CN109735566B - 一种增强腺病毒载体生物制品感染靶细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强腺病毒载体生物制品感染细胞的方法，在使用腺病毒感染人或猕猴PBMC的过程中加入GM‑CSF，IL4等细胞因子，能够显著促进腺病毒的感染。相对于现有的离心等方法而言，本发明安全可行，操作更简便。普遍应用于；可用于腺病毒载体的细胞免疫疗法，日后致力用于肿瘤和传染性疾病的研究。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一种增强腺病毒载体生物制品感染靶细胞的方法。
背景技术
腺病毒是目前应用最为广泛的疫苗载体，据报道临床应用的基因治疗载体21.2％为腺病毒载体。其中C家族腺病毒包括Ad2和Ad5，具有较好的安全性、宿主细胞广泛、容纳外源基因能力强、便于生产和储存等许多优点，且腺病毒基因组不被整合染色体中，不会导致宿主基因的插入突变，因此它被广泛地应用于体外基因转导，体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。Ad5载体的P53和溶瘤Ad5腺病毒被批准用于癌症的临床治疗，Ad5载体的埃博拉疫苗也已在临床试验中被测试。
DC(树突状细胞)是一种抗原呈递细胞，能够吞噬抗原将将其裂解成小分子多肽再呈递给T细胞，因此在起始和调控适应性免疫应答中发挥重要作用。因此将腺病毒载体疫苗靶向于DC细胞能够明显增强疫苗的免疫效果。一般来说，这种细胞免疫疗法的程序是先用腺病毒载体产品体外感染自体DC或者PBMC(外周血单个核细胞)细胞，然后将感染的细胞回输到体内用于治疗肿瘤和一些感染性疾病。另一方面，这种方法也因将腺病毒“藏匿”在细胞中，从而躲过了机体预存的抗腺病毒免疫反应的识别，从而避免了腺病毒预存免疫反应对腺病毒载体重复免疫的不利影响。
其中柯萨奇病毒—腺病毒受体(CAR)和整合素受体在腺病毒进入宿主细胞的过程中发挥关键作用。然而研究发现人类DC和PBMC(外周血单个核细胞)表面中CAR和整合素受体的表达水平很低，因此腺病毒很难将基因递送到细胞中。为了增强腺病毒进入靶细胞的效率，很多研究采用离心的的方式来促进腺病毒进入细胞。离心能够有效地促近腺病毒进入细胞，但同时它也很容易影响细胞的活性，且程序繁琐，对实验室条件有较高要求，因此难以在临床中广泛应用。因此寻找一种更加简便、有效地促进腺病毒进入DC细胞的方法，具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种增强腺病毒载体生物制品感染靶细胞的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进腺病毒感染PBMC和/或DC细胞的方法，加入细胞因子与PBMC和/或DC细胞共同孵育。
进一步的，所述的细胞因子为GM-CSF或IL4。
进一步的，所述的GM-CSF孵育剂量为20～40ng/ml。
进一步的，所述的IL4孵育剂量为10～20ng/ml。
进一步的，所述的腺病毒为Ad2或Ad5。
细胞因子在制备促进腺病毒感染PBMC和/或DC细胞的试剂中的应用。
进一步的，所述的细胞因子为GM-CSF或IL4。
进一步的，所述的腺病毒为Ad2或Ad5。
GM-CSF和/或IL4在制备促进细胞表面整合素受体和SR-A受体的试剂中的应用。
进一步的，所述的整合素受体为avβ5受体。
本发明的有益效果是：
在腺病毒体外感染PBMC/DC细胞的过程中加入GM-CSF,IL4细胞因子，细胞表面整合素和SR-A受体上调表达，Ad2/Ad5感染靶细胞的效率明显增强。本发明安全可行操作快速简便，可用于腺病毒载体疫苗的DC细胞疗法，在临床上得到更为广泛的应用。
附图说明
图1是Ad+和Ad-志愿者的CD14+单核细胞对腺病毒感染效率的比较；图1A是Ad2-EGFP或Ad5-EGFP感染细胞后，各群细胞(7AAD-活细胞，CD14+单核细胞，EGFP+被腺病毒感染的细胞)感染效率的设定阳性细胞阈值的策略图；图1B是Ad5+和Ad5-志愿者的CD14+细胞感染Ad5-EGFP的百分比；图1C是Ad5+和Ad5-志愿者的CD14+细胞感染Ad5-EGFP的平均荧光强度；图1D是Ad2+和Ad2-志愿者的CD14+细胞感染Ad2-EGFP的百分比；图1E是Ad2+和Ad2-志愿者的CD14+细胞感染Ad2-EGFP的平均荧光强度；图1F是Ad5+和Ad5-志愿者的CD14+细胞感染不同剂量的Ad5-SEAP的相对光强度；图1G是Ad2+和Ad2-志愿者的的CD14+细胞感染不同剂量的Ad2-SEAP的相对光强度。
