数影响结果。多糖浓度在50～800μg/mL范围内，CSFP、H-CSFP、U-CSFP、UH-CSFP均可提高RAW264.7细胞的吞噬能力。当多糖浓度在50～200μg/mL之间，CSFP及其降解多糖对RAW264.7的增殖作用与多糖浓度呈正相关，且UH-CSFP对RAW264.7的增殖作用均高于其他多糖，当多糖浓度为200μg/mL，UH-CSFP诱导的RAW264.7的吞噬活力最高，达到161.6±0.54％，显著高于CSFP和H-CSFP(P<0.05)。当多糖浓度在200～800μg/mL，CSFP及其降解多糖对RAW264.7的吞噬作用与多糖浓度呈负相关，当多糖浓度高于1000μg/mL时，除UH-CSFP外，其他三种多糖开始抑制RAW264.7吞噬能力。表明在一定浓度范围内，UH-CSFP比CSFP更能提高RAW264.7细胞吞噬活力。
对炎症因子分泌的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，试验组加入150μL加入多糖的完全培养基，使多糖浓度为200μg/mL，空白对照组和阳性对照组加入150μL的完全培养基，在37℃，5％CO2条件下过夜培养12h，弃去上清液，实验组和阳性对照组加入150μL浓度为1.0μg/mLLPS的DMEM高糖培养基，阴性对照组加入150μLDMEM高糖培养基，继续培养4h，取上清液待测，各实验组设4个复孔，根据ELISA试剂盒使用说明书，检测细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β的含量。
图14为鳞杯伞多糖及其降解多糖对巨噬细胞RAW264.7炎症因子TNF-α、1L-6、1L-10、TGF-β分泌的影响，其中，TNF-α,1L-6,1L-10andTGF-βinRAW264.7aTNF-α含量；b1L-6含量；c1L-10含量；dTGF-β含量。注：字母不同表示各组间差异显著(P<0.05)。
图14为经过含200μg/mL多糖的高糖培养基孵育RAW264.7细胞12h后，再用LPS刺激4h进行炎症因子的测定结果。图14a说明，LPS组显著高于DMEM组(P＜0.05)，与LPS组比较，这四种多糖对RAW264.7细胞上清中TNF-α含量有显著降低作用(P＜0.05)；与CSFP组相比，降解多糖对TNF-α含量降低效果显著(P＜0.05)；但降解多糖之间无显著性差异(P>0.05)。图14b与14a结果相相似，值得注意的是，U-CSFP和UH-CSFP对RAW264.7细胞上清中1L-6的降低作用显著高于CSFP组(P＜0.05)，其中UH-CSFP组降低效果最好。图14c表示，LPS组细胞上清液中1L-10含量显著高于DMEM组，模型显著(P＜0.05)，UH-CSFP对LPS刺激的RAW264.7产生的1L-10含量显著高于LPS组和其它多糖组(P＜0.05)。图14d表示，LPS组细胞上清液中产生的TGF-β含量小于DMEM组，模型不显著(P>0.05)，降解多糖组比LPS组细胞上清液中TGF-β浓度更高，具有显著性(P＜0.05)。根据这些结果可得出，鳞杯伞降解多糖UH-CSFP具有比CSFP对RAW264.7更强的免疫调节作用，这可能是因为多糖分子量变小后，分子体积也随之变小，有利于多糖发挥生物学功能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种制备鳞杯伞降解多糖的方法，为在水中，对鳞杯伞多糖进行超声辅助过氧化氢降解反应，得到鳞杯伞降解多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应体系中，鳞杯伞多糖的质量浓度为2.5-7.5mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为60℃-75℃。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：反应体系中的过氧化氢质量分数为1.0％-2.0％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述反应的时间为2.0h-3.0h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所得鳞杯伞降解多糖的降解率达87.95％。
7.由权利要求1-6中任一项所述方法制备的鳞杯伞降解多糖在制备抗炎和抗氧化产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。
CN202211326885.5A 2022-10-26 2022-10-26 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法 Active CN115536761B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211326885.5A CN115536761B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211326885.5A CN115536761B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115536761A true CN115536761A (zh) 2022-12-30
CN115536761B CN115536761B (zh) 2023-11-28

Family

ID=84718038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211326885.5A Active CN115536761B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115536761B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109553695A (zh) * 2018-12-03 2019-04-02 蚌埠学院 利用超声波辅助提取土生鳞伞菌丝体多糖的方法
