CN113234676B - 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 - Google Patents
一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113234676B CN113234676B CN202110395246.3A CN202110395246A CN113234676B CN 113234676 B CN113234676 B CN 113234676B CN 202110395246 A CN202110395246 A CN 202110395246A CN 113234676 B CN113234676 B CN 113234676B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- duck
- h5n1hpaiv
- pbmc
- cells
- memory
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 title claims abstract description 65
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 74
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 19
- 241000272522 Anas Species 0.000 claims 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 48
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 13
- 241001473385 H5N1 subtype Species 0.000 abstract description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 15
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 12
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 11
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 8
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KQNZDYYTLMIZCT-KFKPYADVSA-N (2e,7s,10e,12r,13r,15s)-12,15-dihydroxy-7-methyl-8-oxabicyclo[11.3.0]hexadeca-2,10-dien-9-one Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\C2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KFKPYADVSA-N 0.000 description 1
- BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 1,1-bis(sulfanyl)ethanol Chemical compound CC(O)(S)S BQRXMLXVGQMIBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004492 positive regulation of T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
Abstract
本发明公开了一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用，其中促进鸭T细胞增殖的方法包含以下步骤：H5N1HPAIV体内接种鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；将H5N1HPAIV体外感染鸭记忆性PBMC与未感染的记忆性PBMC混合培养。本发明利用H5N1HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。建立了一种促进鸭T细胞增殖的制备方法，为研究鸭T细胞对H5N1HPAIV免疫应答机制提供材料。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用。
背景技术
甲型流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，病毒的核酸结构为分节段的单股负链RNA，主要通过呼吸道和粪口途径传播，在流感爆发期，H5N1亚型高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)可通过水禽接触到人或者其他的哺乳动物(Tian et al.,2015)，H5N1 HPAIV自从1997年被首次发现以来，人感染后死亡的病例已高达50％以上，在跨种传播的同时给养殖业带来严重的经济损失，对人和动物的健康造成极大的威胁(Evseev et al.,2019；EntersFor Disease C,1997)。目前对H5N1 HPAIV研究主要集中于天然免疫，而在适应性免疫方面研究较少，研究鸭记忆性T细胞功能对流感疫苗评估和新型药物的制备必不可少。目前T细胞研究主要集中于哺乳动物，而没有报道鸭T细胞增殖方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种鸭T细胞的制备方法。
一种鸭T细胞的制备方法，包含以下步骤：
S1：H5N1 HPAIV接种麻鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；
S2：H5N1 HPAIV体外感染步骤S1中的鸭记忆性PBMC，与未感染的记忆性PBMC混合培养。
其中感染鸭记忆性PBMC作为APC(抗原递呈细胞)递呈病毒抗原多肽，未感染的记忆性PBMC作为受体细胞接受刺激产生应答。
在本发明的一些实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV体内接种麻鸭后25～30天由外周血分离得到。
在本发明的一些优选实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV感染麻鸭后28天由外周血分离得到。
在本发明的一些实施方式中，所述H5N1 HPAIV接种麻鸭具体为采用点眼滴鼻的方法，每只鸭接种106EID50/200μL。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中以MOI＝2～5感染细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中以MOI＝5感染细胞。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中于感染6～12h后收集细胞。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中于感染6h后收集细胞。
本发明还提供一种鸭T细胞，由上述方法制备。
本发明还提供上述鸭T细胞在制备疫苗或药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明建立了一种鸭T细胞的制备方法，利用H5N1 HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC(外周血单个核细胞)，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，确立了最佳接种时间点与最佳MOI，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。为研究鸭T细胞对H5N1 HPAIV免疫应答机制提供材料。
附图说明
图1为H5N1 HPAIV感染后不同时间细胞活率。
图2为流式分析圈门NP-FITC。
图3为流式细胞仪分析H5N1 HPAIV感染不同时间NP阳性率。
图4为感染后不同时间NP阳性率。
图5为H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC后细胞活率。
图6为流式分析圈门NP FITC-A。
图7为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV以不同MOI感染PBMC后NP阳性率。
图8为H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC NP阳性率。
图9为NP基因PCR扩增结果。
图10为NP基因测序后比对结果。
图11为流式检测H5N1 HPAIV刺激CFSE标记鸭记忆性PBMC增殖实验。其中DuckCFSE PBMC：CFSE标记后的样本；7D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞7天的样本；8D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞8天的样本；14D H5N1 CFSE PBMC：H5N1接种CFSE标记T细胞14天的样本。
图12为流式检测ConA刺激CFSE标记鸭记忆性PBMC增殖实验。其中Duck CFSEPBMC：CFSE标记后的样本；3D ConA CFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞3天的样本；4D ConACFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞4天的样本；5D ConA CFSE PBMC：ConA CFSE标记T细胞5天的样本。
图13为H5N1 HPAIV刺激记忆性PBMC后增殖T细胞的细胞形态。
图14为用ConA作为阳性对照刺激T细胞增殖后T细胞的细胞形态。
图15为鸭T细胞增殖数量变化。
图16为流式分析圈门CD4。
图17为流式分析圈门CD8α。
图18为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞比例变化。
图19为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD8α+T细胞比例变化。
图20为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后T细胞比例变化。
图21为H5N1 HPAIV刺激后T细胞绝对数量变化。
图22为qPCR检测增殖鸭T细胞细胞因子变化情况。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本试验所用的鸭记忆性PBMC是由接种H5N1 HPAIV 4W(4周龄)后的鸭外周血分离得到；其中采用点眼滴鼻的方法，每只鸭接种106EID50/200μL。H5N1 HPAIV是A/Duck/Guangdong/383/2008(H5N1)。
RPMI-1640培养基、FBS澳洲胎牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、L-谷氨酰胺(100X)、二巯基乙醇(1000X)、HEPES(100X)购自美国GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)、皂苷(saponin)、布雷菲德菌素A(BFA)、刀豆素蛋白(ConA)购自美国Sigma公司。
试验中的流式抗体Anti-chicken NP antibody、Anti-Duck CD8 antibody和CFSE-labeling kit购自abcam公司，Anti-Duck CD4 antibody购自SouthernBiotech公司，Goat Anti-Mouse IgG-FITC购自abbkine生物公司。
实施例1 H5N1 HPAIV体外感染麻鸭PBMC模型建立
1)H5N1 HPAIV感染麻鸭PBMC最佳时间点筛选
从液氮中选取三只不同编号麻鸭记忆性PBMC，放入37℃恒温水浴锅中快速复苏麻鸭PBMC，用0.08％台盼蓝计数，每个样品分别取106个细胞至15mL反应管中，400g离心5min，用RPMI-1640培养基重悬细胞。将H5N1 HPAIV从-80℃冰箱中取出，放置于4℃冰箱中融化，以MOI＝5接种细胞，实验时设置未接毒的阴性对照组，放置于37℃接毒细胞培养箱中培养，每隔15min取出轻轻震荡，避免细胞沉淀。1h后用PBS清洗两遍，加入2mL含10％FBS的RPMI-1640培养基，放置于37℃接毒细胞培养箱中继续孵育。分别于接毒后6h、12h、24h和36h收集细胞，用0.08％台盼蓝统计细胞数量和活率，并且进行NP染色。
细胞计数结果见图1，从图1可以看出，从12h开始，相比对照组，感染组细胞活率降低，差异极显著(P＜0.01)。而6h时的感染组和对照组细胞活率没有差异，从细胞活率角度考虑，在确保实验结果可行的情况下，6h时的细胞状态是适合后续实验的。
流式细胞仪检测结果见图2和图3，其中图2为流式分析圈门NP-FITC。图3为流式细胞仪分析H5N1 HPAIV感染不同时间NP效率。可以看出，H5N1 HPAIV感染6h后NP阳性率达30.7％，12h后阳性率为25.1％，24h后NP阳性率46.6％，感染后NP阳性率最高的时间点是24h。统计学分析结果见图4，从图4可以看出，6h和12h的NP阳性率差异不显著(P＞0.05)，6h和24h的NP阳性率差异显著(P＜0.05)，结合感染后细胞活率分析，H5N1 HPAIV感染鸭PBMC的最佳时间是6h。
2)H5N1 HPAIV体外感染麻鸭PBMC最佳MOI筛选
复苏麻鸭PBMC后，用0.08％台盼蓝计数，H5N1 HPAIV分别以MOI＝2、5和10感染106个细胞，细胞放置于37℃接毒细胞培养箱中孵育1h。向反应管中加入2mL PBS，400g离心5min，清洗细胞两遍，弃掉PBS，加入2mL含10％FBS的RPMI-1640培养基，放置于37℃接毒细胞培养箱中孵育。于接毒后6h收集细胞，用0.08％台盼蓝统计细胞数量和活率，然后进行NP蛋白流式检测。
其中，细胞计数结果见图5，从图5可以看出，MOI＝2与MOI＝5相比，细胞活率差异不显著(P＞0.05)，MOI＝2或MOI＝5感染后的细胞活率要高于MOI＝10和MOI＝20感染后的细胞活率，差异显著(P＜0.05)。从细胞活率角度考虑，病毒接种最佳MOI＝2或5。但后续需要结合细胞感染效率综合考虑，选取感染后阳性率高且细胞活率较高的接毒剂量。
流式实验结果如图6和7所示，其中图6为流式分析圈门NP FITC-A。图7为流式细胞仪检测H5N1 HPAIV以不同MOI感染PBMC后NP阳性率。可以看出，同未接毒的阴对照相比，接毒实验组的NP阳性率分别为76.4％、82.5％、83.1％和89.6％。统计学分析显示见图8，可以看出不同MOI之间NP阳性率无统计学差异。因此，H5N1 HPAIV接种麻鸭PBMC最佳MOI＝2或5，病毒接种NP阳性率最高，细胞活率满足实验需要。
3)PCR检测H5N1 HPAIV以不同MOI接种麻鸭PBMC后NP基因
实验中选取106个PBMC，以MOI＝2、5、10和20分别接种H5N1 HPAIV，感染后6h收集细胞，取105个PBMC提取RNA，反转录后用NP基因引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果见图9，其中条带1-3为H5N1 HPAIV感染组样品，条带4为未感染病毒的阴对照样品，条带5为PCR中以水为模板的阴对照，条带6为PCR中的阳对照。图9显示，条带大小约1500bp，与目的基因大小一致。紫外灯下切胶进行胶回收，送至生工生物工程公司进行测序，鉴定目的基因。图10为NP基因测序后比对结果。
实施例2 H5N1 HPAIV刺激鸭PBMC中T细胞增殖
1)CFSE检测H5N1 HPAIV刺激后外周血淋巴细胞增殖
选取三只不同编号麻鸭的记忆性PBMC，复苏细胞，用台盼蓝计数，吸取107细胞至15mL离心管中。400g离心后用37℃预热过的PBS重悬细胞，同时用预热PBS稀释CFSE，5mLPBS中加入1μL CFSE原液，充分震荡混匀。用移液枪快速将稀释后的CFSE溶液移至细胞悬液中，吹打混匀。37℃水浴10min，400g离心5min，弃掉上清，用PBS清洗两遍，台盼蓝计算细胞数量，用T细胞培养基重悬细胞沉淀，使其浓度为107个/mL，取5х106个细胞，用H5N1 HPAIV以MOI＝2接种细胞。剩余的标记后细胞悬液放置于48孔细胞板中培养中，每孔2х106个细胞，补加含20U/mL IL-2的T细胞培养基至1mL。每天观察细胞，关注细胞集落的形成以及培养基颜色的变化。
CFSE标记鸭PBMC，取106以MOI＝5接种H5N1 HPAIV 6h，与5х106个标记后的未接种病毒的记忆性PBMC共培养，每天观察细胞形态和培养基颜色。共培养6d细胞成聚落生长，培养基颜色呈浅黄色。培养至第七天对细胞进行分板培养，继续观察细胞形态，每隔两天对细胞进行半换液处理。
流式结果如图11-12所示，其中图11为流式检测H5N1 HPAIV刺激CFSE标记鸭PBMC增殖实验。图12为流式检测ConA刺激CFSE标记鸭PBMC增殖实验。从图11可以看出，与初始标记细胞相比，培养从第七天开始细胞有明显的增殖峰；从图12可以看出，用ConA作为实验阳对照，与初始标记细胞相比，从培养第三天开始，细胞有明显的增殖峰。
2)H5N1 HPAIV刺激鸭T细胞增殖形态变化
H5N1 HPAIV刺激鸭记忆性PBMC增殖培养后不同时间，显微镜观察，结果见图13，可以看出与对照组未用病毒刺激的细胞相比，H5N1 HPAIV刺激组细胞培养基呈浅黄色，细胞变大变圆，且出现聚集现象；用ConA作为阳性对照刺激T细胞增殖，在培养第四天开始，细胞呈团状聚集生长，结果见图14，而对照组的细胞呈现单个散落生长，且随着培养时间的增加，死亡细胞数量增多。
3)H5N1 HPAIV刺激鸭T细胞增殖数量变化
H5N1 HPAIV刺激鸭记忆性PBMC增殖培养后不同时间后，显微镜观察细胞形态有明显变化时，取10μL混匀的细胞悬液，与0.08％的台盼蓝溶液混匀进行计数，统计H5N1 HPAIV刺激后在细胞绝对数量上的变化。统计结果见图15，结果显示，相比对照组，H5N1 HPAIV刺激组细胞在绝对数量上呈增长的趋势。
4)流式细胞仪检测T细胞比例变化
T细胞培养7d后，细胞计数取106个细胞用Anti-Duck CD8 antibody和Anti-DuckCD4 antibody进行流式染色，流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8α+T细胞变化情况。
实验中选取2х106个PBMC，以MOI＝5接种H5N1 HPAIV，39℃、5％CO2培养4h后与107个PBMC共培养，培养至14d后，取实验组和对照组细胞进行鸭CD4+T和CD8 α+T细胞染色，其中流式分析圈门CD4见图16，流式分析圈门CD8α见图17，其中流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞比例变化见图18，流式细胞仪检测H5N1 HPAIV刺激后CD8α+T细胞比例变化见图19。并将结果进行统计学分析，结果见图20和图21，其中图20为H5N1 HPAIV刺激后T细胞比例变化。图21为H5N1 HPAIV刺激后T细胞绝对数量变化。从图20可以看出，与对照组相比，H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞和CD8α+T细胞比例呈现增加的趋势，且差异显著(P＜0.05)；从图21可以看出，H5N1 HPAIV刺激后CD4+T细胞和CD8α+T细胞的绝对数量相比对照组增加。
5)qPCR检测增殖T细胞内细胞因子表达
(1)细胞RNA的提取
按照Magen公司微量细胞RNA提取试剂盒说明书提取RNA。取含有106个细胞的悬液，400g离心5min后弃掉上清，轻轻涡旋震荡使细胞团块松散开来。加入350μL Bufffer RL裂解细胞，将裂解液吸取至装有2mL收集管的DNA过滤柱，1000g常温离心1min，留下过滤液，加入等体积的70％乙醇，用移液枪轻轻吹打5次混匀，将混合液转移至装有2mL收集管的RNA过滤柱，1000g常温离心1min，弃掉滤液，将过滤柱放回收集管上，加入600μL Bufffer RW1，10000g常温离心1min，弃掉滤液，加入600μL Bufffer RW2，10000g常温离心1min，重复上一步骤，12000rpm常温离心3min，将过滤柱放置于灭菌的1.5mL离心管中，向过滤柱中心加入15μL DEPC水处理的灭菌水，12000r常温离心1min，用分光光度计测定浓度，将提取的RNA放置于-80℃保存。