图2是Ad+志愿者的PBMC和Ad-志愿者的PBMC以不同比例(#1：全部是Ad5-,#2：Ad5-/Ad5+＝3:1，#3:Ad5-/Ad5+＝1:1,#4:Ad5-/Ad5+＝1:3,#5:全部是Ad5+)混合后感染Ad5-EGFP的实际感染效率(Actual Values)和预测感染(Calculated Values)效率比较；图2A是Ad5+者的PBMC和Ad5-者的PBMC的不同混合比例；图2B是不同比例的混合细胞感染Ad5-EGFP的感染百分比。图2C是不同比例的混合细胞感染Ad5-EGFP的平均荧光强度。
图3是Ad5+和Ad5-志愿者的PBMC在删除CD3+细胞或者CD19+细胞，以及添加CD3+细胞，CD19+细胞后，Ad5-EGFP对CD14+细胞的感染效率变化；图3A是不同细胞群的阳性阈值设定以及检测纯化效率策略图；图3B是Ad5+志愿者的PBMC按照不同方式处理后CD14+细胞感染Ad5-EGFP的百分比；图3B～图3E的横坐标(处理方式)为：新鲜的PBMC,CD3-删除的PBMC(CD3-(Ad5+)),CD19-删除的PBMC(CD19-(Ad5+)),CD3-/CD19双删除的PBMC(CD3-CD19-),CD3-CD19双删除但添加了Ad5+志愿者的CD3+T细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD3(Ad5+)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5-志愿者的CD3+T细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD3(Ad5-)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5+志愿者的CD19+B细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD19(Ad5+)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5-志愿者的CD19+B细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD19(Ad5-))；图3C是Ad5-志愿者的PBMC按照上述不同方式处理后CD14+细胞感染Ad5-EGFP的百分比；图3D是Ad5+者的PBMC按照上述不同方式处理后CD14+细胞感染Ad5-EGFP的平均荧光强度；图3E是Ad5-者的PBMC按照上述不同方式处理后CD14+细胞感染Ad5-EGFP的平均荧光强度。
图4是Ad2+志愿者的PBMC和Ad2-志愿者的PBMC再次感染Ad2病毒时，T细胞的活化和分泌细胞因子比较。图4A是Ad+和Ad-志愿者的PBMC用Ad裂解物刺激时T细胞免疫应答强度比较；图4B是是Ad+和Ad-志愿者的PBMC感染Ad后，细胞增殖能力比较；图4C,4D 4E,4F是Ad+和Ad-志愿者的PBMC感染Ad后，细胞活化能力比较；图4G,4H,4I是Ad+和Ad-志愿者的PBMC感染Ad后，细胞因子IFN-γ,GM-CSF,IL4分泌能力比较。
图5是在Ad2-EGFP或Ad2-SEAP病毒感染细胞时加入GM-CSF或IL4共同孵育，检测其对病毒感染效率的影响和对靶细胞表面受体表达的影响。图5A是细胞因子处理PBMC后，CD14+细胞中EGFP+细胞百分比的变化。图5B是细胞因子处理PBMC后，CD14+细胞中EGFP+平均荧光强度的变化。图5C是细胞因子处理PBMC后,相对光强度RLU的变化。图5D是细胞因子处理PBMC后，细胞表面SR-A受体基因表达的变化。图5E是细胞因子处理PBMC后，细胞表面αvβ5受体基因表达的变化。图5F是细胞因子处理PBMC后，表达αvβ7受体的CD14+细胞百分比的变化(图中IFN-gamma也名IFN-γ)。
具体实施方式
实施例1：Ad+志愿者的CD14+细胞更容易被腺病毒感染
1.实验材料
1.1细胞
重组人腺病毒(复制缺陷型)Ad5-EGFP,Ad2-EGFP,Ad5-SEAP,Ad2-SEAP。
1.2试剂
CD14-PE抗体(品牌：BD Pharminge，货号:555398),死细胞染料7-AAD(品牌：BDPharminge，货号：559925),分泌性碱性磷酸酶报告基因检测试剂盒Phospha-Light kit(品牌：Applied Biosystems,加拿大，货号：T1015)。
2.实验方法
2.1人/猕猴PBMC的分离
1)15ml离心管加入1/2-1/3全血体积的淋巴细胞分离液(品牌：Axis Shield PocAs,挪威，货号：AS1114546)
2)将抗凝血混匀，用巴氏吸管缓缓贴壁加入到淋巴细胞分离液上层，加入RPMI1640培养基配平离心管。
3)水平离心机室温离心，1000g，离心30min。
4)用巴氏吸管或者1ml枪轻轻吸取中间白膜层，即为淋巴细胞，加入RPMI1640培养基至12ml，混匀。
5)400g,离心8-10min。
6)吸掉上清，重新加入10ml RPMI1640培养基重悬。
7)400g,离心8-10min。
8)吸掉上清，加入1ml R10培养基重悬。
2.2腺病毒中和抗体的检测
微量中和测定腺病毒中和抗体
(1)第一天下午铺96孔293细胞：3×104/100ul/孔
(2)第三天，即培养36h后，稀释血清和病毒，感染细胞。
第一步：稀释血清；
按照表1加入无酚红DMEM培养基。(注意：第一列加入的血清应为无血清的DMEM，后面几个梯度的则加含11％血清的DMEM)
表1稀释血清
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| B | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| C | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| D | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| E | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| F | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | 160 | 135 | 135 | 135 | 135 | ||
| G | ||||||||||||
| H |
第二步：待测血清的稀释：往第1列和第7列中加入20ul的待测血清，用排枪混匀三次后
取出45ul到第2列中，混匀，取出45ul到第3列，以此类推到第5列和11列弃去45ul。
第三步：阳性对照血清的稀释：在H12孔中加入40ul阳性血清，混匀后取出34ul到E7列中，再取出270ul到E8列，混匀，取270ul到E9列，以此类推到E11列，最后E11列中取出270ul弃去。
第四步：阴性血清的稀释：在E12列中320毫升的孔中加入阴性血清40ul，混匀后取出90ul弃去。
第五步：所有孔中的体积都为270ul。
第六步：稀释病毒，病毒稀释1000倍，浓度为4×107vp/ml,取135ul病毒液加到上述板的各个孔中，即1:1稀释，然后置培养箱里中和1小时。
第七步：感染，甩掉旧的培养基。按照顺序，用排枪吸取200ul的中和后混合液到细胞培养板上。要做复孔，不同样品之间要换枪头，培养箱里孵育24小时。
(3)第四天：检测
实验前先配好1:20CSPD试剂，室温平衡1h。Phospha-lightM system检测前至少在室温预热仪器1小时。
①取50ul培养上清，加入黑色细胞板内。
②加入Assay Buffer 50ul，混匀，静置5min。
③加入1:20CSPD 50ul/孔，混匀，避光30min。
④Turner Bio Systems Veritus TM读数
2.3病毒感染和检测
将分离的新鲜PBMC加入到24孔板中，每孔约500ul培养基，2×106细胞。按照1250vp/细胞的剂量加入Ad2-EGFP,Ad5-EGFP。培养箱中孵育24小时后，搜集细胞，用PBS洗两遍，加入CD14-PE抗体(BD),死细胞染料7-AAD(BD),室温孵育30min,用BD Fortessa流式细胞仪检测(BD)。或者将PBMC按照5x105细胞/孔接种到96孔板中，按照1000vp/细胞、2000vp/细胞,4000vp/细胞，8000vp/细胞，16000vp/细胞的剂量感染Ad5-SEAP和Ad2-SEAP。培养箱中孵育24小时后每孔取50ul上清加入Asssy buffer和CSPD底物混匀，用luminometer(MLX Microtiter,Dynex Technologies,Inc.)检测SEAP活性。
3.实验结果
为了比较预存腺病毒免疫应答对CD14+细胞感染腺病毒效率的影响，我们分别采集了Ad+和Ad-志愿者的全血，并按照标准的方法分离PBMC。然后使用1250vp/细胞的剂量感染Ad2-EGFP和Ad5-EGFP，感染24小时候用流式细胞仪检测。如图1(A-E)所示Ad+志愿者的CD14+单核/巨噬细胞平均感染效率接近80％，而Ad-志愿者的CD14+单核/巨噬细胞平均感染效率约为20％。Ad+志愿者的CD14+细胞更容易被感染，且Ad+志愿者的CD14+细胞的EGFP的蛋白表达水平即平均荧光强度，也远远高于Ad-志愿者的细胞。为了进一步验证该结果，我们使用了不同剂量的带SEAP的报告病毒Ad2-SEAP和Ad5-SEAP进一步感染细胞，24小时后，取上清检测SEAP活性。如图1(F，G)所示，Ad+志愿者的相对光强度也远远高于CD14-志愿者的细胞上清。因此具有Ad预存反应的Ad+志愿者PBMC更容易被腺病毒Ad2,Ad5感染。
实施例2：Ad+志愿者的PBMC(外周血单个核细胞)分泌的某些因子有助于增强腺病毒的感染效率
为了阐明Ad+志愿者的PBMC腺病毒感染增强的机制，我们进行了淋巴细胞混合培养试验。
实验方法
分别将Ad5-和Ad5+志愿者者的PBMC按照以下比例混合培养：#1：全部是Ad5-,#2：Ad5-/Ad5+＝3:1，#3:Ad5-/Ad5+＝1:1,#4:Ad5-/Ad5+＝1:3,#5:全部是Ad5+。该混合细胞按照1250vp/cell的剂量感染Ad5-EGFP,培养24小时后，搜集细胞，加入CD14-PE抗体(BD)染色，用流式细胞仪检测CD14+细胞病毒的感染效率，并与预测感染效率相比较。
实验结果
如果腺病毒的感染效率只与其表面的受体相关，那么上述不同比例混合的PBMC其感染腺病毒的效率应为一条直线，然而实际检测到的病毒感染效率是在预测直线的上方呈一曲线，明显高于预测值(图2)。因此，除了细胞表面本身SR-A等受体之外，可能还有一些小分子在增强腺病毒感染方面发挥重要作用。
实施例3：通过添加或删除Ad+志愿者PBMC中的CD3+T细胞可以影响腺病毒感染CD14+单核细胞的效率。
在上面的实验中可以看出存在影响Ad感染效率的小分子，由于PBMC中的T细胞能够通过分泌细胞因子发挥作用，且在Ad再次感染时容易被激活并分泌细胞因子，因此我们推测PBMC中的CD3+T细胞可能在这个过程中发挥作用。
试验材料：
CD3-PerCP(品牌:BD Pharminge,货号:552851),CD19-PE-CY5(品牌:BDPharminge，货号:555414),CD56-PE(品牌:BD Pharminge，货号:556647),CD3+T磁珠分选试剂盒(品牌：Miltenyi Biotec，德国),CD19+B细胞磁珠分选试剂盒(品牌：MiltenyiBiotec，德国)。
试验方法：
磁珠分选：
1)新鲜分离的PBMC用分选缓冲液重悬
2)400g,离心7min；
3)弃掉上清
4)加入磁珠标记的单克隆抗体；
5)4度孵育15min；
6)再次用分选缓冲液重悬；
7)400g,离心7min；
8)弃掉上清，将标记的细胞加入到自动磁珠分离器中(Miltenyi Biotec)；
9)分别搜集标记的阳性细胞和非标记的阴性细胞群。
病毒感染和检测
将PBMC按照不同方式处理。处理方式包括：新鲜的PBMC,CD3-删除的PBMC(CD3-(Ad5+)),CD19-删除的PBMC(CD19-(Ad5+)),CD3-/CD19双删除的PBMC(CD3-CD19-),CD3-CD19双删除但添加了Ad5+志愿者的CD3+T细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD3(Ad5+)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5-志愿者的CD3+T细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD3(Ad5-)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5+志愿者的CD19+B细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD19(Ad5+)),CD3-CD19双删除但添加了Ad5-志愿者的CD19+B细胞(CD3-CD19-(Ad5+)+CD19(Ad5-))。然后上述处理的细胞加入1250vp/cell的Ad5-EGFP培养24小时，之后搜集细胞，加入CD14-PE(BD)抗体染色，用流式细胞仪检测病毒的感染效率，将各组感染效率作比较。
实验结果：
如图3所示，磁珠分选的CD3+T细胞和CD19+B细胞的纯度分别为97.2％和79.6％。Ad+志愿者的PBMC感染效率约为80％，在删除其中的CD3+T细胞之后其感染腺病毒的效率约降为40％，且重新加入Ad+志愿者的CD3+T细胞之后，其感染效率得到恢复，而加入Ad-志愿者的CD3+T细胞则无此效果。同样地，对于Ad-志愿者的PBMC来说，其感染腺病毒的效率约为20％，删除其中的CD3+T细胞对其感染效率无明显影响，但是加入Ad+志愿者的CD3+T细胞之后，其感染效率约增加到30％。而向Ad+和Ad-志愿者的PBMC中添加或者从中删除CD19+B细胞，对病毒的感染效率都无太大影响。因此，影响腺病毒感染的小分子主要来源于CD3+T细胞，具有预存免疫反应的Ad+志愿者的CD3+T细胞在增强腺病毒感染CD14+细胞的过程中发挥重要作用。
实施例4：预存的病毒特异性CD3+T细胞再次遇到腺病毒感染时更容易被激活
实验材料：
CD3-APC(品牌:BD Pharminge,货号:557597),CD3-PE(品牌:BD Pharminge,货号:552127),CD27-APC(品牌:BD Pharminge,货号:558664),CD95-PE(品牌:BD Pharminge,货号:555674),HLA-DR-APC品牌:BD Pharminge,货号:559866,KI67-PE,(BD Pharmingen,货号：556027)CD38-FITC,(STEMCELL Technologies，货号:60131FI)Integrinβ7-PE(Ebioscience,货号：12-5867-73).QIAGEN RNeasy Protect Mini Kit(品牌：QIAGEN，德国，货号:74126)，QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit(品牌：QIAGEN，德国，货号:204057)，anti-IFN-γmonoclonal antibody pair(品牌：U-Cytech,Netherlands,货号：CT640-10)antibody-coated 96-well plates，Immobilon-P membrane(品牌：Millipore,USA，货号：MSIPS4510),concanavalin A(品牌：Sigma-Aldrich,St.Louis，货号：C5275)，NBT/BCIP substrate(品牌：Pierce,Rockford,IL货号：34042),
检测仪器：CFX96Touch(Biorad,United States)；BD FACS LSR Fortessa flowcytometer(BD Biosciences,United States)；ELISPOT reader(Bioreader 4000,Germany)
试验方法：
IFN-γ酶联免疫斑点技术
第一天：
取一管包被抗体(抗鼠IFN-γ抗体对其中包含有这个抗体，品牌：BD，PharMingen；克隆号为R4-6A2)用无菌PBS(pH7.2-7.4)1:100稀释，100μl/孔加入到96孔PVDF膜板，4℃包被过夜。
第二天：
1)甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200μl R10完全培养基，37℃封闭2小时；
2)封闭期间分离PBMC；采用95％稀释的淋巴细胞分离液(商品名为opti-prep)分离淋巴细胞；
3)弃去封闭液，每孔加入100μl PBMC；
4)实验中设阳性对照组(ConA组)，裂解腺病毒(2ug/ml)，空白对照(DMSO)；在37℃5％CO2培养箱中孵育；
第三天：
5)24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220μl/well洗涤6次；
6)甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；
7)用含5％FBS的PBST按1:400稀释检测抗体(生物素标记的抗鼠IFN-γ抗体)，100μl/well，4℃过夜；
第四天：
8)用无菌PBST 220μl/孔洗涤4次；
9)甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；
10)配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5％FBS的PBST按1:2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100μl/孔，37℃，2小时；
11)处理BCIP/NBT底物(Pierce,Cat：34042),37℃温浴30min；
12)用无菌PBST 220μl/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干；
13)加入BCIP/NBT底物，100μl/孔，避光反应7min；
14)弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。
流式检测
Ad+志愿者和Ad-志愿者的PBMC按照1250vp/cell的剂量加入Ad2-△E1E3(Ad2-空载体，这是一种删除了腺病毒EI E3位点的复制缺陷性腺病毒),培养24h后，搜集细胞，加入CD3(BD),CD27(BD),CD38(BD),HLA-DR(BD),KI67(BD)，integrinβ7(BD)等染色，用流式细胞仪检测。
定量PCR
用QIAGEN RNeasy Protect Mini Kit(Cat NO:74126,Germany)试剂盒提取细胞RNA,用Nano Drop 8000(Thermo,United States)测RNA的浓度，调整浓度使各个样本保持一致，使用浓度一致的RNA作为模板做Q-PCR,每个样本做三个复孔。设计引物如下：
细胞因子GM-CSF：
正向引物：GAGGTCCTTGTCCATTCCA(SEQ ID NO.1)；
反向引物：GCAGATAGCCCATTTCATC(SEQ ID NO.2)；
细胞因子IL4：
正向引物：CAGTTCTACAGCCACCATGAGAA(SEQ ID NO.3)；
反向引物：CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCT(SEQ ID NO.4)；
IFN-γ：
正向引物：AGAGTGTGGAGACCATCAAGGA(SEQ ID NO.5)；
反向引物：TGCGTTGGACATTCGAGTCAG(SEQ ID NO.6)；
SR-A：
正向引物：CCAGGGACATGGGAATACAA(SEQ ID NO.7)；
反向引物：CCAGTGGGACCTCGATCTCC(SEQ ID NO.8)；
αvβ5：
正向引物：CTCATCGTTTCCATTCCAC(SEQ ID NO.9)；
反向引物：CGAGTTTGGTTTTCTGTCTT(SEQ ID NO.10)；
β-actin：
正向引物:CTGTGCTATGTCGCCCTAGA(SEQ ID NO.11)；
反向引物：GGAAGGTTGGAAGAGAGCCT(SEQ ID NO.12)。
使用20ul反应体系如下：(每孔量)2x reaction buffer,10ul；10uM正向引物,0.5ul；10uM反向引物,0.5ul；模板cDNA,2ul；H20,7ul。
反应程序如下：95.0℃，3min；95.0℃，10sec，56.0℃，30sec，循环44次；熔解曲线65℃ to 95℃，每次增长温度为0.5℃。
使用CFX Connect Real Time Detection System(Bio-Rad Laboratories)执行程序。
β-actin作为参照基因，使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。
实验结果：
如图4所示，Ad-志愿者的PBMC用Ad裂解物刺激时，几乎无IFN-r特异性的免疫应答产生，但是Ad+志愿者的PBMC用Ad裂解物刺激时，产生了约800个斑点，说明Ad+志愿者的PBMC存在很多Ad特异性的记忆细胞，再次受到Ad刺激时产生了强烈的免疫应答。此外，我们使用中国猕猴作为模型，检测Ad-和Ad+猕猴的PBMC受到Ad刺激时CD3+T细胞的增值，活化。发现Ad-和Ad+猕猴的CD3+T细胞表面增殖marker KI67,活化markerHLA-DR,CD38,CD95,CD27都有表达。但是Ad+猕猴的CD3+T细胞增殖活化水平显著高于Ad-猕猴CD3+T细胞。说明Ad+猕猴的PBMC受到Ad刺激时，CD3+T细胞更易于活化。此外，Ad再次感染时，Ad+猕猴的PBMC分泌了更高水平的说明GM-CSF,IFN-γ,IL4等细胞因子。因此，与Ad-个体相比，Ad+个体的PBMC再次受到腺病毒感染时，CD3+T细胞更容易活化，产生更多Ad特异性IFN-γ免疫应答，能够分泌更多的GM-CSF,IFN-γ,IL4等细胞因子。
实施例5：使用GM-CSF、IL4与细胞共孵育促进细胞表面整合素受体和SR-A受体上调表达，从而促进腺病毒感染靶细胞
1、实验材料
重组人GM-CSF细胞因子(品牌：R&D system，USA，货号:215-GM-050/CF)，重组猕猴IL4细胞因子(品牌：R&D system，USA，货号：1577-IL-010)，重组猕猴IFN-γ细胞因子品牌：R&D system，USA，货号：961-RM-025)
2、试验方法：
将新鲜分离的PBMC接种按照5×105细胞/孔接种到96孔板，然后按照1250vp/cell的剂量感染Ad2-EGFP和Ad2-SEAP。同时，在相应的孔中加入人GM-CSF(R&D system,USA),猕猴IL4(R&D system,USA)或IFN-γ(R&D system,USA)。终浓度分别为40ng/ml,20ng/ml,20ng/ml。培养箱中孵育24-48小时，细胞表面腺病毒受体表达和腺病毒的感染效率按照前述的方法进行检测。
3、实验结果：
如图5(A-C)所示，单独的PBMC感染Ad2-EGFP的效率约为30％，加入IFN-γ孵育之后，腺病毒的感染效率约降低到20％，而加入GM-CSF和IL4分别使腺病毒的感染效率增加到60％和70％。此外加入IFN-r也使降低了EGFP的平均荧光强度，而加入GM-CSF和IL4则使EGFP的平均荧光强度显著增强。为了进一步验证该结果，我们又使用了Ad2-SEAP来感染细胞。同样地，加入IFN-γ使SEAP的相对光强度有所下降，但是加入GM-CSF和IL4则使SEAP的相对光强度明显增加。
为了阐明其中的机制，我们检测了加入上述细胞因子对靶细胞表面腺病毒受体表达的影响。如图5(D-F)所示，加入上述细胞因子之后，细胞表面SR-A受体表达增加，整合素受体avβ5受体表达也增加。因此IFN-γ，GM-CSF和IL4都能上调靶细胞表面的腺病毒受体。但是IFN-γ本身的抗病毒作用抵消了这种促进效果，使得加入IFN-γ并未增强腺病毒的感染效率，而是抑制了腺病毒对靶细胞的感染。而GM-CSF和IL4都通过上调细胞表面腺病毒受体的表达促进了腺病毒对靶细胞的感染。而且细胞因子GM-CSF的最佳剂量为20-40ng/ml。细胞因子IL4的最佳剂量为10-20ng/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种增强腺病毒载体生物制品感染靶细胞的方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工引物
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ggaaggttgg aagagagcct 20
Claims (4)
1.一种促进腺病毒感染PBMC细胞的方法，加入细胞因子与PBMC细胞共同孵育；所述的细胞因子为IL4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的IL4孵育剂量为10~20 ng/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的腺病毒为Ad2或Ad5。
4.细胞因子在制备促进腺病毒感染PBMC细胞的试剂中的应用；所述的细胞因子为IL4。
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| SHUANG HUANG等.Upregulation of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 on human monocytes and T lymphocytes facilitates adenovirus-mediated gene delivery.《JOURNAL OF VIROLOGY》.1995,第69卷(第4期),文第2257页摘要部分、第2258页第1栏第6段及第2259页第1栏第3段. * |
| Upregulation of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 on human monocytes and T lymphocytes facilitates adenovirus-mediated gene delivery;SHUANG HUANG等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;19950430;第69卷(第4期);文第2257页摘要部分、第2258页第1栏第6段及第2259页第1栏第3段 * |
| 中国猕猴预存抗腺病毒中和抗体滴度对腺病毒体外感染单核细胞效率的影响;庄秋传等;《病毒学报》;20080915;第24卷(第5期);正文第383-389页 * |
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