CN117897489A - 控制nadh：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及通过使用重组微生物生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及其衍生物的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及控制NADH：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及通过使用重组微生物生产O‑磷酸丝氨酸、半胱氨酸及半胱氨酸衍生物的方法。

Description

控制NADH：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及通过使用重 组微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及其衍生物的方法

技术领域

本申请涉及调控NADH：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及使用重组微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及半胱氨酸衍生物的方法。

背景技术

L-半胱氨酸为在所有活有机体中在硫代谢中具有重要作用的氨基酸。它用在合成诸如头发角蛋白等的蛋白质、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸及其他含硫代谢物，并且也作为辅酶A生物合成的前体。使用微生物生产L-半胱氨酸的已知方法包括：1)使用微生物生物转化D,L-2-氨基噻唑啉-4-羧酸为L-半胱氨酸的方法，2)使用大肠杆菌(E.coli)通过直接发酵生产L-半胱氨酸的方法(EP 0885962 B；Wada,M.and Takagi,H.,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)，以及3)使用微生物通过发酵生产O-磷酸丝氨酸，以及在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶的催化作用下，通过O-磷酸丝氨酸与硫化物反应将O-磷酸丝氨酸转化为L-半胱氨酸的方法(US2012-0190081 A1)。

特别地，对通过方法3)以高产率生产半胱氨酸，应以过量生产前体O-磷酸丝氨酸。

发明内容

【技术问题】

本申请的技术问题为提供调控NADH：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及使用重组微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及半胱氨酸衍生物的方法。

【技术方案】

本申请的一个目的是提供具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性和O-磷酸丝氨酸生产能力的埃希氏菌属(Escherichia)的重组微生物。

本申请的另一目的是提供生产O-磷酸丝氨酸的方法，其包括：在培养基中培养本申请的生产O-磷酸丝氨酸的微生物。

本申请的又一目的是提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：

a)在培养基中培养具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物以生产O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基；以及

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(O-phosphoserine sulfhydrylase)(OPSS)或表达O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶的微生物的存在下，使步骤a)中生产的O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基与硫化物反应。

【有利效果】

本申请的具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产OPS的微生物能够以高效率生产OPS。

具体实施方式

以下将详细描述本申请。同时，本文公开的每个描述及实施方式可以应用在每个其他描述及实施方式。换言之，本文公开的各种要素的所有组合均落入本申请的范围内。进一步地，本申请的范围不受以下描述的具体说明的限制。此外，本说明书全文中引用了许多论文及专利文件。所引用的论文及专利文献的内容通过引用以其整体并入本文，并且本申请所属技术领域的水平以及本申请的内容将被更清楚地描述。

本申请的一个方面提供具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸”(下称“OPS”)是指丝氨酸的磷酸酯，其作为许多蛋白质的构成成分。特别地，OPS是L-半胱氨酸的前体并且可通过在OPS硫化氢解酶(下称“OPSS”)的催化作用下与硫化物反应转化为半胱氨酸，但不限于此(US 2012-0190081A1)。

如本文所用，术语“NADH：醌氧化还原酶”(下称“Nuo”)是指通过在微生物的电子传输链中氧化NADH以还原细胞膜中的醌的酶。酶蛋白质也可命名为NADH脱氢酶-1(NDH-1)。编码该蛋白质的基因可以是例如，nuoABCEFGHIJKLMN基因簇，但不限于此。nuoABCEFGHIJKLMN基因簇构成nuo操纵子，并且其表达可由操纵子前面的启动子和核糖体结合位点中的多核苷酸来调控。本申请中，“nuoABCEFGHIJKLMN基因”可与“编码NADH：醌氧化还原酶的基因”、“nuoABCEFGHIJKLMN基因”、“nuo操纵子”和“nuo基因”互换使用。

本申请中，“操纵子”是指DNA的功能单元，该功能单元包括其表达受到一个表达调控序列，特别是一个启动子调控的一组基因。由该操纵子转录的mRNA可为多顺反子mRNA，其中单一mRNA分子编码一个或多个蛋白质，或可为单顺反子mRNA，其中单一mRNA分子编码一个蛋白质。

Nuo是13个亚基蛋白(NuoA、NuoB、NuoC、NuoE、NuoF、NuoG、NuoH、Nuol、NuoJ、NuoK、NuoL、NuoM、NuoN)的复合体。两类操纵子，nuoABCEFGHIJKL和nuoMN，在每种亚基蛋白的翻译中用作模板。nuo操纵子的结构可在EcoCyc(www.biocyc.org)(登陆号EG12082)中找到。已知nuo操纵子包括结构基因及表达调控区。nuo操纵子的“表达调控区”是指存在于构成nuo操纵子的结构基因的上游并且因而可调控该结构基因表达的区域。nuo操纵子的表达调控区可包括启动子(nuoA启动子和/或nuoM启动子)，其不包括结构基因和操纵子，并且可具体地包括启动子。

nuo操纵子可包括编码与SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。具体地，nuo操纵子可包括编码SEQ ID NO：26至38的氨基酸序列或与其同源或同一的氨基酸序列并且表现相应功能的结构基因；以及调控结构基因序列表达的表达调控区。SEQ ID NO：26至38的序列可在已知数据库NCBI Genbank中确认。

具体地，nuo操纵子可以是具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和/或对SEQ ID NO：1具有70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的核苷酸序列。此外，显然地，其中部分序列被缺失、修饰、取代或添加的任意核苷酸序列也可落入本申请的范围内，只要核苷酸序列具有该同源性或同一性并且表现与nuo操纵子的功能相对应的功能即可。

如本文所用，术语“同源性和同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且以百分比表示。术语同源性和同一性经常可彼此互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可通过标准的比对算法测定并且可与通过正在使用的软件所建立的默认间隙罚分一起使用。基本上，一般预期在中度或高度严格条件下，同源性或同一性序列与全长序列的全部或至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。还考虑在杂交多核苷酸中含有简并密码子代替密码子的多核苷酸。

确定多肽或多核苷酸序列的同源性或同一性可通过，例如根据文献的BLAST算法(参见Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Pearson的FASTA(参见Methods Enzymol.,183,63,1990)。已开发基于算法BLAST的称为BLASTN或BLASTX的软件(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。进一步地，任何氨基酸或多核苷酸序列彼此是否具有同源性、相似性或单一性，其可通过在所限定的严格条件下的Southern杂交试验中比较序列，并且限定的合适的杂交条件在本领域的技术内，并且可通过本领域技术人员公知的方法来确定(例如，J.Sambrook等人Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology)。

只要本申请的微生物可生产OPS，本申请的微生物不受其类型限制，并且可为任何原核或真核微生物，具体地为原核微生物。原核微生物可包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Serratia)属、普罗维登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属和短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株，具体地为属于埃希氏菌属的微生物，并且更具体地为大肠杆菌(Escherichia coli)，但不限于此。特别地，在属于埃希氏菌属的微生物的情况下，OPS和L-丝氨酸可通过为L-丝氨酸生物合成途径的酶的SerA、SerC和SerB生产(Ahmed Zahoor,Computational and structural biotechnologyjournal,Vol.3,2012October；Wendisch V.F.等人,Curr OpinMicrobiol.2006Jun；9(3):268-74；Peters-Wendisch P.等人,Appl Environ Microbiol.2005Nov；7 1(II):7 139-44)。

本申请的“生产O-磷酸丝氨酸的微生物”是指具有天然生产O-磷酸丝氨酸能力的微生物，或其中对不具有生产O-磷酸丝氨酸能力的亲本菌株赋予O-磷酸丝氨酸生产能力的微生物。具体地，微生物可为因天然或人工基因修饰而具有增强的Nuo活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物。为了本申请的目的，生产O-磷酸丝氨酸的微生物可以是通过本申请公开的方法增强Nuo活性的能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物。本申请中，“生产O-磷酸丝氨酸的微生物”可与“O-磷酸丝氨酸生产微生物”或“具有O-磷酸丝氨酸生产能力的微生物”互换使用。

在一个实施方式中，本申请的生产O-磷酸丝氨酸的微生物可以是其中Nuo活性被增强的基因修饰微生物或重组微生物，从而增加期望的O-磷酸丝氨酸生产能力，但不限于此。

如本文所用，术语蛋白质的“活性的增强”是指与其内源活性相比蛋白质活性增加。“内源活性”是指当性状因天然或人工因素通过基因修饰而改变时，转化前的亲本菌株或未经修饰的微生物原始拥有的特定蛋白质活性，并且可与“修饰前活性”互换使用。与其内源活性相比蛋白质活性“增加”是指与转化前的亲本菌株或未经修饰的微生物原始拥有的特定蛋白质活性相比，蛋白质活性增强。例如，亲本菌株可为大肠杆菌ATCC27325。作为另一实例，亲本菌株可以是包括修饰以增加OPS生产能力的菌株，例如，CA07-0012(KCCM11212P；US2012-0190081 A)或CA07-4821，但不限于此。

“活性的增强”可通过引入外源蛋白质或通过增强内源蛋白质活性而实现，并且可具体地通过增强内源蛋白质活性而实现。蛋白质活性的增强可通过蛋白质活性水平、表达量水平或由蛋白质生产的产物量的增加来确认。

可通过本领域公知的多种方法应用活性的增强，方法不受限制，只要其与修饰前微生物的活性相比，方法可增强靶蛋白的活性即可。具体地，可使用本领域技术人员公知的基因工程和/或蛋白质工程，其为分子生物学常见方法，但方法不限于此(例如Sitnicka等人Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook等人Molecular Cloning 2012,等)。

本申请中，针对活性增强靶向的蛋白质，即靶蛋白，可以是Nuo，但不限于该蛋白质，只要其为“通过消耗NADH形成质子驱动力的蛋白质”或“消耗NADH的蛋白质”并且两种蛋白质都通过nuo操纵子编码。

本申请的Nuo活性的增强可包括构成Nuo蛋白质复合体的亚基蛋白质的一个或多个的活性增强。

具体地，本申请的蛋白质的活性增强可通过下述方式实现：

1)增加编码蛋白质的基因的细胞内拷贝数；

2)修饰染色体上的编码蛋白质的基因的表达调控区；

3)修饰编码蛋白质的基因转录物的起始密码子或5’-UTR的编码核苷酸序列；

4)修饰氨基酸序列使得蛋白质活性增强；

5)修饰编码蛋白质的多核苷酸序列使得蛋白质活性增强(例如，修饰编码蛋白质的基因序列以编码经修饰为增强活性的蛋白质)；

6)引入表现蛋白质活性的外源多核苷酸或多核苷酸的密码子优化的变体多核苷酸；

7)编码蛋白质的多核苷酸的密码子优化；

8)分析蛋白质的三级结构并且从而选择和修饰暴露位点，或对其化学修饰；或

9)选自上述1)至8)的两种或更多种的组合，但不限于此。

具体地，增加编码蛋白质的基因的细胞内拷贝数的方法1)可通过本领域已知的任何方法实现，例如，通过引入载体至宿主细胞中，载体可操作地连接至编码蛋白质的基因并且能与宿主细胞无关地复制和发挥作用。此外，该方法可通过引入载体至宿主细胞中进行，载体可操作地连接至基因并且能将基因插入至宿主细胞的染色体中，但不限于此。

如本文所用，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，该多核苷酸序列可操作地连接至适当的调控序列，从而能在适当的宿主细胞中表达靶蛋白。表达调控序列可包括能起始转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调控转录和翻译终止的序列。转化进入适当的宿主细胞后，载体可独立于宿主基因组复制或发挥作用，或可整合至宿主的基因组中。

只要载体可复制，本申请中使用的载体无特别限制，并且可使用本领域已知的任何载体。一般使用载体的实例可包括天然或重组的质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；以及作为质粒载体，可使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pSK、pSKH和pET等的那些。具体地，可使用pCL、pSK、pSKH130、pDZ、pACYC177、pACYC184、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