CN111285939A (zh) * 2020-03-19 2020-06-16 华南理工大学 一种具有抗氧化和调节肠道菌群功效的海蒿子多糖及其制备方法与应用
CN112125981A (zh) * 2020-09-21 2020-12-25 郭杰 一种分子量可控的多糖降解方法及低分子量多糖
CN113307894A (zh) * 2021-07-01 2021-08-27 上海应用技术大学 一种超声波辅助过氧化氢法增溶酵母β-葡聚糖的方法
CN115160450A (zh) * 2022-08-17 2022-10-11 山西农业大学 鳞杯伞多糖的快速制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109553695A (zh) * 2018-12-03 2019-04-02 蚌埠学院 利用超声波辅助提取土生鳞伞菌丝体多糖的方法
CN111285939A (zh) * 2020-03-19 2020-06-16 华南理工大学 一种具有抗氧化和调节肠道菌群功效的海蒿子多糖及其制备方法与应用
CN112125981A (zh) * 2020-09-21 2020-12-25 郭杰 一种分子量可控的多糖降解方法及低分子量多糖
CN113307894A (zh) * 2021-07-01 2021-08-27 上海应用技术大学 一种超声波辅助过氧化氢法增溶酵母β-葡聚糖的方法
CN115160450A (zh) * 2022-08-17 2022-10-11 山西农业大学 鳞杯伞多糖的快速制备方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGDONG GUO等: "Two Novel Polysaccharides From Clitocybe squamulosa: Their Isolation, Structures, and Bioactivities", 《FRONTIERS IN NUTRITION》, vol. 9, pages 1 - 15 *
张海芸等: "降解对植物多糖理化性质以及生物活性影响的研究", 《食品与发酵科技》, vol. 55, no. 3, pages 15 - 19 *
郭东东等: "鳞杯伞子实体多糖提取工艺优化及其结构与理化性质", 《食用菌学报》, vol. 28, no. 4, pages 39 - 47 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115536761B (zh) 2023-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lin et al. Ultrasound-assisted enzyme extraction and properties of Shatian pomelo peel polysaccharide
CN116217745B (zh) 一种藤茶多糖、制备方法及应用
CN113278091A (zh) 一种紫球藻多糖及其制备方法和应用
CN115028750B (zh) 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用
CN113274490A (zh) 一种长茎葡萄蕨藻多糖抗病诱导剂的制备方法及应用
CN107012184B (zh) 一种酶法提取的川白芷多糖及制备方法和应用
CN113651898A (zh) 一种鸡腿菇菌丝体多糖及其制备方法和应用
CN108503724B (zh) 蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和应用
CN115536761B (zh) 一种具有抗炎和抗氧化活性的食用菌降解多糖的制备方法
CN103755827A (zh) 粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗肾衰药的用途
CN112574323A (zh) 一种香水莲花多糖及其制备方法
CN107987179B (zh) 一种低硫酸化岩藻半乳聚糖在制备免疫增强剂中的应用
CN107011456B (zh) 一种绿藻多糖及其制备方法
CN104004109B (zh) 海洋硫酸酯化糖胺聚糖se-3及其制备方法
CN108641005B (zh) 一种硫酸化紫锥菊多糖的制备方法及其应用
CN104119427B (zh) 一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途
CN114984036A (zh) 槐桑黄多糖提取物在抗氧化、增强免疫力中的应用
CN106946998A (zh) 一种天然抗氧化剂灰喇叭菌多糖ccpp‑1及其制备方法和用途
CN114874346A (zh) 一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用
CN113817076A (zh) 一种具有免疫调节活性的点柄乳牛肝菌多糖sgp2-1及其制备方法和应用
CN109021132B (zh) 广东虫草多糖ccg-psw和ccg-pss及制备方法与应用
CN110218263B (zh) 一种猴头菇菌糠多糖、制备方法及应用
US20200069724A1 (en) Myrtle Polysaccharide P1, the Separation Method Thereof and the Use in Preparing Hypolipidemic Drugs Therefor
yan et al. Hypolipidemic Effects of Mesona chinensis Benth Polysaccharides with Different Structures and Molecular Weights
CN115232225B (zh) 一种熟地黄均一多糖及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant