CN112574323A - 一种香水莲花多糖及其制备方法 - Google Patents

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程建华
罗志刚
周心慧
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South China University of Technology SCUT
South China Institute of Collaborative Innovation
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Abstract

本发明公开了一种香水莲花多糖及其制备方法，包括如下步骤：步骤一：将香水莲花粉碎后过筛，得到香水莲花粗粉；向香水莲花粗粉中加入乙醇，加热回流，滤渣烘干得香水莲花粉末；步骤二：向香水莲花粉末中加入水，超声处理，加热搅拌提取，过滤，减压浓缩，得到浓缩的香水莲花粗多糖溶液；步骤三：向香水莲花粗多糖溶液中加入经过预处理的大孔树脂，加热搅拌吸附，抽滤得到脱色脱蛋白的多糖溶液，减压浓缩，得到浓缩糖液；步骤四：向浓缩糖液中加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀物并真空干燥，得到香水莲花多糖。本发明提取率高，所得多糖分子量高，约1100Kda，其外观淡黄色，纯度高、色泽均匀稳定，具有良好的保湿、抗氧化性、抗炎活性。

Description

一种香水莲花多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及天然活性物质的提取，提供一种香水莲花多糖及其制备方法。
背景技术
香水莲花，是睡莲科睡莲属水生宿根草本植物。目前，已有金、紫、蓝、黄、白、红等九种颜色，因此又名九品香水莲花。目前在广东珠海、广西柳州、福建、四川等地都有种植基地，资源丰富。然而，香水莲花除了用作观赏，其主要产品仅有香水莲花茶。研究表明，香水莲花具有降血脂、抗氧化、美白、护肝等功能。香水莲花的食用安全性也得到了证实。深度挖掘功效成分，能提高香水莲花的附加值。
香水莲花中多糖含量丰富，但未得到广泛深入的开发。香水莲花多糖是一种绿色天然的植物多糖，满足了现代人们对无添加、无刺激、无毒提取物的追求。香水莲花多糖具有良好的保湿、抗氧化、抗炎等功效，可用于化妆品领域；具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、增强免疫力等功效，可应用于食品、药品、功能食品等领域。
目前，香水莲花多糖的制备方法主要是沸水提取后醇沉，该方法提取温度高，提取效率低，对多糖结构破坏较大且纯度低，色泽不均，无法满足人们对其多糖广泛应用的需求。已有研究中，莲花多糖的除蛋白采用Sevage法、三氯乙酸法，导致氯仿、三氯乙酸等剧毒试剂的残留，且多糖损失量高。研究表明，过氧化氢法对多糖脱色效果显著，该方法在氧化色素的同时会导致多糖分子量的降解，不适用于高分子量香水莲花多糖的制备。当前对香水莲花多糖的研究主要集中在中低分子量200-400kDa，关于高分子量多糖研究较少，且分离纯化中应用DEAE-52以及Sephadex G-150层析柱进行分离，得到多糖纯度高，但得率低，生产成本高，步骤繁琐，不适用于工业化生产。多糖活性和分子量相关，在化妆品中会联合高、中、低分子量多糖设计配方，达到不同层次的保湿效果。高分子量多糖有免疫调节、抗炎、抗氧化、美白、保湿、成膜等性能。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种具有保湿、抗氧化、抗炎活性的高分子量香水莲花多糖的制备方法。采用体外称重法测定多糖在饱和碳酸钠溶液、饱和硫酸铵溶液、干燥变色硅胶的体外保湿性、吸湿性，采用体表仪器测定皮肤角质层水分含量、表皮水分散失量。采用DPPH·自由基、ABTS·自由基、羟自由基、总还原能力作为指标，对多糖抗氧化活性进行评价。采用透明质酸酶活抑制率测定多糖的抗炎活性。为高分子量香水莲花多糖的开发应用提供依据。该方法提取效率高，多糖得率高。
本发明的另一目的在于提供高分子量的香水莲花多糖，得到的多糖纯度高，色泽均一。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种香水莲花多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将香水莲花粉碎后过筛，得到香水莲花粗粉；向香水莲花粗粉中加入乙醇，加热回流，滤渣烘干得香水莲花粉末；
步骤二：向香水莲花粉末中加入水，超声处理，加热搅拌提取，过滤，减压浓缩，得到浓缩的香水莲花粗多糖溶液；
步骤三：向香水莲花粗多糖溶液中加入经过预处理的大孔树脂，加热搅拌吸附，抽滤得到脱色脱蛋白的多糖溶液，减压浓缩，得到浓缩糖液；
步骤四：向浓缩糖液中加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀物并真空干燥，得到香水莲花多糖。
优选地，步骤一中所述加热回流温度为60-80℃，时间为3-5h，乙醇体积分数为90±5％，香水莲花粗粉与乙醇的质量体积比1:3-1:6g/mL。
优选地，步骤二中所述的香水莲花粉末与水的质量比为1:30-1:60，超声时间为10-40min；超声功率为60-400W。