(2)反转录
按照表1在冰上配制反应体系：
表1反转录体系
| 试剂 | 用量 |
| 5×M-MLV-Mix | 4μL |
| RNA | 6μL |
| 灭菌水 | 10μL |
| 总计 | 20μL |
瞬离混合均匀，在PCR仪器中按照如下程序反应：37℃保温15min，85℃灭活5s，4℃保存。
(3)荧光定量PCR引物设计
利用Oligo引物设计软件设计合成荧光定量引物，如表2所示。
表2麻鸭基因荧光定量引物
(4)荧光定量PCR
用分光光度计测定RNA浓度，按照TaKaRa反转录试剂说明书(Cat：RR036A)对提取的RNA进行反转录。按照表2中的荧光定量引物，以GAPDH为内参，对结果进行统计和分析。具体反应体系如下表3所示：
表3荧光定量反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 2*SYBR qPCR Master | 10μL |
| FP | 0.5μL |
| RP | 0.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 7μL |
| cDNA | 10ng |
| 总计 | 20μL |
细胞毒性相关基因GranzymeA，IL-2，Granzyme K，TNF，IFN-r，Th2细胞因子IL-10以及干扰素基因IFN－α和IFN－β的表达变化见图22，可看出细胞毒性相关基因GranzymeA，IL-2，Granzyme K，TNF，IFN-r的表达显著性上调，Th2细胞因子IL-10以及干扰素基因IFN－α和IFN－β也显著上调，结合上述结果中CD4+T细胞和CD8α+T细胞比例和数量增加，说明H5N1HPAIV刺激引起了显著的T细胞免疫应答。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用
<130>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttcgtga tgggtgtgaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgtcttcgt gtgtggctgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acctgcctac ctcaggtgat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccccgacatg agtccctttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccagccagct gttagctctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgctgtca aaacccactg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctgatggca atcctgtttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggattttcaa gccagtcagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atcagctggc taagaccgtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggattgtac aaggcagcca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gccaagagct gaccaacttc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atcgcccaca ctaagagcat 20
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaaggaagag acttcattgc cttgg 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctctcctctc cagtacgtcc ttcc 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggggagagga aactgagaga tg 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcactggagg gtaaaatgca ga 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cctcaaccag atccagcatt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggatgaggct gtgagaggag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccacctttac cagcttcgag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccgttcttca tccaggtgat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcccagcttc acagaactgc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tacttgacga ggcgcaggag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcctctcca cgcaggtttc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggtgctctt tgtcacgatg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
actgcttgag ggtggaaatg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgcagccatc ttgagtaggc 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cccccaatct tccttatttc c 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ttcctgtcct ttccaactgc 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tcacacgaag gcctatttta ctgg 24
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gtcgccgaag tcatgaagga 20
Claims (4)
1.一种用于非治疗目的的体外促进鸭T细胞增殖的方法，包含以下步骤：
S1：鸭源H5N1 HPAIV接种鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；
S2：鸭源H5N1HPAIV体外感染步骤S1中鸭记忆性PBMC，与未感染的记忆性PBMC混合培养；
所述鸭为麻鸭；
所述鸭为4周龄以上；
所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV接种鸭大于25天由外周血分离得到；
步骤S2中鸭源H5N1 HPAIV以MOI=2～5感染细胞；
步骤S2中于感染6～12h后收集细胞；
步骤S2中鸭源H5N1 HPAIV 体外感染的鸭记忆性PBMC 与未感染的记忆性PBMC的细胞比例为106：5× 106。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中以MOI=5感染细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中于感染6h后收集细胞。
4.鸭源H5N1 HPAIV在非治疗目的的体外促进麻鸭T细胞增殖中的应用，通过H5N1HPAIV接种麻鸭后分离外周血得到鸭记忆性PBMC，将H5N1 HPAIV体外感染鸭记忆性PBMC与未感染的记忆性PBMC混合培养；
所述鸭为4周龄以上；
所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV接种鸭大于25天由外周血分离得到；
步骤S2中鸭源H5N1 HPAIV以MOI=2～5感染细胞；
步骤S2中于感染6～12h后收集细胞；
步骤S2中鸭源H5N1 HPAIV 体外感染的鸭记忆性PBMC 与未感染的记忆性PBMC的细胞比例为106：5× 106。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110395246.3A CN113234676B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 |
| NL2031234A NL2031234B1 (en) | 2021-04-13 | 2022-03-10 | Method for Promoting Duck T Cell Proliferation and Application Thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110395246.3A CN113234676B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113234676A CN113234676A (zh) | 2021-08-10 |
| CN113234676B true CN113234676B (zh) | 2022-12-13 |
Family
ID=77128064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110395246.3A Active CN113234676B (zh) | 2021-04-13 | 2021-04-13 | 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113234676B (zh) |
| NL (1) | NL2031234B1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116731965B (zh) * | 2023-05-30 | 2024-02-20 | 华南农业大学 | 一种免疫应答模型的建立方法、细胞应答测试方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB202011652D0 (en) * | 2020-07-28 | 2020-09-09 | Univ Oxford Innovation Ltd | Polypeptide panels and uses thereof |
| WO2022157288A1 (en) * | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Cytovac A/S | Method for t-cell expansion and related medical applications |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2848614A1 (en) * | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Sovicell Gmbh | An in-vitro process for the quick determination of the infection status of an infection with an influenza virus type |
| CN103333224B (zh) * | 2013-05-10 | 2015-03-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒ns1蛋白b细胞抗原表位多肽及其应用 |
| JP6890831B2 (ja) * | 2015-07-08 | 2021-06-18 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法 |
| CN107365748A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-11-21 | 路春光 | 外周血单个核细胞诱导的记忆性免疫细胞及应用 |
| CN110747166B (zh) * | 2019-10-11 | 2021-07-09 | 厦门大学 | 一种外周血t细胞的体外扩增培养方法 |
-
2021
- 2021-04-13 CN CN202110395246.3A patent/CN113234676B/zh active Active
-
2022
- 2022-03-10 NL NL2031234A patent/NL2031234B1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB202011652D0 (en) * | 2020-07-28 | 2020-09-09 | Univ Oxford Innovation Ltd | Polypeptide panels and uses thereof |
