CN111534466B - 一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法及处理试剂 - Google Patents

一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法及处理试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物分离及保存技术领域，特别是公开了一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，本发明通过使用改良的冻存液，并使用合适的分离方法，将菌群从粪便样品中分离出来，加以保存。这种处理方法可以降低粪便本身对菌群成分的影响，改良的冻存液能够延长菌群的可冻存时间。

Description

一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法及处理试剂
技术领域
本发明涉及微生物分离及冻存技术领域，具体公开了一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，同时还公开了处理用试剂。
背景技术
人体肠道内含有种类丰富的微生物群体，其数量和种类已经被证明与人体多种疾病与健康状态有着紧密的关联。比如研究者发现抑郁症、阿尔茨海默症和糖尿病患者的肠道微生物菌群构成和数量与健康人群有着明显差异。改善肠道微生物菌群的构成和数量有着治疗相关疾病的可能。目前已经有给患者服用健康人群的粪便，改善患者肠道微生物菌群构成，以治疗疾病的案例。
目前对人类粪便收集处理方法为：将收集的粪便样品置入合适大小的冻存管中，将样品置入液氮8～10秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，-190～-210℃冻存。采用的冻存液是：称取甘油700～900g，加入100～300g双蒸水，搅拌稀释后，于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。目前的人类粪便收集处理方法存在以下缺陷：
(1)使用以甘油为基底的冻存液，在样品液氮保存30～40天后，将样品从液氮冻存容器中取出，使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养，样品中微生物群落组成和新鲜样品的差异较大，约20％-40％。
(2)收集的粪便样品不经过任何处理就进行直接冻存，在使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养，发现样品中微生物群落组成和新鲜样品的差异也较大，粪便内的其它杂质对样品中微生物群落组成产生了影响。
现有的处理方法导致粪便本身对菌群成分的影响较大，冻存之后的样品中微生物群落组成和新鲜样品产生了很大差异。基于国内目前还没有一套统一可靠的从粪便中提取肠道微生物并冻存的方法，因此有必要对其进行研究，以提出一种针对人类粪便微生物提取、冻存的可靠的处理方法。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，同时还提供了一种处理试剂。本发明方法具有操作简单、规范的优点，并能很好地保证人类的肠道微生物菌群构成与数量组成能够完好并不受污染的被分离和保存。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，包括以下步骤：
(1)在50ml无菌离心管a中，加入0.8～1.6g的人类粪便样品，之后加入40ml的分离液，在旋涡混合仪上剧烈摇匀2～3min；其中所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟；
(2)将所述无菌离心管a在1000-1500rpm、4℃下，离心4～6min，之后将无菌离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，在10000-12000rpm、4℃下，将所述离心管b离心4～6min，之后抛弃上清液；对无菌离心管a离心时，在1000-1500rpm条件下进行，能够将粪便中一些不可见的有害颗粒也进行有效分离去除；
(3)量取40ml所述分离液，加入所述无菌离心管a中，在旋涡混合仪上摇匀3～4min，之后所述无菌离心管a于1000-1500rpm、4℃下，再离心处理4～6min，之后取出，将所述无菌离心管a中的上清液倒入所述离心管b中，之后再将所述离心管b于10000-12000rpm、4℃下，离心处理4～6min，之后抛弃上清液；
(4)依次重复步骤(2)、步骤(3)、步骤(2)、步骤(3)；
(5)吸取所述离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中，并向所述无菌冻存管中添加1ml的冻存液，得到人类粪便肠道菌群样本；其中所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟。
通过以上步骤(2)～(4)的处理，可以有效地将粪便中的细菌和粪便分离开，经检测，粪便残留物在分离后的菌液中含量不到1％。这样分离出的粪便微生物在以甜菜碱为主要成分的冻存液中可以更好的保存；而且这种分离的菌群在后期制作成药物或者辅助治疗产品时更为健康和安全。甜菜碱作为冻存液的主要组成部分时，对于细菌的保护作用更好，冻存一定时间后，细菌复苏后的存活率更高。
进一步地，所述处理方法还包括样品冻存步骤，所述样品冻存步骤为：将所述步骤(5)得到的人类粪便肠道菌群样本置入液氮8～10秒进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，于-190℃～-210℃条件下冻存。
作为一种优选的实施方案，所述人类粪便样品的含水量为65％～85％，密度为1.1～1.3g/cm3。
作为一种优选的实施方案，所述人类粪便样品通过样品采集、样品封存、样品运输获得，其中所述样品采集是在粪便样品提供者排出粪便后0～3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100-200g；优选采集粪便上层即最后排出的粪便样品。
优选地，所述样品封存是使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
优选地，所述样品运输是将封存好的样品置于恒温箱中，在36～38℃下运输，运输时间控制在0～36小时内。
本发明还提供了一种人类粪便肠道菌群样本的处理试剂，所述处理试剂包括分离液和/或冻存液，所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟获得；所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟获得。
作为一种具体的实施方能，所述的人类粪便肠道菌群样本的处理方法，具体步骤如下：
(1)样品采集：在粪便样品提供者排出粪便后0-3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100-200g；粪便选取上层，最后排出的样品为佳。
(2)样品封存：使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
(3)样品运输：将样品置于恒温箱中，温度设置为36-38摄氏度；运输时间限制在0-36小时内。
(4)样品质检：对样品进行质量检测，检测项目包括含水量(65％-85％)，密度(1.1-1.3g/cm3)。
(5)辅助溶液的配制：
冻存液：称取甜菜碱(betaine)55g-65g，溶于950g-1050g双蒸水中，待溶解后，称取氯化钠(NaCl)8g-9g，加入溶解，121摄氏度，100-110千帕斯卡，灭菌20-25分钟。
分离液：称取氯化钠(NaCl)8g-9g，溶于950g-1050g双蒸水，121摄氏度，110-120千帕斯卡，灭菌20-25分钟。
(6)样品稀释：在50ml无菌离心管a中，加入0.8g到1.6g粪便样品，加入40ml分离液，旋涡混合仪上剧烈摇匀2-3min。
(7)样品处理1：使用1000-1500rpm，4摄氏度，离心离心管a，4-6min；轻轻将离心管a取出(不要剧烈晃动)，将上清液倒入离心管b，10000-12000rpm，4摄氏度，离心4-6min，抛弃上清液。
(8)样品处理2：量取40ml分离液，加入离心管a中，旋涡混合仪上摇匀3-4min，1000-1500rpm，4摄氏度，离心4-6min，将上清液倒入离心管b中，将装有上清液的离心管b，10000-12000rpm，4摄氏度，离心4-6min，弃上清。
(9)样品处理3：依次重复步骤7、步骤8、步骤7、步骤8。
(10)样品处理4：使用1ml冻存液，吸取离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中。
(11)样品处理5：将收集到的粪便样品按照步骤7，步骤8，步骤9和步骤10，分别进行处理。共获得含有粪便微生物的冻存管50管-120管。
(12)样品冻存：将样品置入液氮8秒-10秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，零下190摄氏度-零下210摄氏度冻存。
本发明的有益效果是：本发明处理的构思是使用改良的冻存液，并使用合适的分离方法，将菌群从粪便样品中分离出来，加以保存。这种处理方法可以降低粪便本身对于菌群成分的影响，改良的冻存液能够延长菌群的可冻存时间。本发明方法保证了人类的肠道微生物菌群构成与数量组成能够完好并不受污染地被分离和保存，为日后用于疾病治疗提供安全可靠、优良的原材料。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
粪便提供者：年龄25岁，男性，健康无已知疾病。
(1)样品采集：在粪便样品提供者排出粪便后0-3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品150g；粪便选取上层，最后排出的样品为佳。
(2)样品封存：使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
(3)样品运输：将样品置于恒温箱中，温度设置为36-38摄氏度；运输时间10-12小时。
(4)样品质检：对样品进行质量检测，检测项目包括含水量(65％-85％)，密度(1.1-1.3g/cm3)。检测结果为：含水量在65％-80％之间，密度在1.1-1.2g/cm3范围内，符合要求。
(5)辅助溶液的配制：
冻存液：称取甜菜碱(betaine)55g，溶于950g双蒸水中，待溶解后，称取氯化钠(NaCl)8g，加入溶解，121摄氏度，100-110千帕斯卡，灭菌25分钟。
分离液：称取氯化钠(NaCl)8g，溶于950g双蒸水，121摄氏度，110-120千帕斯卡，灭菌25分钟。
(6)样品稀释：在50ml无菌离心管a中，加入0.8g粪便样品，加入40ml分离液，旋涡混合仪上剧烈摇匀2-3min。
(7)样品处理1：使用1000rpm，4摄氏度，离心离心管a，4min；轻轻将离心管a取出(不要剧烈晃动)，将上清液倒入离心管b，之后离心管b于10000rpm，4摄氏度，离心4min，抛弃上清液。
(8)样品处理2：量取40ml分离液，加入离心管a中，旋涡混合仪上摇匀3min，1000rpm，4摄氏度，离心4min，将上清液倒入离心管b中，将装有上清液的离心管b，10000rpm，4摄氏度，离心4min，弃上清。
(9)样品处理3：依次重复步骤7、步骤8、步骤7、步骤8。
(10)样品处理4：使用1ml冻存液，吸取离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中。
(11)样品处理5：将收集到的150g粪便样品按照步骤7，步骤8，步骤9和步骤10，分别进行处理。共获得含有粪便微生物的冻存管100管。
(12)样品冻存：将样品置入液氮8秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，零下190摄氏度-零下210摄氏度冻存。
分别使用背景技术所述的现有方法和本发明实施例1的方法进行处理和冻存，30天后，将样品从液氮冻存容器中取出，使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养24h后，检测菌群成分，结果如表1。使用现有方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例约在10％-60％，而使用实施例1中方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例被控制在30％以内。采用实施例1方法冻存的粪便中，微生物菌群组成得到更好的保持。
需要说明的是，表1中差异值为负值时，表示测定值低于原始样品中相应菌种的含量，相反，表1中差异值为正值时，表示测定值高于原始样品中相应菌种的含量，表2和表3同。
表1
Figure BDA0002492303340000091
实施例2
粪便提供者：年龄32岁，女性，健康无已知疾病。
(1)样品采集：在粪便样品提供者排出粪便后0-3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品200g；粪便选取上层，最后排出的样品为佳。
(2)样品封存：使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
(3)样品运输：将样品置于恒温箱中，温度设置为36-38摄氏度；运输时间限制在0-36小时内。
(4)样品质检：对样品进行质量检测，检测项目包括含水量(65％-85％)，密度(1.1-1.3g/cm3)。检测结果为：含水量在75％-85％之间，密度在1.1-1.3g/cm3范围内，符合要求。
(5)辅助溶液的配制：
冻存液：称取甜菜碱(betaine)65g，溶于1050g双蒸水中，待溶解后，称取氯化钠(NaCl)9g，加入溶解，121摄氏度，100-110千帕斯卡，灭菌25分钟。
分离液：称取氯化钠(NaCl)9g，溶于1050g双蒸水，121摄氏度，110-120千帕斯卡，灭菌25分钟。
(6)样品稀释：在50ml无菌离心管a中，加入1.6g粪便样品，加入40ml分离液，旋涡混合仪上剧烈摇匀3min。
(7)样品处理1：使用1500rpm，4摄氏度，离心离心管a，6min；轻轻将离心管a取出(不要剧烈晃动)，将上清液倒入离心管b，12000rpm，4摄氏度，离心6min，抛弃上清液。
(8)样品处理2：量取40ml分离液，加入离心管a中，旋涡混合仪上摇匀4min，1500rpm，4摄氏度，离心6min，将上清液倒入离心管b中，将装有上清液的离心管b，12000rpm，4摄氏度，离心6min，弃上清。
(9)样品处理3：依次重复步骤7、步骤8、步骤7、步骤8。
(10)样品处理4：使用1ml冻存液，吸取离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中。
(11)样品处理5：将收集到的200g粪便样品按照步骤7，步骤8，步骤9和步骤10，分别进行处理。共获得含有粪便微生物的冻存管120管。
(12)样品冻存：将样品置入液氮10秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，零下190摄氏度-零下210摄氏度冻存。
分别使用背景技术所述的现有方法和本发明实施例2的方法进行处理和冻存，30天后，将样品从液氮冻存容器中取出，使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养24h后，检测菌群成分，结果如表2。使用现有方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例约在10％-70％，而使用实施例2中方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例大多被控制在30％以内。采用实施例2方法冻存的粪便中，微生物菌群组成得到更好的保持。
表2
Figure BDA0002492303340000111
实施例3
粪便提供者：年龄45岁，男性，健康无已知疾病。
(1)样品采集：在粪便样品提供者排出粪便后0-3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100g；粪便选取上层，最后排出的样品为佳。
(2)样品封存：使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
(3)样品运输：将样品置于恒温箱中，温度设置为36-38摄氏度；运输时间限制在0-12小时内。
(4)样品质检：对样品进行质量检测，检测项目包括含水量(65％-85％)，密度(1.1-1.3g/cm3)。检测结果为：含水量在65％-85％之间，密度在1.1-1.3g/cm3范围内，符合要求。
(5)辅助溶液的配制：
冻存液：称取甜菜碱(betaine)60g，溶于1000g双蒸水中，待溶解后，称取氯化钠(NaCl)9g，加入溶解，121摄氏度，100-110千帕斯卡，灭菌20分钟。
分离液：称取氯化钠(NaCl)8g，溶于1000g双蒸水，121摄氏度，110-120千帕斯卡，灭菌23分钟。
(6)样品稀释：在50ml无菌离心管a中，加入1.2g粪便样品，加入40ml分离液，旋涡混合仪上剧烈摇匀2-3min。
(7)样品处理1：使用1300rpm，4摄氏度，离心离心管a，5min；轻轻将离心管a取出(不要剧烈晃动)，将上清液倒入离心管b，11200rpm，4摄氏度，离心5min，抛弃上清液。
(8)样品处理2：量取40ml分离液，加入离心管a中，旋涡混合仪上摇匀3-4min，1300rpm，4摄氏度，离心5min，将上清液倒入离心管b中，将装有上清液的离心管b，11200rpm，4摄氏度，离心5min，弃上清。
(9)样品处理3：依次重复步骤7、步骤8、步骤7、步骤8。
(10)样品处理4：使用1ml冻存液，吸取离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中。
(11)样品处理5：将收集到的100g粪便样品按照步骤7，步骤8，步骤9和步骤10，分别进行处理。共获得含有粪便微生物的冻存管50管。
(12)样品冻存：将样品置入液氮10秒，进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，零下190摄氏度-零下210摄氏度冻存。
分别使用背景技术所述的现有方法和本发明实施例3的方法进行处理和冻存，30天后，将样品从液氮冻存容器中取出，使用标准解冻复苏方法，进行标准无菌培养24h后，检测菌群成分，结果如表3。使用现有方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例约在20％-250％，而使用实施例3中方法冻存的粪便样品，微生物菌群组成变化比例被控制在30％以内。采用实施例3方法冻存的粪便中，微生物菌群组成得到更好的保持。
表3
Figure BDA0002492303340000131
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种人类粪便肠道菌群样本的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在50ml无菌离心管a中，加入0.8～1.6g的人类粪便样品，之后加入40ml的分离液，在旋涡混合仪上剧烈摇匀2～3min；其中所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟；
(2)将所述无菌离心管a在1000-1500rpm、4℃下，离心4～6min，之后将无菌离心管a取出，将上清液倒入离心管b中，在10000-12000rpm、4℃下，将所述离心管b离心4～6min，之后抛弃上清液；
(3)量取40ml所述分离液，加入所述无菌离心管a中，在旋涡混合仪上摇匀3～4min，之后所述无菌离心管a于1000-1500rpm、4℃下，再离心处理4～6min，之后取出，将所述无菌离心管a中的上清液倒入所述离心管b中，之后再将所述离心管b于10000-12000rpm、4℃下，离心处理4～6min，之后抛弃上清液；
(4)依次重复步骤(2)、步骤(3)、步骤(2)、步骤(3)；
(5)吸取所述离心管b底部由于离心而沉淀的菌体，转移至无菌冻存管中，并向所述无菌冻存管中添加1ml的冻存液，得到人类粪便肠道菌群样本；其中所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟；
将得到的人类粪便肠道菌群样本置入液氮8～10秒进行急速冷冻，之后放入液氮冻存罐中，于-190℃～-210℃条件下冻存。
2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述人类粪便样品的含水量为65％～85％，密度为1.1～1.3g/cm3。
3.根据权利要求1～2任意一项所述的处理方法，其特征在于，所述人类粪便样品通过样品采集、样品封存、样品运输获得，其中所述样品采集是在粪便样品提供者排出粪便后0～3分钟内，使用药匙获取新鲜粪便样品100-200g。
4.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述样品封存是使用无菌密封袋装盛粪便样品，尽可能排空袋内空气后密封。
5.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述样品运输是将封存好的样品置于恒温箱中，在36～38℃下运输，运输时间控制在0～36小时内。
6.一种人类粪便肠道菌群样本的处理试剂，其特征在于，所述处理试剂包括分离液和冻存液，所述分离液的配制方法为：称取氯化钠8～9g，溶于950～1050g双蒸水中，于121℃、110～120KPa下灭菌20～25分钟获得；所述冻存液的配制方法为：称取甜菜碱55～65g，溶于950～1050g双蒸水中，待溶解后，再加入氯化钠8～9g溶解，之后于121℃、100～110KPa下灭菌20～25分钟获得。
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