优选地，步骤二中所述的加热温度为55-85℃，时间为2h-4h，搅拌速度为100-300rpm；步骤二中所述的减压浓缩温度为40-70℃。
优选地，步骤三中所述的加入大孔树脂与香水莲花粗多糖溶液的质量体积比为0.5:1-1:1g/mL，加热温度为30-50℃，搅拌时间为3h-6h，搅拌速度为100-300rpm；步骤三中所述的减压浓缩温度为40-70℃。
优选地，步骤三中所述的大孔树脂为AB-8弱极性树脂，购自上海源叶生物科技有限公司。
优选地，步骤三中所述大孔树脂的预处理方法为：将大孔树脂依次用水、乙醇浸泡，清洗至无醇味，再用盐酸浸泡，清洗至pH为中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，清洗至pH为中性，得到经过预处理的AB-8弱极性树脂。
优选地，所述水浸泡时间为6-12h，乙醇浸泡时间为6-12h，乙醇体积分数为70-100％，盐酸浸泡时间为2-4h，盐酸浓度为2-5％，氢氧化钠溶液浸泡时间为2-4h，氢氧化钠溶液浓度为2-5％。
优选地，步骤四中所述的乙醇为无水乙醇或体积分数为90-95％的乙醇溶液，加入的乙醇与浓缩糖液的体积比为3:1-5:1；
所述的沉淀温度0-4℃，沉淀时间为6-12h；
所述的离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-20min；
所述的真空干燥温度为40-60℃，干燥时间为3-5h。
优选地，步骤一中所述的烘干温度为35℃-60℃，烘干时间为10-24h。
本发明采用超声辅助提取香水莲花多糖，利用超声波产生的高速振动和空化效应，加速植物细胞壁的破裂，利于溶剂与多糖的混合，达到提高多糖提取率和缩短提取时间的目的。提取前应用乙醇加热回流除去了大部分脂类、小分子物质、色素等。AB-8大孔树脂吸附除去提取液中的大部分蛋白质以及色素，提高了多糖的纯度以及色泽，避免了氯仿等有毒试剂的残留。采用真空干燥保护多糖的结构以及功能活性，提高多糖的水溶性。GPC测定表明多糖分子量较高，约为1100Kda。体外吸湿、保湿和体表保湿实验表明高分子量香水莲花多糖可作为透明质酸的替代品。四个抗氧化活性指标表明高分子量香水莲花多糖具有良好的抗氧化活性。透明质酸酶活抑制实验表明高分子量香水莲花多糖具有皮肤抗炎活性。
本发明解决了传统沸水提取方法存在的提取率低的问题。除蛋白质、色素采用绿色天然可循环的大孔树脂。采用本发明方法提取的高分子量香水莲花多糖，其外观为淡黄色，纯度高、色泽均匀稳定，是一种良好的天然植物提取物，具有良好的保湿、抗氧化性、抗炎活性。
附图说明
图1是实施例1的GPC谱图。
图2是实施例1的紫外光谱扫描图。
图3是实施例1的红外光谱图。
图4是实施例1的离子色谱图。
图5是实施例1香水莲花多糖和甘油、透明质酸在不同湿度环境下的体外吸湿性、保湿性图；a为43％湿度的吸湿性图，b为81％湿度环境下的保湿性图，c为0％湿度环境下的保湿性图，d为的81％湿度环境下的吸湿性图。
图6是实施例1的体表皮肤水分含量变化率(a)、经皮水分损失变化率(b)。
图7是实施例1对DPPH·(a)、ABTS·(b)、OH·(c)的清除活性及总还原力(d)。
图8是实施例1香水莲花多糖和甘草酸二钾对透明质酸酶活抑制性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1从香水莲花中制备高分子香水莲花多糖：
(1)香水莲花粉碎后过40目筛，称取200g香水莲花粗粉置于600mL体积分数为90％的乙醇中，70℃加热回流3h，滤纸过滤，滤渣置于40℃烘箱中干燥12h，得到香水莲花粉末。
(2)准确称取香水莲花粉末100g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:30，200W超声30min后，水浴锅中70℃加热提取4h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至300mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。
(3)AB-8大孔树脂用去离子水浸泡6h，然后用体积分数为70％的乙醇浸泡6h，去离子水洗至无醇味。3％盐酸溶液浸泡3h，去离子水洗至中性，5％氢氧化钠溶液浸泡3h，去离子水洗至中性备用。向300mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入300g经过预处理的AB-8大孔树脂，35℃加热以200rpm转速搅拌吸附6h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至100mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。
(4)向100mL浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱中沉淀12h，4000r/min离心20min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。以苯酚-硫酸法测定，提取率为10.45％，香水莲花多糖含量为62.36％。
实施例2从香水莲花中制备香水莲花多糖：
(1)香水莲花粉碎后过40目筛，称取200g香水莲花粗粉置于600mL体积分数为90％的乙醇中，80℃加热回流3h，滤纸过滤，滤渣置于40℃烘箱中干燥12h，得到香水莲花粉末。
(2)准确称取香水莲花粉末100g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:40，250W超声25min后，水浴锅中80℃加热提取3h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至300mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。
(3)AB-8大孔树脂用去离子水浸泡6h，然后用体积分数为70％的乙醇浸泡6h，去离子水洗至无醇味。3％盐酸溶液浸泡3h，去离子水洗至中性，5％氢氧化钠溶液浸泡3h，去离子水洗至中性备用。向300mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入200g经过预处理的AB-8大孔树脂，40℃加热以150rpm转速搅拌吸附5h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至100mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。
(4)向100mL浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，0℃沉淀6h，6000r/min离心15min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。以苯酚-硫酸法测定，提取率为10.2％，香水莲花多糖含量为63.44％。
实施例3从香水莲花中制备香水莲花多糖：
(1)香水莲花粉碎后过40目筛，称取400g香水莲花粗粉置于1600mL体积分数为90％的乙醇中，70℃加热回流3h，滤纸过滤，滤渣置于40℃烘箱中干燥10h，得到香水莲花粉末。
(2)准确称取香水莲花粉末200g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:50，300W超声25min后，水浴锅中70℃加热提取3h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪60℃减压浓缩至400mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。
(3)AB-8大孔树脂用去离子水浸泡6h，然后用体积分数为70％的乙醇浸泡6h，去离子水洗至无醇味。3％盐酸溶液浸泡3h，去离子水洗至中性，5％氢氧化钠溶液浸泡3h，去离子水洗至中性备用。向400mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入200g经过预处理的AB-8大孔树脂，45℃加热以150rpm转速搅拌吸附4h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪60℃减压浓缩至200mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。
(4)向200mL浓缩糖液中加入4倍体积的90％乙醇，0℃沉淀6h，8000r/min离心10min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。以苯酚-硫酸法测定，提取率为11.07％，香水莲花多糖含量为60.25％。
对照组1：准确称取香水莲花粉末100g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:30，水浴锅中70℃加热提取4h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至300mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。向300mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入300g经过预处理的AB-8大孔树脂，35℃加热以200rpm转速搅拌吸附6h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至100mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。向100mL浓缩糖液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱中沉淀12h，4000r/min离心20min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。
对照组2：准确称取香水莲花粉末100g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:30，水浴锅中70℃加热提取4h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至300mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。向300mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入300g经过预处理的AB-8大孔树脂，35℃加热以200rpm转速搅拌吸附6h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至100mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。向浓缩糖液中加入Sevage试剂，多糖液和Sevage试剂的体积比为4:1，振荡30min后，4000r/min离心10min分离糖液，重复5次。向糖液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱中沉淀12h，4000r/min离心20min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。
对照组3：准确称取香水莲花粉末100g，香水莲花粉末与去离子水的质量比为1:30，200W超声30min后，水浴锅中70℃加热提取4h，搅拌桨速度为200rpm，纱布过滤后，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至300mL，得到浓缩的香水莲花粗多糖提取液。向300mL浓缩的香水莲花粗多糖溶液中加入300g经过预处理的AB-8大孔树脂，35℃加热以200rpm转速搅拌吸附6h，抽滤得到脱色的多糖溶液，旋转蒸发仪40℃减压浓缩至100mL，得到浓缩脱色的香水莲花多糖液。向浓缩糖液中加入Sevage试剂，多糖液和Sevage试剂的体积比为4:1，振荡30min后，4000r/min离心10min分离糖液，重复5次。向糖液中加入4倍体积的无水乙醇，4℃冰箱中沉淀12h，4000r/min离心20min，收集沉淀物，60℃真空干燥3h，得到香水莲花多糖。
对实施例1制备的多糖与对照组1～3制备的多糖中蛋白质含量、多糖提取率、多糖含量进行测定。多糖提取率、含量参考苯酚-硫酸法测定。蛋白质含量参考考马斯亮蓝法测定。结果如表1所示，本发明制备的香水莲花多糖的提取率达到10.45％，远高于沸水提取组，且Sevage法处理虽然能除去少量蛋白质，但多糖损失量极高。多糖含量比对照组1～2高，稍低于对照组3，蛋白质含量低于沸水提取组，接近超声后Sevage处理的对照组3。因此，本发明方法具有提取率高的优势。
表1不同香水莲花多糖中蛋白质、总糖含量及多糖提取率
实施例1 对照组1 对照组2 对照组3
蛋白质含量(％) 2.41 3.63 3.04 2.15
总糖含量(％) 62.36 58.12 60.82 64.61
多糖提取率(％) 10.45 4.74 2.95 6.80
以实施例1制备的香水莲花多糖为样品，做如下性能测试：
分子量的测定：
采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定香水莲花多糖分子量。GPC色谱条件：Waters色谱仪，Waters公司色谱柱Ultrahydrogel 120、Ultrahydrogel 250、Ultrahydrogel 500串联，柱温：35℃，流动相为0.02mol/L KH2PO4溶液，pH为6.0，流速0.80mL/min。取不同分子量葡聚糖标准品和香水莲花多糖用流动相配置成2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，进样量为20μL。如图1所示，根据标准曲线，得香水莲花多糖分子量约为1100Kda，为高分子量多糖。
紫外光谱扫描：
未经AB-8树脂处理、AB-8树脂处理、5次Sevage法处理的3种多糖分别配制为1mg/mL的溶液，以蒸馏水作对照，在200-500nm范围内进行紫外扫描。
如图2所示，未经AB-8树脂处理的多糖在260nm附近有紫外吸收，而经AB-8树脂处理后的多糖，在260nm和280nm处均无明显紫外吸收，说明经过AB-8树脂处理后，香水莲花多糖中含蛋白、核酸量很少，且经过AB-8树脂处理效果与5次Sevage法处理相似，说明AB-8树脂有效吸附了香水莲花多糖中的蛋白，且不需要用到氯仿，绿色环保。
红外光谱扫描：
精密称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪在500-4000cm-1范围内进行扫描。
如图3所示，吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3421cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2927cm-1处有一个吸收峰，该峰是多糖的C-H伸缩振动。在1747cm-1有一个吸收峰，归属于C＝O的伸缩振动。在1650cm-1有一个吸收峰，归属于C＝O的伸缩振动。1440cm-1归属于C-O的伸缩振动引起的吸收峰。在1328cm-1有一个吸收峰，归属于C＝O的对称伸缩振动。1230cm-1归属于O-H的变角振动引起的吸收峰。1020cm-1归属于O-H的变角振动引起的吸收峰。在917cm-1有一个吸收峰，归属于非对称环伸缩振动。
单糖组成及糖醛酸含量测定：
通过离子色谱取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液。
取样品5mg左右于安瓿瓶中，加入2M TFA 10ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取100uL加入900uL去离子水，12000rpm离心5min。取上清液进IC分析。
色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；流动相：A：H2O；250mM NaOH；C:50mMNaOH&500mM NaOAC；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
取各单糖标准溶液精密配置0.1、0.5、1、5、10、20、50mg/L梯度浓度标准品作为Standard 1-7。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。
表2香水莲花多糖的单糖组成
Figure BDA0002825954410000081
如图4所示，通过与各单糖标准品保留时间比较，可以确定香水莲花多糖由半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖组成。由表2可知，多糖中半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸含量较高，所占摩尔比分别为36.3％和11.2％。半乳糖、木糖、鼠李糖所占摩尔比分别为16.5％、11.5％和11.0％。
香水莲花多糖体外吸湿性：
精密称取100mg的干燥多糖于称量瓶中，将称量瓶分别敞口置于相对湿度为43％(饱和碳酸钠溶液)和81％(饱和硫酸铵溶液)的干燥器内，分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h取出，称量多糖质量。用甘油和透明质酸作对照。
香水莲花多糖体外保湿性：
精密称取100mg的干燥多糖于称量瓶中，加入40％去离子水，将称量瓶分别敞口置于相对湿度为43％(饱和碳酸钠溶液)和硅胶的干燥器内脱水，分别于0h、12h、24h、36h、48h、60h取出，称量多糖质量。用甘油和透明质酸作对照。
保湿活性结果分析：
如图5-a和5-d所示，在43％湿度和81％湿度环境下，高分子量的香水莲花多糖的吸湿性与透明质酸相似，如图5-b和5-c所示，在43％湿度和干燥硅胶环境下，高分子量的香水莲花多糖的保湿性与透明质酸相似，说明本专利制备的高分子量香水莲花多糖可以作为透明质酸的替代品。
皮肤水分含量MMV、经皮水分散失量TEWL测定：
30名符合条件的志愿者参加测试，性别随机，年龄18～65岁之间。测试环境温度21℃，湿度50％。清洁受试者手臂内侧后，标记3cm×3cm试验区，测试前在符合标准的房间内静坐20min，放松皮肤。受试者按2mg/cm2的用量涂抹1％香水莲花多糖溶液，以1％透明质酸溶液作阳性对照，去离子水作空白对照，测试时间为4h。
在产品使用前、产品使用1h、2h、4h后，皮肤角质层水分含量、皮肤经皮水分流失量进行测量。
体表保湿结果分析：
如图6所示，涂抹1％香水莲花多糖溶液后，皮肤水分含量增加，在2h时，水合度变化率最大，皮肤水分含量达到最高。在1h时，多糖溶液的皮肤水合率高于透明质酸溶液，在2h和4h时，与透明质酸溶液效果相似。在4h内，多糖溶液的经皮水分散失变化率均为负值，显著低于空白组。在1h和2h时，多糖溶液的经皮水分散失变化率低于透明质酸溶液，在4h时，略差于透明质酸溶液。说明本专利制备高分子香水莲花多糖能够给皮肤补水和锁住皮肤水分，效果与透明质酸相似。
香水莲花多糖对DPPH·自由基的清除活性：
配制浓度为2mg/mL的多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。将2.0mL的多糖样品溶液加入到2mL DPPH溶液中，混合均匀并在黑暗中反应30min，测定517nm处的吸光度。
香水莲花多糖对ABTS·自由基的清除活性：
配制浓度为4mg/mL的多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。将7mM的ABTS溶液与2.45mM的过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光静置16h，稀释生成的ABTS+·溶液至其在734nm处吸光值为0.7±0.02。将0.4mL的多糖溶液与3mL的ABTS溶液振荡混匀，室温避光静置30min后，在734nm下测定吸光值。
香水莲花多糖对OH·自由基的清除活性：
配制浓度为5mg/mL的多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。取1.0mL样品溶液依次加入2.0mL FeSO4(9.0mmol/L)溶液、2.0mL水杨酸(9.0mmol/L)溶液然后加入2.0mL H2O2(9.0mmol/L)启动反应，37℃水浴60min后，在510nm下测吸光值。
香水莲花总还原力的测定：
配置5mg/mL的多糖溶液，将其进行稀释。取不同浓度的溶液各1.0mL，加入2.5mL缓冲液(0.2mol/L，PH＝6.6)和1mL 1％铁氰化钾，在50℃的水浴锅中加热30min，冷却后，加入2.5mL三氯乙酸，离心10min，取上清液2mL加入2mL蒸馏水和1mL 0.1％FeCl3溶液，静置10min，以蒸馏水为参比，700nm下测定吸光值。
抗氧化活性结果分析：
如图7所示，DPPH·、ABTS·、OH·清除率随着香水莲花多糖浓度的上升而不断升高，呈现出明显的剂量效应。在0.2mg/mL到0.6mg/mL内，随着多糖浓度的提高，DPPH·清除率从30％上升到75％，在0.6mg/mL到1mg/mL内，上升速度放缓，在0.8mg/mL时，清除率达到最高。在0.1mg/mL到1mg/mL内，随着多糖浓度的提高，ABTS·清除率从10％上升到72％，在1mg/mL到4mg/mL内，上升速度放缓，在2mg/mL时，曲线趋向于平衡。在0.1mg/mL到1mg/mL内，随着多糖浓度的提高，OH·清除率从5％上升到30％，在1mg/mL到5mg/mL内，上升速度放缓，在5mg/mL时，清除率达到最高。在0.1mg/mL到1mg/mL内，随着多糖浓度的提高，吸光度从0.008上升到1.08，在1mg/mL到5mg/mL内，上升速度放缓，在5mg/mL时，吸光值达到最高。
透明质酸酶活性抑制率测定：
将氯化钙溶液、透明质酸酶溶液、醋酸缓冲溶液混合，在37℃保温20min，加入5mg/mL香水莲花多糖溶液及醋酸缓冲溶液，37℃保温20min。加入透明质酸钠溶液，37℃保温30min，常温放置5min，80℃加热20min。加入氢氧化钠溶液、乙酰丙酮溶液，沸水浴加热15min后立即冰上冷却5min后，加入埃尔利希试剂、无水乙醇后，放置20min显色。以甘草酸二钾作为阳性对照。透明质酸酶活性与皮肤炎症相关，加入0.5％香水莲花多糖溶液后，对透明质酸酶活抑制率达到57.69％，接近0.3％甘草酸二钾对透明质酸酶活抑制活性效果，说明香水莲花多糖具有良好的抗炎效果。

Claims (10)

1.一种香水莲花多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将香水莲花粉碎后过筛，得到香水莲花粗粉；向香水莲花粗粉中加入乙醇，加热回流，滤渣烘干得香水莲花粉末；
步骤二：向香水莲花粉末中加入水，超声处理，加热搅拌提取，过滤，减压浓缩，得到浓缩的香水莲花粗多糖溶液；
步骤三：向香水莲花粗多糖溶液中加入经过预处理的大孔树脂，加热搅拌吸附，抽滤得到脱色脱蛋白的多糖溶液，减压浓缩，得到浓缩糖液；
步骤四：向浓缩糖液中加入乙醇进行沉淀，离心，收集沉淀物并真空干燥，得到香水莲花多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述加热回流温度为60-80℃，时间为3-5h，乙醇体积分数为90±5％，香水莲花粗粉与乙醇的质量体积比1:3-1:6g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的香水莲花粉末与水的质量比为1:30-1:60，超声时间为10-40min；超声功率为60-400W。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的加热温度为55-85℃，时间为2h-4h，搅拌速度为100-300rpm；步骤二中所述的减压浓缩温度为40-70℃。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤三中所述的加入大孔树脂与香水莲花粗多糖溶液的质量体积比为0.5:1-1:1g/mL，加热温度为30-50℃，搅拌时间为3h-6h，搅拌速度为100-300rpm；步骤三中所述的减压浓缩温度为40-70℃。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤三中所述的大孔树脂为AB-8弱极性树脂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤三中所述大孔树脂的预处理方法为：将大孔树脂依次用水、乙醇浸泡，清洗至无醇味，再用盐酸浸泡，清洗至pH为中性，再用氢氧化钠溶液浸泡，清洗至pH为中性，得到经过预处理的AB-8弱极性树脂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水浸泡时间为6-12h，乙醇浸泡时间为6-12h，乙醇体积分数为70-100％，盐酸浸泡时间为2-4h，盐酸浓度为2-5％，氢氧化钠溶液浸泡时间为2-4h，氢氧化钠溶液浓度为2-5％。
9.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤四中所述的乙醇为无水乙醇或体积分数为90-95％的乙醇溶液，加入的乙醇与浓缩糖液的体积比为3:1-5:1；所述的沉淀温度0-4℃，沉淀时间为6-12h；所述的离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-20min；所述的真空干燥温度为40-60℃，干燥时间为3-5h；步骤一中所述的烘干温度为35℃-60℃，烘干时间为10-24h。
10.权利要求1～9任意一项所述方法制得的香水莲花多糖。
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