| WO2022157288A1 (en) * | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Cytovac A/S | Method for t-cell expansion and related medical applications |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL2031234A (en) | 2022-10-24 |
| CN113234676A (zh) | 2021-08-10 |
| NL2031234B1 (en) | 2022-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111330002B (zh) | 靶向冠状病毒的通用dc细胞疫苗及其制备方法和应用 | |
| Sugden et al. | Clonal transformation of adult human leukocytes by Epstein-Barr virus | |
| US9598671B2 (en) | Cyprinid herpesvirus II-sensitive brain tissue cell line of Carassius auratus gibelio and establishing method and use thereof | |
| Hussey et al. | Innate immune responses of airway epithelial cells to infection with equine herpesvirus-1 | |
| CN111450244B (zh) | 一种防治冠状病毒感染的细胞组合及其应用 | |
| US20230065434A1 (en) | Preparation method of trophoblasts with limited generations, culture method of snk cells and method for treating tumor | |
| CN113234676B (zh) | 一种促进鸭t细胞增殖的方法及其应用 | |
| CN112410290A (zh) | 一种大口黑鲈心肌成纤维细胞系及应用 | |
| Dai et al. | Comparative analysis of key immune protection factors in H9N2 avian influenza viruses infected and immunized specific pathogen–free chicken | |
| CN116731965B (zh) | 一种免疫应答模型的建立方法、细胞应答测试方法 | |
| CN114835778A (zh) | 一种h9n2亚型aiv mhc b2限制性表位肽及其应用 | |
| CN115975924A (zh) | Ctl细胞的制备方法和应用 | |
| EP3936611A1 (en) | Composition, culture medium and method for inducing and/or amplifying tscm in vitro | |
| Nišavić et al. | Molecular detection of bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) in cattle in Serbia | |
| CN115094034A (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
| CN110951694B (zh) | 一种自体滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法 | |
| CN111154721A (zh) | Nk细胞扩增方法 | |
| CN108210497B (zh) | 化合物mln4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用 | |
| CN116948966A (zh) | 单倍型spf鸡细胞免疫应答模型的建立方法、细胞应答测试方法 | |
| CN109735566B (zh) | 一种增强腺病毒载体生物制品感染靶细胞的方法 | |
| CN105219710B (zh) | 一种高杀伤活性的免疫细胞群的培养方法 | |
| CN115947869B (zh) | 一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、car-nk细胞及用途 | |
| Sandbulte et al. | T cells from a high proportion of apparently naive cattle can be activated by modified vaccinia virus Ankara (MVA) | |
| CN108210880B (zh) | 化合物ps-341在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用 | |
| CN116731953A (zh) | 弹状病毒阴性草地贪夜蛾昆虫细胞株及其筛选、鉴定和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240603 Address after: No. 483, Wushan, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510610 Patentee after: SOUTH CHINA AGRICULTURAL University Country or region after: China Patentee after: GUANGZHOU SOUTH CHINA BIOLOGICAL MEDICINE Co.,Ltd. Address before: No. 483, Wushan, Tianhe District, Guangzhou, Guangdong 510630 Patentee before: SOUTH CHINA AGRICULTURAL University Country or region before: China Patentee before: INSTITUTE OF ANIMAL HEALTH, GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |