CN115363155A - 一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备 - Google Patents
一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备和应用，所述莲子组合物的比例为：莲子粉3份，海带粉1份，米糠粉1份；益生菌发酵的菌种为：长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母。莲子组合物和混合益生菌菌液进行6个月的固态发酵和48小时的液态发酵后，进行曝气提取，再通过瞬时高温灭菌后滤渣，获得一款具有缓解体力疲劳的饮料。该饮料通过急毒试验验证无任何毒副作用，通过小鼠负重游泳试验证明服用本发明物能够有效延长小鼠力竭时间，说明本发明物安全可食用，且具有缓解体力疲劳的功能。
Description
技术领域
本发明涉及饮料制备领域，具体涉及一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备，属于功能饮料制备和应用领域。
背景技术
长时间过度运动或高强度运动会产生运动性疲劳，导致机体机能和工作效率下降，长期疲劳还会导致内分泌紊乱、免疫力下降，继而出现器质性疾病，影响健康。疲劳产生的同时还会出现能量物质、激素水平、代谢调节酶类、抗氧化系统酶类、代谢产物等内环境的变化。目前，疲劳产生机制主要包括能量耗竭、代谢产物堆积、离子代谢紊乱、保护性抑制、氧自由基损伤-脂质过氧化学说。近些年，国内外学者开展了大量的食源性抗疲劳活性成分的相关研究工作，表明通过补充含有氨基酸类、多糖类、维生素、多酚、生物碱、类胡萝卜素以及皂苷类等天然活性成分的食源性物质，可有效延缓疲劳的发生和促进体力恢复，因此，开发具有抗疲劳功能的保健食品，对于促进人体健康具有积极意义。
莲子，属睡莲科。是植物莲成熟后的种子。从古时起，便作为一种中药。具有补脾止泻、养心安神的功效。此外，莲子味甘性平，食用方便。尤其是对于失眠的人员帮助睡眠有一定的功效。现今，生活压力的增大，越来越多的人员开始承受失眠的痛苦。因而，莲子逐渐变成了十分受欢迎的食物。莲子内不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素，可以提高人体记忆力，促进人体智力发育。也含有大量人体所需的微量元素，例如钙、磷、钾等。可以促进酶的活化，维持神经的传导性，从而维持肌肉的日常伸缩和心跳的律动；其中，磷元素还是细胞核蛋白的主要组成部分，莲子含有的丰富磷元素可以促进体内蛋白质、脂肪、糖类的新陈代谢，维持体内酸碱平衡。莲子内含有大量的生物碱和棉子糖，具有着强心的作用，是一种十分温和的滋补品。
目前，市售缓解体力疲劳的商品大多为化学药物，此类化学药物在延缓疲劳发生和消除疲劳等方面的效果较为突出，但伴随而来会产生很多副作用。因此国内关于安全、有效、无毒副作用缓解体力疲劳的保健食品研究相对比较热门，但其研究工艺较为简单，对发酵物的提取效率也较低，可能直接影响产品缓解体力疲劳的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备方法，通过益生菌发酵莲子组合物不仅能够促进大分子有机物降解为小分子多肽等有效活性成分，还可保留益生菌代谢产生的分子酶和氨基酸等促进健康的物质。
为实现上述目的，解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：原料预处理
(1)莲子粉的制备：莲子选用湖南湘潭7月初的新鲜寸三莲莲子，此时的莲子由于还未完全老化，伴随有一股清香，莲子在当地采摘随即清洗沥干水后使用冷链运输，莲子在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
(2)海带粉的制备：选用山东省威海市荣成的新鲜海带，钙含量高，糖含量低，是海带中品质较高的海带品种，采取新鲜海带后清洗沥干水分后冷链运输，在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
(3)米糠粉的制备：选用黑龙江五常大米米糠，在45℃热风干燥12小时，使用粉碎机将米糠进行粉碎，后过100目筛，再使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
步骤2：固态发酵
(1)发酵物料：将步骤1中获得的莲子粉、海带粉和米糠粉按3:1:1进行混合，操作需在洁净区无菌进行；3份原料再加入7份纯化水，配制成含水量30%的混合物料。
(2)发酵菌种：原料进行固态发酵时使用的菌种为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母的1:1:1混合菌液。发酵时添加1%混合菌液。
(3)发酵过程：将发酵物料和发酵菌种按上述比例转移到提前洗净灭菌烘干的食品级不锈钢发酵桶中，混合均匀，置于30±1℃恒温发酵间中，密封静态发酵6个月；6个月后每半个月取样稀释10倍后检测pH值，当pH值达到4.0时，判断为物料已熟成，完成固态发酵。
步骤3：液态发酵
(1)液态发酵：完成步骤2固态发酵后，将熟成的发酵产物转移到无菌搅拌罐中，每份发酵产物额外添加16份纯化水，控制投料量为6%，密封罐体，控制罐体温度35±1℃，启动搅拌装置，以30 rpm对物料进行充分搅拌，提取莲子组合物发酵后的小分子活性物质和发酵菌种的代谢产物。
(2)排渣：48小时后测量发酵液pH值，当pH值达到3.6时停止搅拌，静置沉淀24小时，将沉淀物从底部排出，保留发酵上清液。
步骤4：曝气滤渣
(1)曝气：将步骤3中上清液通过蠕动泵转移至曝气罐中，通过洁净空气进行间歇曝气发酵，使发酵菌种充分分解料液中的大分子有机营养物质，降解为小分子活性成分，通过间歇曝气沉淀的方法提取料液中有效成分，曝气流量控制为300 L/min，单次曝气时间为6天，沉淀排渣时间为2天，重复间歇曝气沉淀，直至沉淀后的料液中可溶性盐浓度小于4000μS/cm。曝气时温度控制在35±1℃，沉淀时温度保持在25±1℃。
(2)滤渣灌装：曝气沉淀后的料液经过140±2℃瞬时高温灭菌8~10 s后，迅速冷却至常温，依次通过孔径为0.45 μm，0.22 μm的陶瓷膜去除悬浮物，无菌灌装，所得料液即为益生菌发酵莲子组合物饮料。通过无菌验证，饮料中所含总菌数为0 cfu/mL。
本发明采用以上技术方案，具有以下优点：
(1) 本发明物为益生菌发酵莲子组合物饮料，经过验证，无毒副作用，可放心食用。
(2) 本发明物为益生菌发酵莲子组合物饮料，在生产过程中，益生菌分解物料中大分子有机物为小分子多肽等活性成分，更易人体吸收。
(3) 本发明物为益生菌发酵莲子组合物饮料，益生菌发酵期间代谢产生分子酶和氨基酸等物质保留在饮料中，促进肠道健康。
(4) 本发明物含碳量低，可以明显减轻动物的体重，但具备缓解动物体力疲劳的功能。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
附图1为益生菌发酵莲子组合物制备工艺图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1
一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物的制备，具体方法如下：
步骤1：原料预处理
(4)莲子粉的制备：莲子选用湖南湘潭7月初的新鲜寸三莲莲子，此时的莲子由于还未完全老化，伴随有一股清香，莲子在当地采摘随即清洗沥干水后使用冷链运输，莲子在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
(5)海带粉的制备：选用山东省威海市荣成的新鲜海带，钙含量高，糖含量低，是海带中品质较高的海带品种，采取新鲜海带后清洗沥干水分后冷链运输，在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
(6)米糠粉的制备：选用黑龙江五常大米米糠，在45℃热风干燥12小时，使用粉碎机将米糠进行粉碎，后过100目筛，再使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g。
步骤2：固态发酵
(4)发酵物料：将步骤1中获得的莲子粉、海带粉和米糠粉按3:1:1进行混合，操作需在洁净区无菌进行；3份原料再加入7份纯化水，配制成含水量30%的混合物料。
(5)发酵菌种：原料进行固态发酵时使用的菌种为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母的1:1:1混合菌液。发酵时添加1%混合菌液。
(6)发酵过程：将发酵物料和发酵菌种按上述比例转移到提前洗净灭菌烘干的食品级不锈钢发酵桶中，混合均匀，置于30±1℃恒温发酵间中，密封静态发酵6个月；6个月后每半个月取样稀释10倍后检测pH值，当pH值达到4.0时，判断为物料已熟成，完成固态发酵。
步骤3：液态发酵
(3)液态发酵：完成步骤2固态发酵后，将熟成的发酵产物转移到无菌搅拌罐中，每份发酵产物额外添加16份纯化水，控制投料量为6%，密封罐体，控制罐体温度35±1℃，启动搅拌装置，以30 rpm对物料进行充分搅拌，提取莲子组合物发酵后的小分子活性物质和发酵菌种的代谢产物。
(4)排渣：48小时后测量发酵液pH值，当pH值达到3.6时停止搅拌，静置沉淀24小时，将沉淀物从底部排出，保留发酵上清液。
步骤4：曝气滤渣
(3)曝气：将步骤3中上清液通过蠕动泵转移至曝气罐中，通过洁净空气进行间歇曝气发酵，使发酵菌种充分分解料液中的大分子有机营养物质，降解为小分子活性成分，通过间歇曝气沉淀的方法提取料液中有效成分，曝气流量控制为300 L/min，单次曝气时间为6天，沉淀排渣时间为2天，重复间歇曝气沉淀，直至沉淀后的料液中可溶性盐浓度小于4000μS/cm。曝气时温度控制在35±1℃，沉淀时温度保持在25±1℃。
(4)滤渣灌装：曝气沉淀后的料液经过140±2℃瞬时高温灭菌8~10 s后，迅速冷却至常温，依次通过孔径为0.45 μm，0.22 μm的陶瓷膜去除悬浮物，无菌灌装，所得料液即为益生菌发酵莲子组合物饮料。通过无菌验证，饮料中所含总菌数为0 cfu/mL。
实验例1
益生菌发酵莲子组合物的经扣急毒试验
本实验主要针对本发明物的急毒效果通过小鼠灌胃试验进行测定；通过对雌、雄小鼠给以10000mg/kg·bw，连续观察14天，记录体重变化和死亡情况判断急毒效果。
1.1. 样品制备
益生菌发酵莲子组合物，500mL，由实施例1制备。
1.2. 实验动物
健康成年SPF级ICR小鼠20只，雌雄各半，由南京医科大学医药实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（苏）2016-0002，合格证编号：NYD-L-2020110905。实验动物在温度为20～26℃、相对湿度为40%～70%的本中心屏障系统中饲养，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2020-0006。实验鼠维持饲料（Co60辐照）由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证（2019）01008。
1.3. 急毒试验
采用限量法，设定剂量为10000 mg/kg•bw，每组10只动物，雌雄各半。动物检疫3d，试验时雌性体重为19.2～21.0g，雄性体重为19.9～22.3g，试验前动物禁食4h，自由饮水。样品比重1.01，以原液按10 mL/kg•bw，1次灌胃给样，实际剂量为10100 mg/kg•bw。全部动物连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。
1.4. 结果
灌胃给予ICR小鼠10100 mg/kg•bw的菌菇饮料。雌、雄性动物14d试验观察期间，饮食和活动正常，生长良好，未见中毒表现及异常体征，无动物死亡（见表1）。所以，菌菇饮料的雌、雄性小鼠急性经口毒性试验LD50均为大于10100 mg/kg•bw，属实际无毒。
表1 菌菇饮料小鼠急性经口毒性试验结果
实验例2
益生菌发酵莲子组合物缓解体力疲劳的功能检测如下：
本实验主要针对本发明物对缓解体力疲劳的效果通过小鼠灌胃试验进行测定；对照组样品为蒸馏水，本发明物通过剂量设计分为低、中、高剂量3组，分别对应给予小鼠的剂量为8.33 mL·d/kg、16.67 mL·d/kg、33.33 mL·d/kg。
2.1. 样品制备
益生菌发酵莲子组合物，500mL，由实施例1制备。
2.2. 方法
(1) 临床症状观察。每天至少观察临床症状1次并记录包括营养被毛、皮肤粘膜、精神行为、惊厥反射、头部、呼吸功能、消化功能、泌尿生殖、其它等。
(2) 小鼠体重。每周称重记录动物体重2次，观察受试物是否对生长发育有影响。
(3) 血细胞检测。受试物给予第29天，灌胃30分钟后，小鼠经70% CO2吸入麻醉后眼眶采血100μL，稀释4倍后，应用血细胞分析仪进行检测，指标包括白细胞数及分类项、红细胞数及其参数、血小板数等相关项目。
(4) 负重游泳试验。
a. 负重游泳力竭时间测定
受试物给予第30天，灌胃后30分钟后，将尾根部负荷4%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳，水深不少于30cm，水温25±1℃，自小鼠自游泳开始至小鼠下沉7秒不上浮即为负重游泳力竭，记录小鼠负重游泳力竭时间。
b. 血清生化指标检测
迅速将负重游泳后的小鼠取出，70%CO2麻醉后对小鼠进行摘眼球采血，血液静置后3000rpm/分钟，4℃离心10分钟，分离血清，应用生化分析仪检测血清GLU、LDH、CK、UREA、NEFA、LAC、TG含量，使用的试剂盒均来自北京利德曼生化股份有限公司。
c. 肝组织匀浆上清蛋白定量检测
1%肝组织匀浆上清液制备：动物采血后放血处死，准确称取肝组织，按重量（g）：体积（mL）=1:9的比例，加入9倍体积的PBS，在冰水浴条件下机械匀浆，然后2500rpm，离心10分钟，取上清液按1:9稀释为1%组织匀浆，进行测定蛋白定量。
漩涡混匀，静置5分钟，波长562nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
计算公式：待测样本蛋白浓度（gprot/L）=（测定OD值-空白OD值）÷（标准OD值-空白OD值）×蛋白标准品浓度（gprot/L）。
d. 肝组织SOD活性检测
取10%肝组织匀浆上清液，稀释为1%匀浆作为样本待测，检测试剂为南京建成生物工程研究所的SOD测定试剂盒。
取样本0.2mL加试剂，旋涡混匀仪充分混匀1分钟后，以4000rpm/分，离心15分钟，取上清进行CuZn-SOD测定。
同时取生理盐水0.2mL加试剂0.2mL，旋涡混匀仪充分混匀1分钟后，以4000rpm/分，离心15分钟，取上清作CuZn-SOD对照。
混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，测定各管吸光度。
计算公式：SOD活力（U/mgprot）=（对照OD值-测定OD值）÷对照OD值÷50％×反应液总体积（mL）÷取样量÷待测样蛋白浓度（mgprot/L）。
e. 肝组织MDA含量检测
取10%肝组织匀浆上清液。
涡旋混匀以上样品，试管口用保险薄膜扎紧，用针头扎一个小孔，95℃沸水浴40分钟，取出后流水冷却，然后4000rpm/分钟，离心10分钟，取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
计算公式：MDA含量（nmol/mgprot）=（测定OD值-对照OD值）÷（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（10nmol/mL）÷待测样本的蛋白浓度（mgprot/mL）。
f. 肝/肌糖原含量检测
取负重游泳后的小鼠肝脏和肌肉，用生理盐水漂洗，滤纸吸干，称重，按样本重量（mg）:碱液体积（μL）=1:3，一起加入试管中，沸水浴煮20分钟，流水冷却，既得糖原水解液。
将糖原水解液进一步制备成糖原检测液：
肝糖原检测液为1%，加双蒸水的量为：肝脏重量×96；
肌糖原检测液为1%，加双蒸水的量为：肝脏重量×16，
混匀放置沸水中煮5分钟，冷却后于波长620nm，光径1cm，空白管调零，测定各管吸光度值。
计算公式：糖原含量（mg/g组织）=测定管OD值/标准管OD值×标准管含量（0.01mg）×样本测试前稀释倍数×10÷1.11
2.3. 结果
(1)临床症状
小鼠连续给予8.33、16.67、33.33mL/kg 本发明物30天，观察皮肤粘膜、被毛、营养、精神行为、惊厥反射、头部、呼吸功能、消化功能、泌尿生殖等无明显异常反应。除中剂量组在灌胃第18天因操作失误造成1只小鼠死亡外，全部试验周期中未发生给予受试物相关的小鼠濒死或死亡。
(2)体重变化
与对照组比较，低、中剂量组在给予受试物第8天至30天小鼠体重具有统计学明显减轻（p<0.05或p<0.01），高剂量组在给予受试物第8天和第29天亦具有统计学明显减轻（p<0.05），其余未见明显统计学差异，见表2。
表2 生命之露缓解体力疲劳试验小鼠体重变化
(3)
(4)血常规变化
与对照组比较，低、中剂量组小鼠MCH具有统计学明显减少（p<0.05），高剂量组PLT亦具有统计学明显减少（p<0.05），其余未见明显统计学差异，见表3。
表3 生命之露缓解体力疲劳试验小鼠血常规变化
| 时间 | N | S | M | H |
| WBC（103cells/μL） | 4.39±2.65 | 3.86±2.18 | 4.69±2.14 | 3.61±1.66 |
| NEUT（103cells/μL） | 1.27±0.75 | 0.89±0.32 | 1.08±0.58 | 0.78±0.4 |
| LYMPH（103cells/μL） | 2.86±2.02 | 2.73±2.17 | 3.33±1.6 | 2.55±1.53 |
| MONO（103cells/μL） | 0.1±0.06 | 0.11±0.09 | 0.1±0.04 | 0.1±0.05 |
| EOS（103cells/μL） | 0.13±0.07 | 0.11±0.06 | 0.16±0.07 | 0.16±0.11 |
| BASO（103cells/μL） | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
| NEUT% | 30.47±11.98 | 29.85±16.19 | 23.01±6.82 | 23.51±13.36 |
| LYMPH% | 63.03±13.08 | 63.41±17.44 | 70.55±8.19 | 68.04±17.16 |
| MONO% | 2.61±1.4 | 2.69±1.38 | 2.24±0.83 | 3.16±1.75 |
| EOS% | 3.24±1.87 | 3.47±2.25 | 3.47±1.2 | 4.79±3.6 |
| BASO% | 0.03±0.06 | 0.01±0.04 | 0.03±0.08 | 0.03±0.09 |
| RBC（106cells /μL） | 9.05±0.87 | 9.37±0.79 | 9.53±0.98 | 9.2±0.69 |
| HGB（g/dL） | 15.25±1.42 | 15.04±1.05 | 15.29±1.3 | 14.88±0.93 |
| HCT（%） | 11.49±1.16 | 11.82±1.02 | 11.91±1.14 | 11.54±0.88 |
| MCV（fL） | 50.89±1.52 | 50.45±1.52 | 50.01±1.49 | 50.13±1.74 |
| MCH（pg） | 16.89±1.41 | 16.1±0.65 | 16.08±0.73 | 16.2±0.79 |
| MCHC（g/dL） | 33.17±2.72 | 31.93±0.95 | 32.18±1.66 | 32.32±1.39 |
| RDW（%） | 13.25±0.75 | 12.93±0.92 | 12.95±0.68 | 13.15±0.59 |
| PLT（103cells/μL） | 1268.27±162.84 | 1270.4±209.34 | 1278.29±170.05 | 1139.2±121.65 |
| PCT（%） | 0.27±0.05 | 0.27±0.03 | 0.27±0.04 | 0.24±0.02 |
| PDW（fL） | 48.3±6.51 | 46.53±6.05 | 46.36±7.38 | 47.15±6.43 |
| MPV（fL） | 8.52±0.61 | 8.46±0.56 | 8.49±0.61 | 8.58±0.65 |
| Retic（109cells/L） | 286.53±46.83 | 265.31±41.15 | 303.89±57.18 | 320.29±75.37 |
(5)负重游泳力竭时间及血清指标变化
与对照组比较，给予受试物30天，低、中、高剂量组负重游泳力竭时间明显增加（p<0.05），力竭后血清LDH和UREA含量明显降低（p<0.05或p<0.01）；低剂量组的力竭后血清NEFA含量明显增加（p<0.05），高剂量组力竭后血清TG含量明显降低（p<0.05）；各组之间力竭后血清GLU、CK、LAC含量无明显统计学差异（p>0.05），见表4。
表4 生命之露缓解体力疲劳试验
小鼠负重游泳力竭时间及血清指标变化
| 观察指标 | N组 | S组 | M组 | H组 |
| 负重游泳力竭时间（s） | 175.85±14.78 | 248.46±69.25 | 262.77±88.46 | 253.69±89.67 |
| 力竭后血清GLU(mmol/L） | 12.95±2.1 | 12.37±1.83 | 12.28±1.63 | 13.9±1.1 |
| 力竭后血清LDH（U/L） | 686.42±176.97 | 528.31±133.21 | 526.08±155.96 | 554.31±99.62 |
| 力竭后血清CK（U/L） | 1132.23±602.6 | 1281.15±298.88 | 972.77±398.19 | 1298.31±363.75 |
| 力竭后血清UREA（mmol/L） | 7.27±1.36 | 5.75±0.96 | 6±0.98 | 5.99±1.58 |
| 力竭后血清NEFA(mmol/L) | 0.77±0.25 | 1.01±0.2 | 0.9±0.33 | 0.93±0.25 |
| 力竭后血清LAC(mmol/L) | 14.48±2.11 | 14.32±2.17 | 14.07±2.16 | 13.2±1.97 |
| 力竭后血清TG（mmol/dL） | 1.19±0.18 | 1.18±0.2 | 1.09±0.2 | 1.03±0.14 |
(6)负重游泳力竭后肝脏相关指标及肌糖原变化
与对照组比较，给予受试物30天，低、中、高剂量组力竭后肝组织MDA含量明显下降（p<0.05或p<0.01），肝组织CuZn-SOD活力显著降低而高剂量组肌糖原含量显著增加（p<0.01），其余无明显统计学差异（p>0.05），见表5。
表5 生命之露缓解体力疲劳试验
小鼠负重游泳后肝脏相关指标及肌糖原变化
| 观察指标 | N组 | S组 | M组 | H组 |
| 肝组织CuZn-SOD活力（U/mgprot） | 243.46±28.2 | 229.46±24.01 | 239±29.65 | 180.73±41.81 |
| 肝组织MDA含量（nmol/mgprot） | 11.76±1.4 | 9.76±2.5 | 8.43±1.1 | 8.31±2.32 |
| 肝糖原含量（mg/g） | 19.56±4.74 | 20.9±4.93 | 26.5±7.26 | 15.13±10.16 |
| 肌糖原含量（mg/g） | 0.21±0.05 | 0.22±0.08 | 0.26±0.07 | 0.29±0.04 |
2.4. 分析
本试验通过血常规检测，负重游泳试验力竭时间，负重游泳力竭后血清葡萄糖（GLU）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、尿素（UREA）、游离脂肪酸（NEFA）、血乳酸（LAC）、甘油三酯（TG）测定，肝组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肝糖原和肌糖原检测，评价本发明物是否具有缓解体力疲劳功能。结果显示，小鼠连续给予8.33、16.67、33.33mL/kg本发明物30天，临床观察无明显异常反应；低、中剂量组在给予受试物第8天至30天，高剂量组在第8天和第29天小鼠体重较对照组具有统计学明显减轻，但平均体重降低幅度在5-8%之间，其生物学意义尚待进一步研究；低、中剂量组小鼠MCH较对照组具有统计学明显减少，但平均MCH降低幅度小于5%，无明显生物学意义，高剂量组PLT较对照组具有统计学明显减少，平均PLT少幅度10.18%，需进一步研究。与对照组比较，给予受试物30天，低、中、高剂量组负重游泳力竭时间明显增加，力竭后血清LDH、UREA含量和肝组织MDA含量明显降低；低剂量组的力竭后血清NEFA明显增加，高剂量组血清TG含量和肝组织CuZn-SOD活力明显降低，而肌糖原含量显著增加。但各组之间力竭后血清GLU、CK、LAC含量及肝糖原含量无明显统计学差异。
从上述结果可以得出结论，小鼠连续给予8.33、16.67、33.33mL/kg 本发明物30天，3个剂量组均具有一定程度缓解体力疲劳功能，无明显剂量效应关系，低、中剂量组能达到等同甚至优于高剂量组缓解体力疲劳功能。
Claims (10)
1.本发明提供了一种可以缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物，所述莲子组合物的比例如下：莲子粉3份，米糠粉1份，海带粉1份，益生菌发酵菌液为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母的混合菌液，经长期固态发酵和液态发酵，再经气曝后高温瞬时杀菌和陶瓷膜过滤，得到一款澄清的、具有缓解体力疲劳功能的饮料。
2.权利要求1所述一种具有缓解体力疲劳的益生菌发酵莲子组合物饮料的制备方法如下：
步骤1：原料预处理
(1)莲子粉的制备：莲子选用湖南湘潭7月初的新鲜寸三莲莲子，此时的莲子由于还未完全老化，伴随有一股清香，莲子在当地采摘随即清洗沥干水后使用冷链运输，莲子在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g；
(2)海带粉的制备：选用山东省威海市荣成的新鲜海带，钙含量高，糖含量低，是海带中品质较高的海带品种，采取新鲜海带后清洗沥干水分后冷链运输，在-20℃下进行真空冷冻干燥，使得物料含水量低于10%，再通过低温粉碎机将物料粉碎至粒径小于0.15 mm，使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g；
(3)米糠粉的制备：选用黑龙江五常大米米糠，在45℃热风干燥12小时，使用粉碎机将米糠进行粉碎，后过100目筛，再使用臭氧熏蒸18小时，通过菌落总数计数，确保总菌数不高于104 cfu /g；
步骤2：固态发酵
(1)发酵物料：将步骤1中获得的莲子粉、海带粉和米糠粉按比例进行混合，操作需在洁净区无菌进行；添加纯化水混合，获得发酵物料；
(2)发酵菌种：原料进行固态发酵时使用的菌种为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母中的一种或多种，将菌种进行混合后接种至发酵物料中；
(3)发酵过程：将发酵物料和发酵菌种按上述比例转移到提前洗净灭菌烘干的食品级不锈钢发酵桶中，混合均匀，置于恒温发酵间中，密封静态发酵；
步骤3：液态发酵
(1)液态发酵：完成步骤2固态发酵后，将熟成的发酵产物转移到无菌搅拌罐中，添加纯化水，密封罐体，控温发酵，启动搅拌装置，对物料进行充分搅拌，提取莲子组合物发酵后的小分子活性物质和发酵菌种的代谢产物；
(2)排渣：48小时后测量发酵液pH值，当pH值达到低于一定限值后停止搅拌，静置沉淀，将沉淀物从底部排出，保留发酵上清液；
步骤4：曝气滤渣
(1)曝气：将步骤3中上清液通过蠕动泵转移至曝气罐中，通过洁净空气进行间歇曝气发酵，使发酵菌种充分分解料液中的大分子有机营养物质，降解为小分子活性成分，通过间歇曝气沉淀的方法提取料液中有效成分；
(2)滤渣灌装：曝气沉淀后的料液经过瞬时高温灭菌后，迅速冷却至常温，依次通过不同孔径的过滤器去除悬浮物，无菌灌装，所得料液即为益生菌发酵莲子组合物饮料。通过无菌验证，饮料中所含总菌数为0 cfu/mL。
3.权利2中所述步骤2（1）优选的莲子组合物的比例为莲子粉：海带粉：米糠粉=3:1:1；优选的固态发酵添加纯水量为3份发酵原料添加7份纯化水充分混匀。
4.权利2中所述步骤2（2）优选的固态发酵菌种为长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、马克思克鲁维酵母。所述菌种等体积混合，优选的固态发酵菌种添加量为1%。
5.权利2中所述步骤2（3）优选固态发酵温度为30±1℃，优选发酵时间为6个月，所述固态发酵终点pH=4.0。
6.权利2中所述步骤3（1）优选液态发酵投料量为6%，发酵温度为35±1℃，优选搅拌速度为30 rpm，液态发酵终点pH=3.6；优选沉淀时间为24小时。
7.权利2中所述步骤4（1）优选曝气时纯水添加量为物料的100倍，间歇曝气沉淀的曝气流量控制为300 L/min，单次曝气时间为6天，沉淀排渣时间为2天，重复间歇曝气沉淀，直至沉淀后的料液中可溶性盐浓度小于4000 μS/cm。
8.权利2中所述步骤4（1）优选间歇曝气条件为：曝气时控制温度为35±1℃，沉淀时控制温度为25±1℃。
9.权利2中所述步骤4（2）优选高温瞬时灭菌的条件为：140±2℃瞬时高温灭菌8~10秒，迅速冷却至常温。
10.权利2中所述步骤4（2）所述过滤器为为孔径为0.45μm、0.22μm的陶瓷膜过滤器。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20221122 |
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