将多核苷酸插入至染色体中可通过本领域已知的任何方法进行，例如，同源重组，但不限于此。

如本文所用，术语“转化”是指将含有编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体引入至宿主细胞中，从而由多核苷酸编码的蛋白质可在宿主细胞中表达。只要经转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，则经转化的多核苷酸整合至宿主细胞的染色体中并且位于染色体中还是染色体外并不重要，并且二种情况都包括在内。用于转化载体的方法包括将核酸引入细胞中的任何方法，并且可根据宿主细胞通过选择本领域已知的适当标准技术进行。例如，转化可经由电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术等进行，但方法不限于此。

进一步地，如本文所用，术语“可操作地连接”指多核苷酸序列功能性地连接至起始和介导本申请的编码靶蛋白的多核苷酸转录的启动子序列或表达调控区。可操作的连接可使用本领域已知的基因重组技术制备，以及位点特异性DNA裂解和连接可使用本领域已知的裂解和连接酶等制备，但不限于此。

修饰染色体上编码蛋白质的基因的表达调控序列的方法2)可通过本领域已知的任何方法实现，例如，通过核酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合，诱导序列上的修饰，以进一步增强表达调控序列的活性，或通过以具有更强活性的核酸序列置换序列或插入序列。表达调控序列可包括但不特别限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译的终止的序列等。方法可具体地包括在原始启动子下游插入强异源性启动子，但不限于此。

已知的强启动子的实例可包括CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子和rmf启动子等，但不限于此，并且可包括用与其内源性活性相比更强的启动子的所有取代。

修饰编码蛋白质的基因转录物的起始密码子或5’-UTR的核苷酸序列的方法3)可通过本领域已知的任何方法实现，例如，通过以与其内源性起始密码子相比具有更高的蛋白质表达率的另一起始密码子取代蛋白质的内源性起始密码子，但不限于此。

修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的方法4)和5)可通过本领域已知的任何方法实现，例如，通过在多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合，诱导序列上的修饰，以进一步增强多核苷酸序列的活性，或者通过用修饰成具有更强活性的多核苷酸序列置换该序列。置换可通过将基因经由同源重组插入至染色体中来具体进行，但不限于此。

本文使用的载体可进一步包括选择标记以确认插入至染色体中。选择标记是用于选择用载体转化的细胞，即，用于确认待引入的基因的插入，并且可使用提供可选择性表型如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的耐受性或表面蛋白表达的标记，但选择标记不限于此。仅表达选择标记的细胞能在经选择剂处理的环境中存活或显示不同表型，并且因此转化的细胞可以被选择。

引入具有蛋白质活性的外源多核苷酸的方法6)可通过本领域已知的任何方法实现，例如，通过将编码与蛋白质表现出相同或相似活性的蛋白质的外源多核苷酸或其密码子优化的变体多核苷酸引入宿主细胞中。可以不受限制地使用外源多核苷酸，无论其来源或序列如何，只要其表现与蛋白质相同或相似活性。另外，引入的外源多核苷酸可通过优化其密码子而引入至宿主细胞中，从而在宿主细胞中实现优化的转录和翻译。可通过本领域技术人员合适地选择本领域已知的转化方法进行引入，以及宿主细胞中引入的多核苷酸的表达使该得能够生产蛋白质，从而增加其活性。

编码蛋白质的多核苷酸的密码子优化的方法7)可通过内源性多核苷酸的密码子优化以增加宿主细胞内的转录或翻译，或通过优化其密码子以使得外源多核苷酸的优化的转录和翻译可在宿主细胞内实现来实现。

分析蛋白质的三级结构并且从而选择和修饰暴露位点或对其化学修饰的方法8)可被实现，例如，通过比较待分析的多肽的序列信息与数据库(在该数据库中储存已知蛋白质的序列信息)，以根据序列相似性程度确定候选模板蛋白质，并且因此基于该信息确认结构，以从而选择和转化或修饰待修饰或化学修饰的暴露位点。

在一个实施方式中，蛋白质活性的增强可通过上述1)至2)中的任何一种或多种实现。

在上述实施方式中的任何一个中，本申请的NADH：醌氧化还原酶活性的增强可以是nuo操纵子表达的增强。在上述实施方式中的任何一个中，NADH：醌氧化还原酶活性的增强可包括在编码其的基因的上游具有增强活性的基因表达调控序列。具体地，编码NADH：醌氧化还原酶的基因的上游可以是nuoA基因的上游。在一个实施方式中，通过修饰存在于编码Nuo蛋白质复合体的nuo操纵子中的一种表达调控序列，NADH：醌氧化还原酶活性的增强可以是存在于该操纵子中的一个或多个结构基因例如，2个或更多个、3个或更多个或全部结构基因序列表达的增强。具体地，表达调控序列的修饰可以是nuo操纵子的内源性启动子和nuoA基因之间另外插入具有增强活性的基因表达调控序列；例如，基因表达调控序列可以是启动子，但不限于此。

蛋白质活性的这种增强可意味相对于野生型或修饰前微生物中表达的蛋白质活性或浓度，蛋白质的活性或浓度增加，或由蛋白质生产的产品的量增加，但不限于此。

如本文所用，术语“修饰前菌株”或“修饰前微生物”不排除含有在微生物中可自然发生的突变的菌株，并且可意指其天然型菌株，或由自然或人工因素引起的基因修饰所造成的性状改变前的菌株。本申请中，性状的修饰可为Nuo活性的增强。“修饰前菌株”或“修饰前微生物”可与“非突变体菌株”、“非修饰菌株”、“非突变体微生物”、“非修饰微生物”或“参考微生物”互换使用。

本申请的微生物进一步增强生产OPS的能力和/或将OPS分泌至细胞外的能力；或可包括增强OPS分解的能力和/或流入能力的修饰。

增强生产OPS的能力和/或将OPS输出至细胞外的能力，或增强OPS分解和/或流入能力的修饰的实例可包括磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性弱化、磷酸丝氨酸分泌蛋白质(YhhS)的活性增强或这些修饰的组合，但不限于此。

如本文所用，术语多肽的“减弱”是综合概念，其包括与其内源性活性相比活性降低或无活性。减弱可与术语诸如失活、缺陷、下调、减少、降低、弱化等术语互换使用。

减弱也可包括其中由于编码多肽的多核苷酸的突变，与微生物原始所具有多肽的活性相比，多肽活性本身减少或移除的情况；其中由于编码多肽的多核苷酸基因表达的抑制或翻译成多肽的抑制等，与天然菌株相比，细胞内多肽活性和/或浓度(表达水平)的总体水平减少的情况；其中多核苷酸是根本不表达的情况；和/或其中即使表达多核苷酸时，也未观察到多肽活性的情况。如本文所用，术语“内源活性”是指当性状经由天然或人工因素引起的基因修饰而改变时，转化前的亲本菌株、野生型或非修饰微生物原始拥有的特定多肽活性，并且可与“修饰前活性”互换使用。多肽活性与其内源活性相比，“失活、缺陷、减少、下调、降低或弱化”的表述，是指与转化前的亲本菌株或非修饰微生物原始拥有的特定多肽活性相比，该多肽活性减少。

多肽活性的减弱可通过本领域已知的任何方法进行，但方法不限于此，且可通过应用本领域已知的多种方法(例如，Nakashima N等人,Bacterial cellular engineeringby genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773-2793,Sambrook等人.Molecular Cloning 2012,等)实现。

具体地，本申请的多肽活性的减弱可通过以下实现：

1)缺失编码多肽的基因的一部分或全部；

2)修饰表达调控区(表达调控序列)使得编码多肽的基因表达减少；

3)修饰构成多肽的氨基酸序列，使得多肽活性被移除或减弱(例如，氨基酸序列上一个或多个氨基酸的缺失/取代/添加)；

4)修饰编码多肽的基因序列，使得多肽活性被移除或减弱(例如，在多肽基因的核苷酸序列上一个或多个核苷酸的缺失/取代/添加，以编码多肽，该多肽已被修饰以移除或减弱多肽活性)；

5)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR的编码核苷酸序列；

6)引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)，其互补结合编码多肽的基因转录物；

7)在编码多肽的基因的SD序列前端添加与Shin-Dalgamo(SD)序列互补的序列以形成二级结构，从而抑制核糖体附接；

8)逆转录工程化(RTE)，其在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加将被逆转录的启动子；或

9)选自上述方法1)至8)中的两个或多个的组合，但不特别限于此。

例如，

缺失编码多肽的基因的一部分或全部的方法1)可通过缺失染色体内编码内源性靶多肽的多核苷酸的全部，或通过用具有部分缺失的核苷酸的多核苷酸或用标记基因置换多核苷酸而实现。

修饰表达调控区(表达调控序列)的方法2)可通过缺失、插入、非保守取代或保守取代或其组合诱导表达调控区(表达调控序列)上的修饰；或通过用具有较弱活性的序列置换序列而实现。表达调控区可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列以及用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。

进一步地，修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR的编码核苷酸序列的方法5)可通过，例如，用编码与内源性起始密码子相比具有较低的多肽表达率的另一起始密码子的核苷酸序列取代该核苷酸序列而实现，但不限于此。

修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的方法3)及4)可通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导序列上的修饰以减弱多肽活性，或通过用修饰为具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列，或修饰为不具有活性的氨基酸序列或多核苷酸序列置换该序列而实现，但不限于此。例如，可通过对多核苷酸序列中引入突变以形成终止密码子来抑制或减弱基因表达，但不限于此。

引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA(该反义寡核苷酸互补结合编码多肽的基因转录物)的方法6)可在文献[Weintraub,H.等人,Antisense-RNA as a molecular tool forgenetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986]中找到。

在编码多肽的基因的SD序列前端添加与Shine-Dalgamo(SD)序列互补的序列以形成二级结构，从而抑制核糖体附接的方法7)可通过抑制mRNA翻译或减低其速度而实现。

逆转录工程化(RTE)(其在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加将被逆转录的启动子)的方法8)可通过形成与编码多肽的基因转录物互补的反义核苷酸以减弱活性而实现。

本申请的SerB具有转化OPS为L-丝氨酸的活性，并且因此被修饰以减弱SerB活性的微生物具有在其中累积OPS的性质，因此可用于生产OPS。本申请的SerB可以是具有或包括SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质，或可以是由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质，但不限于此。此外，本申请的SerB可具有或包括与SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的序列同源性或同一性的氨基酸序列，只要其显示SerB活性。另外，本申请的SerB可由与SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的序列同源性或同一性的氨基酸序列组成或基本上由其组成，但不限于此。此外，编码SerB的多核苷酸可具有或包括编码SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。进一步，编码SerB的多核苷酸可由编码SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或基本上由其组成。本申请的编码SerB的多核苷酸可在不改变SerB蛋白质的氨基酸序列的范围内，因密码子简并性或考虑待表达SerB蛋白质的有机体中优选的密码子，在编码区中进行各种修饰。本申请的编码SerB的多核苷酸可具有或包括与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的并且少于100％的同源性或同一性的核苷酸序列。此外，本申请的编码SerB的多核苷酸可由与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的并且少于100％的同源性或同一性的核苷酸序列组成或基本上由其组成，但不限于此。

本申请的YhhS具有输出OPS的活性，并且因此被修饰以增强YhhS活性的微生物具有输出OPS的性质，因此可有用于生产OPS。本申请的YhhS可以是具有或包括SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质，或可以是由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列组成或基本上由其组成的蛋白质，但不限于此。此外，本申请的YhhS可具有或包括与SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的序列同源性或同一性的氨基酸序列，只要其显示YhhS活性。此外，本申请的YhhS可由与SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列组成或基本上由其组成，但不限于此。此外，编码YhhS的多核苷酸可具有或包括编码SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的核苷酸序列。进一步，编码YhhS的多核苷酸可由编码SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或基本上由其组成。本申请的编码YhhS的多核苷酸可在不改变YhhS蛋白质的氨基酸序列的范围内，因密码子简并性或考虑待表达YhhS蛋白质的有机体中优选的密码子，在编码区中进行各种修饰。本申请的编码YhhS的多核苷酸可具有或包括与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的并且少于100％的同源性或同一性的核苷酸序列。此外，本申请的编码YhhS的多核苷酸可由与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有70％、80％、90％、95％或99％或更高的并且少于100％的同源性或同一性的核苷酸序列组成或基本上由其组成，但不限于此。

在一个实施方式中，包括修饰以增强生产OPS的能力和/或输出OPS至细胞外的能力；或以增强OPS分解和/或流入能力的微生物可为CA07-0012(KCCM 11212P；US 2012-0190081A)或CA07-4821，但不限于此。关于生产OPS微生物的内容，除上述那些之外，还可使用KR专利第1381048号或US公开第2012-0190081号的公开内容作为本申请的参考。

本申请的另一方面提供用于生产OPS的方法，其包括在培养基中培养具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产OPS的微生物。

微生物如上所述。

如本文所用，术语“培养”是指微生物在适当控制的环境条件下生长。本申请的培养过程可在本领域已知的适当培养基和培养条件中进行。该培养过程可由本领域技术人员根据待选择的菌株容易地调整。具体地，培养可为分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。

在培养微生物中，培养基可进一步含有甘氨酸或丝氨酸。甘氨酸可以以纯的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰胨的形式提供。在培养基中待含有的甘氨酸的浓度一般为0.1g/L至10g/L，并且具体地为0.5g/L至3g/L。此外，丝氨酸可以以纯的丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰胨的形式提供。在培养基中待含有的丝氨酸的浓度一般为0.1g/L至5g/L，并且具体地为0.1g/L至1g/L。

在培基中待含有的碳源的实例可包括糖和碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素)；油和脂肪(如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油)；脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇(如甘油和乙醇)；以及有机酸(如乙酸)。这些碳源可单独使用或组合使用，但不限于此。

在培基中待含有的氮源的实例可包括有机氮源(如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粉)；以及无机氮源(如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。这些氮源可单独使用或组合使用，但不限于此。

在培基中待含有的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐，但不限于此。

此外，培养基可包括金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)，以及可进一步含有氨基酸、维生素和合适的前体。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培养形式添加至培养物，但不限于此。

培养物的pH可通过以合适的方式在培养期间添加化合物(如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸)来调节。此外，可使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂在培养期间预防气泡形成。进一步，可对培养物注入氧气或含氧的气体以维持培养物的有氧状态；或可注入氮气、氢气或二氧化碳，或可不注入气体，以维持厌氧或微厌氧状态。培养物的温度可为25℃至40℃的范围，具体地由30℃至35℃。培养可持续直到可获得有用的材料的生产，并且具体地由10小时至100小时，但不限于这些示例性实例。

本申请可在本申请方法的培养步骤前进一步包括制备培养基的步骤，但不限于此。

方法可进一步包括从培养基或微生物回收OPS的步骤。可在培养步骤之后进一步地包括回收步骤。

在本申请的回收OPS的方法中，可根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养溶液收集期望的OPS。例如，可以使用方法(如离心、过滤、离子交换层析、结晶和HPLC)，并且可使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物回收期望的OPS。

进一步，回收步骤可进一步地包括纯化过程，纯化过程可使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收的OPS可以处于纯化状态或在含有OPS的微生物发酵液体培养基中。此外，OPS的回收可通过在培养步骤之前和之后以及回收步骤之前和之后添加本领域已知的适当方法而有效地进行。

本申请的又一方面提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：

a)在培养基中培养具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物以生产O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基；以及

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达该酶的微生物的存在下，使步骤a)中生产的O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基与硫化物反应。

步骤a)及b)不一定受顺序所限制，即连续进行或顺序地进行，并且这些步骤之间可没有时间间隔，以及这些步骤可同时进行，或以数秒、数分钟、数小时、数日的间隔进行。

具体地，方法可以是用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法：其包括在培养基中培养具有增强的Nuo活性的生产OPS的微生物以生产OPS或含有OPS的培养基；以及在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达该酶的微生物的存在下，将步骤a)中生产的O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基与硫化物反应。NADH：醌氧化还原酶活性的增强和生产O-磷酸丝氨酸的微生物如上所述。

如本文所用，术语“衍生物”是指通过化学性修饰任何化合物中的一部分所获得的类似化合物。该术语通常是指其中氢原子或特定原子团被另一原子或原子团取代的化合物。

如本文所用，术语“半胱氨酸衍生物”是指其中半胱氨酸中的氢原子或特定原子团被另一原子或原子团取代的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有其中半胱氨酸中的胺基(-NH₂)的氮原子或硫醇基(-SH)的硫原子具有附接至其的另一原子或原子团的形式，并且半胱氨酸衍生物的实例可包括NAC(N-乙酰半胱氨酸)、SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)、Boc-CyS(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-胺基-4-(乙硫基)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸等，但不限于此。

只要根据本申请的方法生产半胱氨酸，转化为半胱氨酸衍生物可通过本领域已知的方法容易地转化为各种半胱氨酸衍生物。

具体地，生产半胱氨酸衍生物的方法可进一步包括将步骤b)中生产的半胱氨酸转化为半胱氨酸衍生物。例如，半胱氨酸可通过与乙酰化剂的反应合成为N-乙酰半胱氨酸(NAC)，或其可通过在碱性条件下与卤代乙酸的反应合成为S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)，但不限于此。

这些半胱氨酸衍生物主要用作用于镇咳剂、止咳剂以及支气管炎、支气管哮喘、咽喉炎等的治疗剂的药物原料，但不限于此。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)”是指将OPS由硫醇基(-SH基)转化为半胱氨酸的反应进行催化的酶。该酶可能已首先在敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatics)及阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中发现(Mino K.and Ishikawa K.,FEBS Letters,551:133-138,2003；Burns K.E.等人,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS不仅可包括野生型OPSS蛋白，也包括变体蛋白，该变体蛋白包括编码OPSS的多核苷酸序列的一部分的缺失、取代或添加，其显示出等于或高于野生型OPSS蛋白的生物活性的活性，并且也可包括在US2012-0190081 A1和US 9127324 B2中所公开的所有OPSS蛋白及其变体。

在本申请中使用的硫化物可以是不仅以本领域中一般使用的固体形式提供的任何硫化物，而且由于pH、压力和溶解度的差异而以液体或气体形式提供的任何硫化物，因此可以不受限制地转化为例如硫化物(S^2-)或硫代硫酸盐(S₂O₃ ^2-)形式的硫醇(SH)基团。具体地，硫化物可以包括Na₂S、NaSH、H₂S、(NH₄)₂S、NaSH和Na₂S₂O₃，其可以向OPS提供硫醇基，但不限于此。在反应中，将单个硫醇基团提供给单个反应性OPS基团以产生单个半胱氨酸或其衍生物。在该反应中，基于OPS的摩尔浓度，以0.1至3摩尔当量，并且具体地1至2摩尔当量的量具体地添加硫化物，但不限于此。

本申请的再一方面提供生产OPS的微生物的生产方法，其包括：修饰埃希氏菌属的微生物以增强NADH：醌氧化还原酶的活性。

本申请的又一目标提供具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的微生物的生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸或其衍生物的用途。

NADH：醌氧化还原酶、其活性增强、微生物等如上所述。

实施例

将通过实施例更详细地描述本申请。然而，对在本申请所属领域的技术人员来说明显的是这些实施例仅提供用于示例的目的，并且本发明的范围不意于限制于这些实施例或被这些实施例所限制。

实施例1：具有突变的Nuo表达调控区的菌株的OPS生产能力的评估

作为先前研究的结果，发现在生产OPS的宿主菌株中的nuoA、rmf和idi基因的平均转录水平分别为8986、32205和631，并且各培养段的具体值示于表1中。

[表1]

确认rmf转录水平的平均值是nuoA转录水平的平均值的3.6倍，并且idi转录水平的平均值是nuoA转录水平的平均值的0.07倍。这些结果表明，与nuoA的启动子相比，rmf基因的启动子是强启动子并且idi基因的启动子是弱启动子。

因此，尝试比较当通过将具有不同活性的rmf启动子和idi启动子插入到生产OPS的微生物内的nuo操纵子(SEQ ID NO：1)中以调控NADH：醌氧化还原酶表达时的微生物的OPS生产能力。

1-1：用于增强Nuo表达调控区的质粒的构建

基于大肠杆菌ATCC27325染色体DNA作为模板，使用具有SEQ ID NO：14和15的核苷酸序列的引物对获得nuo基因野生型启动子上游区中的基因片段，并且使用具有SEQ IDNO：18和19的核苷酸序列的引物对获得启动子下游区中的基因片段。此外，基于大肠杆菌ATCC27325染色体DNA作为模板，使用具有SEQ ID NO：16和17的核苷酸序列的引物对获得rmf基因启动子区。

为了获得片段，使用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶进行PCR，并且在95℃下变性2分钟，接着在95℃下变性30秒、在60℃下退火30分钟和在72℃下聚合60秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的PCR扩增条件下进行PCR。

通过上述过程获得的nuo启动子的上游片段和下游片段以及rmf启动子片段使用融合克隆试剂盒(in-fusion cloning kit)(Clontech Laboratories,Inc.)经采用限制酶EcoRV裂解的用于染色体转化的pSKH130载体(SEQ ID NO：39，US公开号2020-0048619)进行克隆，以获得重组质粒，并且将其命名为pSKH130_Prmf-nuoA。

1-2：用于减弱Nuo表达调控区的质粒的构建

基于大肠杆菌ATCC27325染色体DNA作为模板，使用具有SEQ ID NO：14和20的核苷酸序列的引物对获得nuo基因野生型启动子上游区中的基因片段，并且使用具有SEQ IDNO：23和19的核苷酸序列的引物对获得启动子下游区中的基因片段。此外，基于大肠杆菌ATCC27325染色体DNA作为模板，使用具有SEQ ID NO：21和22的核苷酸序列的引物对获得idi基因启动子区。

在如实施例1-1中相同的PCR条件下进行PCR以获得片段，并且使用片段以与实施例1-1相同的方式进行克隆以获得重组质粒。将这命名为pSKH130_Pidi-nuoA。

实施例1-1和1-2中使用的引物序列示于表2中。

[表2]

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1-3：Nuo表达调控区突变菌株的构建

实施例1-1中制备的pSKH130_Prmf-nuoA通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)转化至具有OPS生产能力的CA07-0012(KCCM 11212P，U.S.公开号2012-0190081)中并且经历二次交换，从而获得其中rmf基因的启动子核苷酸序列被插入在nuo基因的野生型启动子核苷酸序列末端处的CA07-4826菌株。

具体地，pSKH130载体含有PI蛋白质(pir基因)-依赖性R6K复制子、SacB(果聚糖蔗糖酶)基因和卡那霉素耐受基因。在一次交换使用R6K和卡那霉素获得所期望的菌株后，从含有蔗糖的培养基移出抗生素以制备菌株。

在CA07-4826中，使用SEQ ID NO：24和25的引物对通过PCR和基因组测序来确认rmf启动子核苷酸序列的插入。

以照相同方式，实施例1-2中制备的pSKH130_Pidi-nuoA通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541–545)转化并且经历二次交换，从而获得其中idi基因的启动子核苷酸序列被插入在nuo基因的野生型启动子核苷酸序列末端处的CA07-4827菌株。在CA07-4827中，使用SEQ ID NO：24和25的引物对通过PCR和基因组测序来确认idi启动子核苷酸序列的插入。使用的引物序列示于表3中。

[表3]

1-4：使用效价培养基的nuo操纵子增强和减弱菌株的OPS生产能力的比较

为了评估实施例1-3中制备的两种菌株CA07-4826和CA07-4827以及对照CA07-0012的OPS生产能力，使用下述培养基(表4)进行评估。

[表4]

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具体地，将每种菌株铺板在固体LB培养基上并且在33℃培养箱中培养过夜。将在固体LB培养基中培养过夜的菌株接种在下表3中示出的25mL效价培养基中，然后在33℃下以200rpm速率在培养箱中培养48小时。生产的OPS浓度示于表5中。

[表5]

菌株名称	OPS(g/L)
		CA07-0012	1.95
CA07-4826	2.20
		CA07-4827	0.40

其中nuo操纵子通过rmf启动子增强的CA07-4826与亲本菌株相比显示约12.8％的OPS生产能力改善，并且其中nuo操纵子通过idi启动子减弱的CA07-4827与亲本菌株相比显示约79.5％的OPS生产能力降低。

实施例2：具有增强的OPS生产能力的菌株中根据nuo操纵子增强的OPS生产能力的 评估

尝试确认在具有增强的OPS输出能力的菌株中，当Nuo操纵子增强时，OPS生产能力是否进一步增加。为此，在用具有OPS输出能力的蛋白质YhhS(SEQ ID NO：4，美国专利号10323262B2)增强的菌株中，当nuo操纵子进一步增强时，评估OPS生产能力。

2-1：用于在OPS生产菌株中增强YhhS的质粒的构建

基于大肠杆菌ATCC27325染色体DNA作为模板，使用具有SEQ ID NO：6和7的核苷酸序列的引物对获得yhhS基因野生型启动子上游区中的基因片段，并且使用具有SEQ ID NO：8和9的核苷酸序列的引物对获得yhhS基因野生型启动子下游区中的基因片段。此外，基于pCL_Ptrc-gfp(US2017-0247727 Al)作为模板，使用SEQ ID NO：8和9的引物对获得trc启动子(Ptrc)。使用的引物序列示于下表6中。

[表6]

为了获得片段，使用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶进行PCR，并且在95℃下变性2分钟，接着在95℃下变性30秒、在60℃下退火30分钟和在72℃下聚合60秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的PCR扩增条件下进行PCR。

通过上述过程获得的yhhS启动子的上游片段和下游片段以及trc启动子片段使用融合克隆试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)经采用限制酶EcoRV裂解的用于染色体转化的载体进行克隆，以获得重组质粒，并且将其命名为pSKH130_Ptrc-yhhS。

2-2：YhhS增强的菌株的构建

实施例2-1中制备的pSKH130_Ptrc-yhhS通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)转化至CA07-0012中并且经历二次交换，从而获得其中trc启动子核苷酸序列被插入在yhhS基因野生型启动子核苷酸序列末端处的CA07-4821菌株。在CA07-4821菌株中，使用SEQ ID NO：12和13(表7)的引物对通过PCR和基因组测序来确认trc启动子核苷酸序列的插入。

[表7]

2-3：使用效价培养基的YhhS-增强菌株的OPS生产能力的评估

为了评估实施例2-2中制备的菌株CA07-4821及其亲本菌株CA07-0012的OPS生产能力，使用培养基(表4)以与实施例1-4相同方式进行评估。

结果，确认CA07-4821与CA07-0012相比显示约26.7％的OPS生产能力改善，并且结果示于表8中。

[表8]

2-4：具有增强的YhhS和nuo操纵子的菌株的构建

实施例1-1中制备的pSKH130_Prmf-nuoA通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541–545)转化至实施例2-3中制备的CA07-4821中并且经历二次交换，从而获得其中rmf基因启动子核苷酸序列被插入在nuo基因野生型启动子核苷酸序列末端处的CA07-4828菌株。

在CA07-4828中，使用SEQ ID NO：24和25的引物对通过PCR和基因组测序来确认rmf启动子核苷酸序列的插入。

2-5：使用效价培养基具有增强的Yhhs和nuo操纵子的菌株的OPS生产能力的评估

为了评估CA07-4828的OPS生产能力，使用CA07-4821作为对照，以与实施例1-4相同方式进行评估，并且结果示于表9中。

[表9]

菌株名称	OPS(g/L)
		CA07-4821	2.47
CA07-4828	2.53

在其中YhhS和nuo操纵子被同时增强的CA07-4828的情况下，与其中仅有YhhS被增强的CA07-4821相比，OPS生产能力改善约2.4％。因此，确认甚至在具有增强的OPS生产能力的菌株中，nuo操纵子的增强进一步增加OPS生产能力。

根据以上内容，本申请所属领域中的技术人员将能够理解，本申请在不改变本申请的技术概念或本质特征的情况下，可以以其他具体形式实施。在这方面，本文所公开的示例性实施方式仅用于示例目的并且不应被解释为限制本申请的范围。相反地，本申请意在不仅涵盖示性例实施方式，也涵盖可包括在由所附权利要求限定的本申请的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其他实施方式。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 控制NADH：醌氧化还原酶表达的重组微生物，以及通过使用重组微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸及其衍生物的方法

<130> OPA22034

<150> KR 10-2021-0081785

<151> 2021-06-23

<160> 39

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 15655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> nuo 操纵子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(630)

<223> nuoA 启动子

<220>

<221> misc_feature

<222> (631)..(633)

<223> nuoA 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1090)..(1092)

<223> nuoB 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (1846)..(1848)

<223> nuoC 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (3651)..(3653)

<223> nuoE 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (4148)..(4150)

<223> nuoF 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (5532)..(5534)

<223> nuoG 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (8261)..(8263)

<223> nuoH 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (9253)..(9255)

<223> nuoI 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (9807)..(9809)

<223> nuoJ 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (10358)..(10360)

<223> nuoK 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (10657)..(10659)

<223> nuoL 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (12662)..(12664)

<223> nuoM 起始密码子

<220>

<221> misc_feature

<222> (14378)..(14380)

<223> nuoN 起始密码子

<400> 1

tcgacggacg atagataatt cctgagacaa tagtgtaaaa aacgagccgc tgggggtgtt 60

ttaaacccca gcggcttttt tttagtaaaa atccttcatc gcatagtgca gaacgtacaa 120

aactgttcat ttttcaacca ccagagattc acgtcccgaa cgcacaaata atcgcctgaa 180

aaaaatcacc tgctacaatg atgttaaaaa atacgtaaat ttgttgctgc gtttttgtta 240

tggaatgaca aaagcgtgtc acagatcaag aaaatactct cttttggggg gaggaatcga 300

cacaaattcc tgtcaaaata gacccgtatt ttttccattg cttcacaacg gacacgattc 360

aacaacatct aattatcctg gagtcgtcaa ggatctgggg tgaaagggca ttaaatgcta 420

atggtgttga tattatgtaa actaatgtga agaaactttt gttaaagttg acaaaaggtt 480

atagaaagga gtaaaaaacc acatcaatta gctgtataaa agaatttcta cagtgattgt 540

aaggtttttt ttattcctcc ccatgaatcg atgtggcgtc catctgccgt gaagagcagt 600

gaatctggcg ctacttttga tgagtaagca atgagtatgt caacatccac tgaagtcatc 660

gctcatcact gggcattcgc tatctttctt atcgttgcca ttggcctgtg ttgcctgatg 720

ctggtaggcg gttggttttt aggcggtcgc gcacgcgcga ggtcgaaaaa cgtgccgttt 780

gaatccggta tcgactcggt cggctccgcc cgcttacgcc tgtccgccaa gttttatctg 840

gtggccatgt tcttcgttat cttcgacgtt gaagcgctgt atctgttcgc atggtcaacc 900

tctatccgcg aaagcggctg ggtaggcttt gtggaagctg caatttttat ttttgtgtta 960

ctggcaggtc tggtttatct ggtgcgtatt ggcgcgctgg actggacgcc cgcgcgttca 1020

cgccgcgagc gtatgaaccc ggaaacgaac agtatcgcta atcgtcaacg ctaaccgcga 1080

ggcattaaga tggattatac gctcacccgc atagatccca acggtgagaa cgaccgttac 1140

cccctgcaaa agcaggagat cgtaaccgac cctctggagc aagaagttaa caaaaacgtg 1200

tttatgggca agctcaatga catggttaac tggggtcgta aaaactcaat ttggccgtat 1260

aacttcggtc tttcctgctg ttacgttgag atggtgactt cgtttaccgc ggtgcatgac 1320

gtggcgcgtt ttggcgcaga agtattgcgt gcttcgccgc gtcaggctga cctgatggtg 1380

gttgcaggaa cctgctttac caaaatggca ccggttattc agcgtctgta tgaccagatg 1440

ctggaaccaa aatgggttat ctcaatgggt gcctgtgcca actctggtgg tatgtacgat 1500

atttattccg ttgtgcaggg cgtcgataaa ttcatcccgg ttgatgtgta tatcccgggc 1560

tgcccgccgc gtcctgaagc gtacatgcag gcactgatgc tgttgcagga atctatcggc 1620

aaagaacgtc gtccgctctc ctgggtggtt ggcgatcagg gcgtttatcg cgccaatatg 1680

caatcagagc gcgaacgcaa gcgcggtgaa cgcattgccg taactaacct gcgtacacct 1740

gacgagattt aatttgcgcc tgtcggcaaa gggatttttc ttcgcttatt cctaaatcta 1800

tttcgcgaag cttactgcgc cgacagtcac cacggaccat ttgcaatggt gaacaatatg 1860

accgacttaa ccgcgcaaga acccgcctgg cagacccgcg atcatcttga tgatccggtg 1920

attggcgaac tgcgcaaccg ttttgggccg gatgccttta ctgttcaggc gactcgcacc 1980

ggggttcccg ttgtgtggat caagcgtgaa caattactgg aagttggcga tttcttaaag 2040

aaactgccga aaccttacgt catgctgttt gacttacacg gcatggacga acgtctgcgc 2100

acacaccgcg aagggttacc tgccgcggat ttttccgttt tctaccatct gatttctatc 2160

gatcgtaacc gcgacatcat gctgaaggtg gcgctggcag aaaacgacct gcacgtaccg 2220

accttcacca aactgttccc gaacgctaac tggtatgagc gtgaaacctg ggatctgttt 2280

ggcattactt tcgacggtca cccgaacctg cgacgcatca tgatgccgca aacctggaaa 2340

ggtcacccgc tgcgtaaaga ttatccggcg cgcgctaccg aattctcgcc gtttgagctg 2400

accaaagcca aacaggatct ggagatggaa gccctgacct tcaaaccgga agagtggggg 2460

atgaagcgcg gcaccgaaaa cgaggacttc atgttcctca acctcggtcc gaaccacccg 2520

tcggcgcacg gggctttccg tatcgttttg caactcgatg gcgaagagat tgtcgactgc 2580

gtaccagaca tcggttacca ccaccgtggt gcggagaaaa tgggcgaacg ccagtcctgg 2640

cacagctaca ttccgtatac tgaccgtatc gaatacctcg gcggctgcgt taacgaaatg 2700

ccttacgtgc tggcggtaga gaaactggcc gggatcaccg tgccggatcg cgttaacgtc 2760

attcgcgtta tgctctccga actgttccgc atcaacagtc acctgctgta tatctcgacc 2820

tttattcagg acgtcggcgc aatgacgcca gtgttcttcg cctttaccga tcgtcagaaa 2880

atttacgatc tggtggaagc aatcactggt ttccgtatgc acccggcgtg gttccgtatt 2940

ggcggcgtag cgcacgacct gccgcgcggc tgggatcgcc tgctgcgtga gttcctcgac 3000

tggatgccga aacgtctggc gtcttacgag aaagcggcgc tgcaaaacac cattctgaaa 3060

ggtcgttccc agggcgttgc cgcctatggc gcgaaagagg cgctggagtg gggcaccact 3120

ggcgcgggcc tgcgtgctac cgggatcgac ttcgacgtgc gtaaggcgcg tccttattct 3180

ggctatgaaa acttcgactt tgaaatcccg gtgggtggtg gcgtttctga ctgctacacc 3240

cgcgtaatgc ttaaagtgga agagctgcgc cagagtctgc gcattcttga gcagtgcctc 3300

aacaacatgc cggaaggccc gttcaaagcg gatcacccgc tgaccacgcc gccgccgaaa 3360

gagcgcacgc tgcaacatat cgaaaccctg atcacccact tcctgcaagt gtcgtggggt 3420

ccggtgatgc ctgccaatga atctttccag atgattgagg cgaccaaagg gatcaacagt 3480

tactacctga ccagcgacgg cagcaccatg agttaccgca cccgtgttcg taccccgagc 3540

tttgcgcatt tgcagcaaat tccggcggcg atccgcggca gcctggtgtc tgacctgatt 3600

gtttatctgg gcagtatcga ttttgttatg tcagatgtgg accgctaatt atgcacgaga 3660

atcaacaacc acaaaccgag gcttttgagc tgagtgcggc agagcgtgaa gcgatcgagc 3720

acgagatgca ccactacgaa gacccgcgtg cggcgtccat tgaagcgctg aaaatcgttc 3780

agaagcagcg tggctgggtg ccggatggtg cgatccacgc gatcgccgat gtgctgggta 3840

ttccggcaag cgacgtcgaa ggtgtggcaa cgttctacag tcagatcttc cgccagccgg 3900

ttggtcgcca tgtgatccgt tattgtgaca gcgtggtctg tcatatcaac ggttatcagg 3960

gtattcaggc ggcgctcgag aaaaagctga acatcaaacc agggcaaacg acatttgatg 4020

gccgctttac gctgctgcca acttgctgcc tggggaactg tgataaaggg ccaaacatga 4080

tgatcgatga ggacactcac gcgcatctga ccccggaagc gatccctgaa ctgctggagc 4140

ggtataaatg aaaaacatta tccgtactcc cgaaacgcat ccgctgacct ggcgtctgcg 4200

cgatgacaaa cagccagtgt ggctggacga ataccgcagc aaaaacggtt acgaaggcgc 4260

gcgtaaggcg ctgaccgggc tgtctccgga cgaaatcgtt aatcaggtaa aagacgctgg 4320

tctgaaaggg cgcggcggcg cgggcttctc gactggcctg aaatggagcc tgatgccgaa 4380

agacgaatcc atgaacatcc gttacctgct gtgtaatgcc gatgaaatgg agccgggcac 4440

ctataaagac cgcctgttga tggagcaact gccgcacctg ctggtggaag gtatgctcat 4500

ctccgcgttt gcgctgaaag cttaccgtgg ctacatcttc ctgcgtggcg aatatatcga 4560

agcggcagtt aatctgcgcc gtgccattgc cgaagccacc gaagcgggtc tgcttggcaa 4620

aaacattatg ggaacaggtt tcgatttcga actgttcgtc cataccgggg cagggcgcta 4680

catctgcggg gaagaaacag cgttaatcaa ctccctggaa ggacgtcgtg ctaacccacg 4740

ctcgaagcca cccttcccgg caacctccgg cgcatggggt aaaccgacct gtgtcaacaa 4800

cgtcgaaacc ctgtgtaacg ttccggcgat cctcgctaac ggcgtggagt ggtatcagaa 4860

catctcgaaa agtaaagatg ctggcaccaa gctgatgggc ttctccggtc gggtgaaaaa 4920

tccgggactg tgggaactgc cgttcggcac caccgcacgc gagatcctcg aagattacgc 4980

cggtggtatg cgtgatggtc tgaaatttaa agcctggcag ccaggcggcg cggggactga 5040

cttcctgacc gaagcgcacc ttgatctgcc gatggaattc gaaagtatcg gtaaagcggg 5100

cagccgtctg ggtacggcgc tggcgatggc ggttgaccat gagatcaaca tggtgtcgct 5160

ggtgcgtaac ctggaagagt ttttcgcccg tgagtcctgc ggctggtgta cgccgtgccg 5220

cgacggtctg ccgtggagcg tgaaaattct gcgtgcgctg gagcgtggtg aaggtcagcc 5280

gggcgatatc gaaacacttg agcaactgtg tcgattctta ggcccgggta aaactttctg 5340

tgcccacgca cctggtgcag tggagccgtt acagagcgcc atcaaatatt tccgcgaaga 5400

atttgaggcg ggaatcaaac agccgttcag caatacccat ttgattaatg ggattcagcc 5460

gaacctgctg aaagagcgct ggtaaccgaa tttcgattaa cgctcagtct ctgactgaga 5520

aaactggaag catgctaatg gctacaattc atgtagacgg caaagaatac gaggtcaacg 5580

gagcggacaa cctgctggaa gcttgtctgt ctctgggcct tgatattcct tacttttgct 5640

ggcatccggc gctgggaagt gtcggtgctt gccgccagtg tgcggtgaag caataccaaa 5700

acgcggaaga cacgcgtggt cgcctggtga tgtcctgtat gacaccggct tccgatggca 5760

cctttatttc cattgacgac gaagaagcga aacagttccg tgaaagcgtg gtcgagtggt 5820

tgatgaccaa ccacccgcac gactgtccgg tatgtgaaga gggcggtaac tgccatcttc 5880

aggatatgac tgtgatgacc ggacacagct tccgtcgcta ccgtttcacc aaacgtaccc 5940

accgtaatca ggatttgggg ccattcatct ctcacgaaat gaaccgctgc atcgcctgct 6000

accgctgtgt gcgttactac aaagattacg ctgacggtac agatctgggc gtttacggtg 6060

cgcacgacaa cgtctacttc ggtcgcccgg aagacggcac gctggaaagc gaattttccg 6120

gtaacctggt cgaaatttgc ccgaccggcg tatttaccga caaaacgcac tccgagcgtt 6180

acaaccgtaa atgggatatg cagtttgcgc cgagcatctg ccagcaatgt tccatcggct 6240

gtaacatcag ccccggtgaa cgttacggcg aactgcgtcg tatcgaaaac cgttacaacg 6300

gtacggtaaa ccactacttc ctctgcgacc gtggtcgttt cggttacggt tacgtcaacc 6360

tgaaggatcg tccgcgtcag ccagtacagc gtcgtggcga tgatttcatt accctcaacg 6420

ccgaacaggc aatgcagggc gcggcagata ttctgcgtca gtcgaagaaa gtgatcggta 6480

ttggttctcc gcgtgccagc gtggaaagca actttgcgct gcgtgaactg gtgggcgaag 6540

aaaacttcta caccggtatc gctcacggtg agcaggaacg tctgcaactg gcgctgaaag 6600

tgctgcgtga aggcggcatt tatactccgg ctctgcgcga aatcgaatct tacgatgcgg 6660

tactggtgct gggcgaagac gttacccaga ccggcgcgcg cgtcgcgctg gcagtgcgtc 6720

aggctgtgaa aggtaaagcg cgcgaaatgg cggcagcaca gaaagtggct gactggcaga 6780

ttgcggcaat cctcaacatc ggtcaacgtg cgaagcatcc gctgtttgtt accaacgttg 6840

atgacacccg tctggatgat atcgcggcgt ggacttaccg cgcaccggtt gaagatcagg 6900

cgcgtttagg ttttgccatc gcccatgcgc tggataactc tgcaccagcg gttgacggta 6960

tcgaacctga gctgcaaagc aaaatcgacg tcatcgtgca ggcactggca ggtgcgaaga 7020

aaccgttgat tatctccggg acgaacgccg gtagcttaga ggtgattcag gcggcggcta 7080

acgtcgcgaa agccctgaaa ggtcgcggcg ctgacgtcgg tatcaccatg attgcccgtt 7140

ccgtcaacag catggggctg ggcattatgg gtggcggttc gcttgaagaa gcgttaaccg 7200

aactggaaac cggacgcgcc gacgcggtgg tggtgttgga aaacgatctg catcgtcacg 7260

cttctgctat ccgcgtgaat gctgcgctgg ctaaagcacc gctggtgatg gtggttgatc 7320

atcaacgcac agcgattatg gaaaacgccc atctggtact ttctgctgcc agctttgctg 7380

aaagcgacgg tacggtgatc aacaacgaag gccgcgccca acgtttcttc caggtttacg 7440

atcctgctta ttacgacagc aaaactgtca tgctggaaag ctggcgctgg ttacactcgc 7500

tgcacagcac cctgctgagc cgtgaagtgg actggacgca gctcgaccat gtgattgacg 7560

ctgttgtggc gaaaatcccg gaactggcag gtatcaaaga tgctgcgccg gatgcgacat 7620

tccgtattcg tgggcagaaa ctggcccgtg aaccgcaccg ttacagcggt cgtaccgcca 7680

tgcgcgccaa tatcagcgtt catgagccgc gtcagccgca ggatattgac accatgttca 7740

ccttctcgat ggaaggtaac aaccagccga ctgcgcaccg ttcgcaagtg ccgtttgcct 7800

gggcgccggg ctggaactcc ccgcaggcgt ggaacaaatt ccaggacgaa gtgggcggca 7860

aactgcgctt tggcgatccg ggcgtgcgtc tgtttgaaac cagcgaaaat ggtctggatt 7920

acttcaccag cgtaccggca cgcttccagc cgcaggacgg gaaatggcgt atcgcgccgt 7980

attaccacct gtttggcagc gatgaattgt cacagcgtgc tccggtcttc cagagccgta 8040

tgccgcagcc gtacatcaaa ctcaacccag cggatgccgc gaagttgggt gtgaacgcag 8100

gtacacgcgt ctcctttagt tacgatggca acacggtcac gctgccggtt gaaatcgccg 8160

aaggactgac ggcagggcag gtgggcttgc cgatgggtat gtccggcatt gctccggtgc 8220

tggctggcgc gcatcttgag gatctcaagg aggcacaaca atgagttgga tatcaccgga 8280

actgattgag atcctgctga ccatcctcaa agcggtggtg atcctgctgg tggttgtcac 8340

ctgcggggca ttcatgagct ttggcgaacg tcgcctgctg ggtctgttcc agaaccgtta 8400

cggacctaac cgtgttggct ggggcggttc gctccagctg gttgcggaca tgatcaaaat 8460

gttctttaaa gaagactgga tcccgaaatt ctcggatcgc gtcatcttta ccctggcacc 8520

gatgattgcc tttacctcgc tgctgctggc ctttgcgatt gtgccagtca gtccgggttg 8580

ggtggttgcc gacctgaaca tcgggatttt gttcttcctg atgatggcag gtctggcggt 8640

ttacgcggtg ctgtttgcgg gctggtcaag taacaacaaa tactcgttgc tgggtgcgat 8700

gcgtgcttct gcgcagaccc tgagctacga agtgttcctc gggctttcct tgatgggcgt 8760

ggtggcgcag gccggttcat tcaacatgac cgacatcgtc aacagccagg cgcatgtgtg 8820

gaacgttatc ccgcaattct ttggttttat tacctttgcc atcgcgggcg tggcggtatg 8880

tcaccgtcac ccgtttgacc agccggaagc cgagcaggaa ctggcggatg gttaccacat 8940

tgaatattcc ggtatgaagt tcggtctgtt cttcgtgggt gagtacatcg ggattgtgac 9000

catctctgca ttgatggtga cgctgttctt cggtggctgg caaggcccgt tgttaccgcc 9060

attcatctgg ttcgcgctga aaaccgcgtt ctttatgatg atgttcattt tgattcgtgc 9120

gtcgttaccg cgtccgcgtt atgaccaggt aatgtccttc ggctggaaaa tctgcctgcc 9180

gctgacgctg atcaacttgc tggtaacggc ggctgtcatt ctctggcagg cgcaataagg 9240

ggcaataaga ccatgacctt aaaagaattg ttagtaggtt tcggcaccca ggttcgtagt 9300

atctggatga tcggcctgca cgcgttcgcc aaacgcgaaa cgcgaatgta cccggaagag 9360

ccggtctatc tgccgccccg ttatcgtggt cgtatcgttc tgacccgcga cccggacggc 9420

gaagagcgtt gcgtagcctg taacctctgc gcggtagcct gcccggtcgg ctgtatctcg 9480

ctgcaaaaag cagaaaccaa agacggtcgc tggtacccgg aatttttccg catcaacttc 9540

tcacgctgca ttttctgtgg tctgtgcgaa gaagcctgtc cgaccacggc gattcagtta 9600

accccggatt tcgaaatggg ggaatacaag cgccaggatc tggtttacga gaaagaggat 9660

ctgctgatct ccggtccggg caaatacccg gaatataact tctaccggat ggcaggtatg 9720

gcaatcgacg gcaaagataa gggcgaagca gagaacgaag ccaagcctat cgacgtcaag 9780

agcctgttac cgtaaggaga ggggcaatgg agttcgcttt ttatatctgt ggcctgatag 9840

ccatacttgc gaccttgcga gtgatcaccc ataccaatcc ggtacacgca ctgctgtacc 9900

tgattatttc gctgctggcg atttccgggg tgttcttctc actgggcgct tacttcgccg 9960

gtgcgctgga aattatcgtc tacgcgggtg ccattatggt gctgttcgtg ttcgtggtga 10020

tgatgctcaa cctgggcggt tcagaaatcg aacaggaacg ccagtggctg aaaccgcagg 10080

tgtggattgg tccggcaatt ttgtcggcca tcatgctggt ggtgattgtt tacgccatcc 10140

tcggtgttaa cgatcagggt atcgacggta cgccaatcag tgctaaagca gtgggtatta 10200

cgctgttcgg gccttacgta ctggcggtgg aactggcttc tatgctgctg ctcgcaggtc 10260

tggttgtggc cttccacgtc ggtcgtgaag agcgtgcggg tgaagtgctg agcaatcgta 10320

aagacgacag cgcgaaaaga aaaacggagg agcacgcatg atccccttac aacatggact 10380

gatcctcgcg gcaatcttat tcgttcttgg cttaaccggt ctggttatcc gtcgcaatct 10440

gctgtttatg ttgattggtc tggaaatcat gattaacgcc tccgcgctgg ccttcgtggt 10500

cgccggaagc tactggggcc agaccgacgg tcaggtgatg tacattctcg ccatcagcct 10560

cgcggcggca gaagcgagta tcggccttgc gctgctgctg caacttcacc gtcgtcgcca 10620

gaacctgaac atcgattcag taagtgagat gcgcggatga acatgcttgc cttaaccatt 10680

attttgccat tgattggctt cgtcctgctg gcattctccc gtgggcgctg gtctgaaaac 10740

gtctcggcga tcgtcggcgt aggctctgtg ggcctggcgg cgctggtaac cgcctttatc 10800

ggcgttgatt tcttcgctaa cggcgagcag acatacagcc agccgctgtg gacgtggatg 10860

tcggtaggcg actttaacat cggttttaac ctggtgctgg acggcctgtc gctgaccatg 10920

ctctcggtgg tcactggtgt gggtttcctt attcacatgt acgcctcctg gtatatgcgc 10980

ggtgaagagg gctactctcg cttcttcgct tacaccaacc tgttcatcgc cagcatggtg 11040

gttctggtgc ttgccgacaa cctgctgctg atgtacctcg gctgggaagg cgtgggcctg 11100

tgctcctatc tgctgatcgg gttctattac accgatccga agaatggcgc agcggcaatg 11160

aaagcgttcg tcgtgacccg tgtgggtgac gtgttcctcg ctttcgcact gttcattctt 11220

tacaacgaac tgggcaccct gaacttccgc gaaatggtgg aactggcacc agcgcacttt 11280

gctgacggca ataacatgct gatgtgggcg acgctgatgc tgctgggcgg tgcggtcggt 11340

aaatctgcgc agttgccgtt gcagacatgg cttgccgacg cgatggcggg cccgacgcct 11400

gtctccgcgc tgatccacgc cgcaaccatg gtaaccgcgg gtgtctacct gatcgcccgt 11460

acccacggcc tgttcctgat gacgccggaa gttctgcatc tggtgggtat tgtcggggcg 11520

gttacgctgc tgctggccgg ttttgccgcg ctggtacaga ccgacatcaa acgtgttctc 11580

gcttactcta ccatgagcca gattggctac atgttcctcg cgcttggcgt gcaggcatgg 11640

gatgcggcga ttttccactt gatgacccac gcgttcttta aagcgctgct gttcctggca 11700

tccggttccg tcattctggc ctgccatcac gaacagaaca tcttcaagat gggcggtctg 11760

cgtaaatcta ttccgctggt ttatctctgc ttcctggtgg gcggcgcagc actgtcggca 11820

ctaccgctgg tcactgcggg cttcttcagt aaggatgaga tcctcgcggg tgcgatggcg 11880

aatggtcata tcaatctgat ggtggcaggt ctggtcggtg cgtttatgac ctcgctctac 11940

accttccgta tgattttcat cgtcttccac ggaaaagaac aaattcacgc tcacgccgtg 12000

aaaggggtaa ctcacagcct gccgctgatt gtgctgctga tcctttccac cttcgttggc 12060

gcactgattg taccgccgct gcagggcgtg cttccgcaaa cgacggaact ggcgcacggc 12120

agcatgttga ccctggaaat tacctctggc gtggtcgcgg tggtcggcat tctgctggca 12180

gcctggctgt ggctgggtaa acgtactctg gtgacctcca tcgccaacag tgcgccgggc 12240

cgtctgctgg gcacctggtg gtacaacgcc tggggatttg actggctgta tgacaaagtg 12300

ttcgtcaagc cgttcctggg tattgcctgg ttgctgaaac gcgatccgct gaactcaatg 12360

atgaacatcc cggctgtcct ttcccgcttt gcaggtaaag gtctgctgtt aagtgagaac 12420

ggctatctgc gctggtatgt ggcatccatg agcatcggtg cggtcgtggt gctggcactg 12480

ttgatggtac tgcgttgagt taaggattgt gggattgccc ctgggcatat aagaacgtag 12540

gtcggataag ccgccttcgc ggtgcatccg acactacccc cagtccgaag agaattttct 12600

gtcgtgagaa ttcgttgaaa atccggtcct gacgggactt ttacaaggaa taaagatcgc 12660

catgttacta ccctggctaa tattaattcc ctttattggc ggcttcctgt gctggcagac 12720

cgaacgcttt ggcgtcaagg tgccacgctg gatcgcgctg atcaccatgg gattgacgct 12780

ggcgctgtcg ctgcaactgt ggttgcaggg cggttattca ctgacgcaat ccgccggaat 12840

tccgcagtgg cagtctgaat tcgacatgcc gtggatcccg cgttttggta tctctattca 12900

tctcgccatt gacgggctgt cgctgctgat ggtcgtgctg accggtctgc tcggtgtgct 12960

ggcggtacta tgttcgtgga aagagatcga aaaatatcag ggcttcttcc acctcaacct 13020

gatgtggatc ctgggcggcg ttatcggcgt gttccttgcc atcgacatgt tcctgttctt 13080

cttcttctgg gaaatgatgc tggtgccgat gtacttcctg atcgcactgt gggggcataa 13140

agcctctgac ggtaaaacgc gtatcacggc ggcaaccaag ttcttcattt acacccaggc 13200

gagtggcctg gtgatgttga ttgccatcct ggcgctggtt tttgttcact acaatgcgac 13260

cggcgtctgg accttcaact atgaagagct gctgaatacg ccaatgtcca gtggtgtgga 13320

atacctgtta atgctgggct tcttcatcgc cttcgcagtc aaaatgccgg tggttccgct 13380

gcatggctgg ctgccggatg cgcactccca ggctccgacc gccggttccg ttgacctcgc 13440

ggggatcttg ctgaaaactg ccgcttacgg tttgctgcgt ttctccctgc cgctgttccc 13500

gaacgcgtcg gcagagttcg cgccaattgc tatgtggctg ggtgttatcg gcatcttcta 13560

cggtgcgtgg atggccttcg cccagaccga tatcaaacgt ctgatcgcct acacctcggt 13620

ttcccacatg ggcttcgtgc tgattgctat ctacaccggc agccagttgg cctaccaggg 13680

cgcggtaatc cagatgattg cgcacggttt gtcggcggcg ggtctgttta ttctttgtgg 13740

tcagctttat gaacgtatcc atacccgcga catgcgcatg atgggcggtc tgtggagcaa 13800

gatgaaatgg ctgccagcac tgtcgctgtt ctttgcggtg gcaacgcttg ggatgcctgg 13860

caccggtaac ttcgtcggcg aatttatgat tctgttcggc agcttccagg ttgtaccggt 13920

gattaccgtt atctctacct ttgggctggt ctttgcatct gtttattcgc tggcgatgtt 13980

acatcgcgct tacttcggta aagcgaaaag ccagattgcc agccaggaac tgccagggat 14040

gtcgctgcgt gagctgttta tgatcctgtt gctggtggtg ctgctggtac tgctgggctt 14100

ctatccgcag ccgattctgg atacctcgca ctccgcgatt ggcaatatcc agcagtggtt 14160

tgttaattcc gttactacta caaggccgta aatcgccatg acaataactc cacaaaacct 14220

gatcgcactg ctaccgttgc tgatcgtcgg cttgacggtg gtggttgtga tgctctccat 14280

tgcgtggcga cgcaatcatt tcctcaacgc tacgctctcg gttattgggc ttaacgcggc 14340

gctggtttcg ctctggtttg ttggccaggc gggcgctatg gacgttacgc cgctgatgcg 14400

cgttgatggt ttcgccatgc tttacaccgg gctggtattg ttggcgagcc tcgccacctg 14460

tactttcgcc tacccgtggc ttgaaggcta taacgacaac aaggatgagt tctacctgtt 14520

ggtgttaatt gccgcgctgg gcgggatcct gctggcgaat gccaaccatc tggcgtctct 14580

gttcctcggt atcgaactga tctctttgcc gctgtttggc ctggtcggtt acgctttccg 14640

ccagaaacgt tcactggaag ccagtatcaa atacaccatc ctttctgccg cagcgtcttc 14700

tttcctgctg tttggtatgg cgctggtgta tgcgcagtct ggcgacctgt cgtttgtcgc 14760

gttgggtaaa aaccttggcg acggtatgct caacgagccg ctgttgctgg caggtttcgg 14820

cctgatgatt gttggcctcg gcttcaaact ctctctggtg ccgttccacc tgtggacgcc 14880

agacgtatac cagggcgcgc ctgcgccggt ttccactttc ctggcgacgg cgagcaaaat 14940

cgctatcttc ggtgtggtga tgcgtctgtt cctctacgca ccggtgggtg acagcgaagc 15000

gattcgcgtg gtgctggcga ttatcgcctt tgcctccatc atcttcggta acctgatggc 15060

gctgagccag accaatatca aacgtctgct cggttactca tctatctctc acctcggcta 15120

tctgctggta gcgctgattg cgctgcaaac cggcgagatg tcgatggaag cggtaggggt 15180

ttacctggcc ggttatctgt tcagcagcct cggcgcgttc ggcgtggtca gcctgatgtc 15240

cagcccgtat cgtggcccgg atgctgattc cctgttctct taccgcggtc tgttctggca 15300

tcgtccgatc ctcgcggcag tgatgacggt gatgatgctg tctctggccg gtatcccgat 15360

gacgctgggc tttatcggta agttctacgt gctggcggtc ggtgtccagg cacacttgtg 15420

gtggctggtg ggtgccgtgg ttgtcggttc ggcaatcggc ctctactact acctgcgcgt 15480

ggcggtgagc ctgtatcttc acgccccgga acaaccgggt cgcgatgcac catcaaactg 15540

gcagtacagc gcgggcggta tcgttgtgct gatctctgca ctgttggtac tggtgctggg 15600

tgtatggcca caaccgctga ttagcattgt gcgtttggca atgccgctga tgtaa 15655

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SerB

<400> 2

Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp

1 5 10 15

Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp

20 25 30

Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp

35 40 45

Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val

50 55 60

Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala

65 70 75 80

Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu

100 105 110

Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp

115 120 125

Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser

145 150 155 160

Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val

165 170 175

Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys

180 185 190

Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr

195 200 205

Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val

210 215 220

Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile

225 230 235 240

Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu

245 250 255

Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp

260 265 270

Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala

275 280 285

Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg

290 295 300

His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn

305 310 315 320

Gln Lys

<210> 3

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serB

<400> 3

atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60

ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120

ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180

gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240

ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300

ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360

gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420

gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480

cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540

ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600

gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660

accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720

ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780

gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840

aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900

gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960

cagaagtaa 969

<210> 4

<211> 405

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YhhS

<400> 4

Met Pro Glu Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Asn Gly Leu Arg Leu Asn

1 5 10 15

Leu Arg Ile Val Ser Ile Val Met Phe Asn Phe Ala Ser Tyr Leu Thr

20 25 30

Ile Gly Leu Pro Leu Ala Val Leu Pro Gly Tyr Val His Asp Val Met

35 40 45

Gly Phe Ser Ala Phe Trp Ala Gly Leu Val Ile Ser Leu Gln Tyr Phe

50 55 60

Ala Thr Leu Leu Ser Arg Pro His Ala Gly Arg Tyr Ala Asp Ser Leu

65 70 75 80

Gly Pro Lys Lys Ile Val Val Phe Gly Leu Cys Gly Cys Phe Leu Ser

85 90 95

Gly Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Ala Ser Leu Pro Val Ile

100 105 110

Ser Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Ile Leu Gly Ile Gly Gln

115 120 125

Ser Phe Ala Gly Thr Gly Ser Thr Leu Trp Gly Val Gly Val Val Gly

130 135 140

Ser Leu His Ile Gly Arg Val Ile Ser Trp Asn Gly Ile Val Thr Tyr

145 150 155 160

Gly Ala Met Ala Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Val Phe Tyr His Trp

165 170 175

Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ile Ile Met Gly Val Ala Leu Val

180 185 190

Ala Ile Leu Leu Ala Ile Pro Arg Pro Thr Val Lys Ala Ser Lys Gly

195 200 205

Lys Pro Leu Pro Phe Arg Ala Val Leu Gly Arg Val Trp Leu Tyr Gly

210 215 220

Met Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe

225 230 235 240

Ile Thr Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Gly Trp Asp Gly Ala Ala Phe Ala

245 250 255

Leu Thr Leu Phe Ser Cys Ala Phe Val Gly Thr Arg Leu Leu Phe Pro

260 265 270

Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Gly Leu Asn Val Ala Met Ile Cys Phe

275 280 285

Ser Val Glu Ile Ile Gly Leu Leu Leu Val Gly Val Ala Thr Met Pro

290 295 300

Trp Met Ala Lys Ile Gly Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Phe Ser Leu

305 310 315 320

Val Phe Pro Ala Leu Gly Val Val Ala Val Lys Ala Val Pro Gln Gln

325 330 335

Asn Gln Gly Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Val Phe Met Asp Leu Ser

340 345 350

Leu Gly Val Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Ser Trp Ala Gly

355 360 365

Val Pro Val Ile Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Leu

370 375 380

Leu Leu Thr Trp Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Glu His Val Pro Glu

385 390 395 400

Ala Ala Ser Ser Ser

405

<210> 5

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS

<400> 5

atgcccgaac ccgtagccga acccgcgcta aacggattgc gcctgaattt gcgcattgtc 60

tctatagtca tgtttaactt cgccagctac ctcaccatcg ggttgccgct cgctgtatta 120

ccgggctatg tccatgatgt gatgggcttt agcgccttct gggcaggatt ggttatcagc 180

ctgcaatatt tcgccacctt gctgagccgc cctcatgccg gacgttacgc cgattcgctg 240

ggacccaaaa agattgtcgt cttcggttta tgcggctgct ttttgagcgg tctggggtat 300

ctgacggcag gattaaccgc cagtctgcct gtcatcagcc tgttattact ttgcctgggg 360

cgcgtcatcc ttgggattgg gcaaagtttt gccggaacgg gatcgaccct atggggcgtt 420

ggcgtggttg gctcgctgca tatcgggcgg gtgatttcgt ggaacggcat tgtcacttac 480

ggggcgatgg cgatgggtgc gccgttaggc gtcgtgtttt atcactgggg cggcttgcag 540

gcgttagcgt taatcattat gggcgtggcg ctggtggcca ttttgttggc gatcccgcgt 600

ccgacggtaa aagccagtaa aggcaaaccg ctgccgtttc gcgcggtgct tgggcgcgtc 660

tggctgtacg gtatggcgct ggcactggct tccgccggat ttggcgtcat cgccaccttt 720

atcacgctgt tttatgacgc taaaggttgg gacggtgcgg ctttcgcgct gacgctgttt 780

agctgtgcgt ttgtcggtac gcgtttgtta ttccctaacg gcattaaccg tatcggtggc 840

ttaaacgtag cgatgatttg ctttagcgtt gagataatcg gcctgctact ggttggcgtg 900

gcgactatgc cgtggatggc gaaaatcggc gtcttactgg cgggggccgg gttttcgctg 960

gtgttcccgg cattgggtgt agtggcggta aaagcggttc cgcagcaaaa tcagggggcg 1020

gcgctggcaa cttacaccgt atttatggat ttatcgcttg gcgtgactgg accactggct 1080

gggctggtga tgagctgggc gggcgtaccg gtgatttatc tggcggcggc gggactggtc 1140

gcaatcgcgt tattactgac gtggcgatta aaaaaacggc ctccggaaca cgtccctgag 1200

gccgcctcat catcttaa 1218

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS UP F

<400> 6

ctgcaggaat tcgatgaagg taaccacttt ttccg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS UP R

<400> 7

gagttgcagc aagcggagga tcaccacatt tttac 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc F

<400> 8

aatgtggtga tcctccgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc R

<400> 9

tacgggttcg ggcatgatag ctctcctgtg tgaaa 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS Down F

<400> 10

cacaggagag ctatcatgcc cgaacccgta gccga 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS Down R

<400> 11

gtcgactagc gtgatagcgg tttgccttta ctggc 35

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhSP Conf F

<400> 12

agttgagcaa aaacgccagt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhSP Conf R

<400> 13

gccataccgt acagccagac 20

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UP F1

<400> 14

ctgcaggaat tcgatcaacc accagagatt cacgt 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UP R1

<400> 15

gcttcctgac tccagtgctt actcatcaaa agtag 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Prmf F

<400> 16

tttgatgagt aagcactgga gtcaggaagc cgctt 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Prmf R

<400> 17

tgttgacata ctcatgcctc gtttccctca tactg 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Down F1

<400> 18

tgagggaaac gaggcatgag tatgtcaaca tccac 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Down R1

<400> 19

acggtgagaa cgaccgttac atcacgctag tcgac 35

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UP R2

<400> 20

tcatttttct tcagctgctt actcatcaaa agtag 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pidi F

<400> 21

tttgatgagt aagcagctga agaaaaatga gcatg 35

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pidi R

<400> 22

tgttgacata ctcataattt ctcacatgta attctgatc 39

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Down F2

<400> 23

tacatgtgag aaattatgag tatgtcaaca tccac 35

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoP Conf F

<400> 24

gagagctacc ataatccgtg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoP Conf R

<400> 25

catctcaacg taacagcagg 20

<210> 26

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoA

<400> 26

Met Ser Met Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Ala His His Trp Ala Phe

1 5 10 15

Ala Ile Phe Leu Ile Val Ala Ile Gly Leu Cys Cys Leu Met Leu Val

20 25 30

Gly Gly Trp Phe Leu Gly Gly Arg Ala Arg Ala Arg Ser Lys Asn Val

35 40 45

Pro Phe Glu Ser Gly Ile Asp Ser Val Gly Ser Ala Arg Leu Arg Leu

50 55 60

Ser Ala Lys Phe Tyr Leu Val Ala Met Phe Phe Val Ile Phe Asp Val

65 70 75 80

Glu Ala Leu Tyr Leu Phe Ala Trp Ser Thr Ser Ile Arg Glu Ser Gly

85 90 95

Trp Val Gly Phe Val Glu Ala Ala Ile Phe Ile Phe Val Leu Leu Ala

100 105 110

Gly Leu Val Tyr Leu Val Arg Ile Gly Ala Leu Asp Trp Thr Pro Ala

115 120 125

Arg Ser Arg Arg Glu Arg Met Asn Pro Glu Thr Asn Ser Ile Ala Asn

130 135 140

Arg Gln Arg

145

<210> 27

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoB

<400> 27

Met Asp Tyr Thr Leu Thr Arg Ile Asp Pro Asn Gly Glu Asn Asp Arg

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Gln Lys Gln Glu Ile Val Thr Asp Pro Leu Glu Gln Glu

20 25 30

Val Asn Lys Asn Val Phe Met Gly Lys Leu Asn Asp Met Val Asn Trp

35 40 45

Gly Arg Lys Asn Ser Ile Trp Pro Tyr Asn Phe Gly Leu Ser Cys Cys

50 55 60

Tyr Val Glu Met Val Thr Ser Phe Thr Ala Val His Asp Val Ala Arg

65 70 75 80

Phe Gly Ala Glu Val Leu Arg Ala Ser Pro Arg Gln Ala Asp Leu Met

85 90 95

Val Val Ala Gly Thr Cys Phe Thr Lys Met Ala Pro Val Ile Gln Arg

100 105 110

Leu Tyr Asp Gln Met Leu Glu Pro Lys Trp Val Ile Ser Met Gly Ala

115 120 125

Cys Ala Asn Ser Gly Gly Met Tyr Asp Ile Tyr Ser Val Val Gln Gly

130 135 140

Val Asp Lys Phe Ile Pro Val Asp Val Tyr Ile Pro Gly Cys Pro Pro

145 150 155 160

Arg Pro Glu Ala Tyr Met Gln Ala Leu Met Leu Leu Gln Glu Ser Ile

165 170 175

Gly Lys Glu Arg Arg Pro Leu Ser Trp Val Val Gly Asp Gln Gly Val

180 185 190

Tyr Arg Ala Asn Met Gln Ser Glu Arg Glu Arg Lys Arg Gly Glu Arg

195 200 205

Ile Ala Val Thr Asn Leu Arg Thr Pro Asp Glu Ile

210 215 220

<210> 28

<211> 600

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoC

<400> 28

Met Val Asn Asn Met Thr Asp Leu Thr Ala Gln Glu Pro Ala Trp Gln

1 5 10 15

Thr Arg Asp His Leu Asp Asp Pro Val Ile Gly Glu Leu Arg Asn Arg

20 25 30

Phe Gly Pro Asp Ala Phe Thr Val Gln Ala Thr Arg Thr Gly Val Pro

35 40 45

Val Val Trp Ile Lys Arg Glu Gln Leu Leu Glu Val Gly Asp Phe Leu

50 55 60

Lys Lys Leu Pro Lys Pro Tyr Val Met Leu Phe Asp Leu His Gly Met

65 70 75 80

Asp Glu Arg Leu Arg Thr His Arg Glu Gly Leu Pro Ala Ala Asp Phe

85 90 95

Ser Val Phe Tyr His Leu Ile Ser Ile Asp Arg Asn Arg Asp Ile Met

100 105 110

Leu Lys Val Ala Leu Ala Glu Asn Asp Leu His Val Pro Thr Phe Thr

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Asn Ala Asn Trp Tyr Glu Arg Glu Thr Trp Asp Leu

130 135 140

Phe Gly Ile Thr Phe Asp Gly His Pro Asn Leu Arg Arg Ile Met Met

145 150 155 160

Pro Gln Thr Trp Lys Gly His Pro Leu Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Arg

165 170 175

Ala Thr Glu Phe Ser Pro Phe Glu Leu Thr Lys Ala Lys Gln Asp Leu

180 185 190

Glu Met Glu Ala Leu Thr Phe Lys Pro Glu Glu Trp Gly Met Lys Arg

195 200 205

Gly Thr Glu Asn Glu Asp Phe Met Phe Leu Asn Leu Gly Pro Asn His

210 215 220

Pro Ser Ala His Gly Ala Phe Arg Ile Val Leu Gln Leu Asp Gly Glu

225 230 235 240

Glu Ile Val Asp Cys Val Pro Asp Ile Gly Tyr His His Arg Gly Ala

245 250 255

Glu Lys Met Gly Glu Arg Gln Ser Trp His Ser Tyr Ile Pro Tyr Thr

260 265 270

Asp Arg Ile Glu Tyr Leu Gly Gly Cys Val Asn Glu Met Pro Tyr Val

275 280 285

Leu Ala Val Glu Lys Leu Ala Gly Ile Thr Val Pro Asp Arg Val Asn

290 295 300

Val Ile Arg Val Met Leu Ser Glu Leu Phe Arg Ile Asn Ser His Leu

305 310 315 320

Leu Tyr Ile Ser Thr Phe Ile Gln Asp Val Gly Ala Met Thr Pro Val

325 330 335

Phe Phe Ala Phe Thr Asp Arg Gln Lys Ile Tyr Asp Leu Val Glu Ala

340 345 350

Ile Thr Gly Phe Arg Met His Pro Ala Trp Phe Arg Ile Gly Gly Val

355 360 365

Ala His Asp Leu Pro Arg Gly Trp Asp Arg Leu Leu Arg Glu Phe Leu

370 375 380

Asp Trp Met Pro Lys Arg Leu Ala Ser Tyr Glu Lys Ala Ala Leu Gln

385 390 395 400

Asn Thr Ile Leu Lys Gly Arg Ser Gln Gly Val Ala Ala Tyr Gly Ala

405 410 415

Lys Glu Ala Leu Glu Trp Gly Thr Thr Gly Ala Gly Leu Arg Ala Thr

420 425 430

Gly Ile Asp Phe Asp Val Arg Lys Ala Arg Pro Tyr Ser Gly Tyr Glu

435 440 445

Asn Phe Asp Phe Glu Ile Pro Val Gly Gly Gly Val Ser Asp Cys Tyr

450 455 460

Thr Arg Val Met Leu Lys Val Glu Glu Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ile

465 470 475 480

Leu Glu Gln Cys Leu Asn Asn Met Pro Glu Gly Pro Phe Lys Ala Asp

485 490 495

His Pro Leu Thr Thr Pro Pro Pro Lys Glu Arg Thr Leu Gln His Ile

500 505 510

Glu Thr Leu Ile Thr His Phe Leu Gln Val Ser Trp Gly Pro Val Met

515 520 525

Pro Ala Asn Glu Ser Phe Gln Met Ile Glu Ala Thr Lys Gly Ile Asn

530 535 540

Ser Tyr Tyr Leu Thr Ser Asp Gly Ser Thr Met Ser Tyr Arg Thr Arg

545 550 555 560

Val Arg Thr Pro Ser Phe Ala His Leu Gln Gln Ile Pro Ala Ala Ile

565 570 575

Arg Gly Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile Val Tyr Leu Gly Ser Ile Asp

580 585 590

Phe Val Met Ser Asp Val Asp Arg

595 600

<210> 29

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoE

<400> 29

Met His Glu Asn Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Phe Glu Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Glu Arg Glu Ala Ile Glu His Glu Met His His Tyr Glu Asp Pro

20 25 30

Arg Ala Ala Ser Ile Glu Ala Leu Lys Ile Val Gln Lys Gln Arg Gly

35 40 45

Trp Val Pro Asp Gly Ala Ile His Ala Ile Ala Asp Val Leu Gly Ile

50 55 60

Pro Ala Ser Asp Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Tyr Ser Gln Ile Phe

65 70 75 80

Arg Gln Pro Val Gly Arg His Val Ile Arg Tyr Cys Asp Ser Val Val

85 90 95

Cys His Ile Asn Gly Tyr Gln Gly Ile Gln Ala Ala Leu Glu Lys Lys

100 105 110

Leu Asn Ile Lys Pro Gly Gln Thr Thr Phe Asp Gly Arg Phe Thr Leu

115 120 125

Leu Pro Thr Cys Cys Leu Gly Asn Cys Asp Lys Gly Pro Asn Met Met

130 135 140

Ile Asp Glu Asp Thr His Ala His Leu Thr Pro Glu Ala Ile Pro Glu

145 150 155 160

Leu Leu Glu Arg Tyr Lys

165

<210> 30

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoF

<400> 30

Met Lys Asn Ile Ile Arg Thr Pro Glu Thr His Pro Leu Thr Trp Arg

1 5 10 15

Leu Arg Asp Asp Lys Gln Pro Val Trp Leu Asp Glu Tyr Arg Ser Lys

20 25 30

Asn Gly Tyr Glu Gly Ala Arg Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Glu Ile Val Asn Gln Val Lys Asp Ala Gly Leu Lys Gly Arg Gly Gly

50 55 60

Ala Gly Phe Ser Thr Gly Leu Lys Trp Ser Leu Met Pro Lys Asp Glu

65 70 75 80

Ser Met Asn Ile Arg Tyr Leu Leu Cys Asn Ala Asp Glu Met Glu Pro

85 90 95

Gly Thr Tyr Lys Asp Arg Leu Leu Met Glu Gln Leu Pro His Leu Leu

100 105 110

Val Glu Gly Met Leu Ile Ser Ala Phe Ala Leu Lys Ala Tyr Arg Gly

115 120 125

Tyr Ile Phe Leu Arg Gly Glu Tyr Ile Glu Ala Ala Val Asn Leu Arg

130 135 140

Arg Ala Ile Ala Glu Ala Thr Glu Ala Gly Leu Leu Gly Lys Asn Ile

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<212> PRT

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<220>

<223> NuoG

<400> 31

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Arg Tyr Tyr Lys Asp Tyr Ala Asp Gly Thr Asp Leu Gly Val Tyr Gly

165 170 175

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210 215 220

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Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Glu Leu Arg Arg Ile Glu Asn Arg Tyr Asn

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305 310 315 320

Arg Ala Ser Val Glu Ser Asn Phe Ala Leu Arg Glu Leu Val Gly Glu

325 330 335

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Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ile Gly Gln Arg Ala Lys His Pro Leu Phe

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Leu Pro Arg Pro Arg Tyr Asp Gln Val Met Ser Phe Gly Trp Lys Ile

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Leu Trp Gln Ala Gln

325

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoJ

<400> 34

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoK

<400> 35

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> NuoL

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<210> 37

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoM

<400> 37

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NuoN

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100 105 110

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115 120 125

Leu Gly Lys Asn Leu Gly Asp Gly Met Leu Asn Glu Pro Leu Leu Leu

130 135 140

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165 170 175

Pro Val Ser Thr Phe Leu Ala Thr Ala Ser Lys Ile Ala Ile Phe Gly

180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

Ser Ser Ile Ser His Leu Gly Tyr Leu Leu Val Ala Leu Ile Ala Leu

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275 280 285

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305 310 315 320

Leu Ser Leu Ala Gly Ile Pro Met Thr Leu Gly Phe Ile Gly Lys Phe

325 330 335

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<212> DNA

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<220>

<223> pSKH130

<400> 39

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agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 240

cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 300

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ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 420

caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 480

aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 540

gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 600

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atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 720

tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 780

ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg 840

gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc 900

ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca 960

cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga 1020

ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg cagacctcag cgctcaaaga 1080

tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca tccggcagtt caacagatcg 1140

ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt gatgtcattc tggtgaagaa 1200

gctcgaccgt cttggccgcg acaccgccga catgatccaa ctgataaaag agtttgatgc 1260

tcagggtgta gcggttcggt ttattgacga cgggatcagt accgacggtg atatggggca 1320

aatggtggtc accgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt 1380

ggcggccgct ctagacttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1440

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgctagagga tcgatccttt 1500

ttaacccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgatat 1560

tttctgaatt gtgattaaaa aggcaacttt atgcccatgc aacagaaact ataaaaaata 1620

cagagaatga aaagaaacag atagattttt tagttcttta ggcccgtagt ctgcaaatcc 1680

ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc aaacgagagt 1740

ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa gcaggcaaga 1800

cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat attttaggtc 1860

tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga agaagcagac 1920

cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 1980

aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg 2040

cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat attacacgcc 2100

atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt cctgaattcg 2160

attcgtccac aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc 2220

cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat 2280

tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat caaaaagtcg 2340

gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat 2400

tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat 2460

ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa cattacggca 2520

aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct ttgaacatca 2580

acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac 2640

agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc 2700

actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact ggaactgaag 2760

atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat 2820

tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag 2880

caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga 2940

aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa 3000

tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca 3060

ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact ggcccataca 3120

agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct 3180

ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct 3240

atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcca agcttcctgc 3300

tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa caaggacaat 3360

taacagttaa caaataaaaa cgcaaaagaa aatgccgatg ggtaccgagc gaaatgaccg 3420

accaagcgac gcccaacctg ccatcggatc ccccgggctg caggaattcg atatcacgct 3480

agtcgaccta gctagcatat ggggagatct actagtaaag catgccaatt ggtattctat 3540

agtgtcacct aaatcgtatg tgtatgatac ataaggttat gtattaattg tagccgcgtt 3600

ctaacgacaa tatgtacaag cctaattgtg tagcatctgg cttactgaag cagaccctat 3660

catctctctc gtaaactgcc gtcagagtcg gtttggttgg acgaaccttc tgagtttctg 3720

gtaacgccgt cccgcacccg gaaatggtca gcgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 3780

catggctaat tcccatgtca gccgttaagt gttcctgtgt cactcaaaat tgctttgaga 3840

ggctctaagg gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt tgtccacaac cgttaaacct 3900

taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt tttttcttat aaaacttaaa accttagagg 3960

ctatttaagt tgctgattta tattaatttt attgttcaaa catgagagct tagtacgtga 4020

aacatgagag cttagtacgt tagccatgag agcttagtac gttagccatg agggtttagt 4080

tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag 4140

cttagtacgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcttca gatcctctac gccggacgca 4200

tcgtggccgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4260

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca ccaataactg 4320

ccttaaaaaa actagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag 4380

gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg 4440

ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 4500

tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 4560

cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 4620

acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 4680

cgggaaacgt cttgc 4695

Claims (11)

1.埃希氏菌属的重组微生物，所述重组微生物具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性和O-磷酸丝氨酸生产能力。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述NADH：醌氧化还原酶活性的增强是通过增加nuo操纵子的表达而实现的。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述NADH：醌氧化还原酶活性的增强包含在编码所述NADH：醌氧化还原酶的基因上游的具有增强活性的基因表达调控序列。

4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述编码所述NADH：醌氧化还原酶的基因上游是nuoA基因的上游。

5.根据权利要求1所述的微生物，其中磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性进一步减弱。

6.根据权利要求1所述的微生物，其中O-磷酸丝氨酸输出蛋白(YhhS)的活性进一步增强。

7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。

8.生产O-磷酸丝氨酸的方法，其包括：在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项所述的微生物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括从培养的培养基或微生物回收O-磷酸丝氨酸。

10.生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：

a)在培养基中培养具有增强的NADH：醌氧化还原酶活性的生产O-磷酸丝氨酸的微生物以生产O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基；以及

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达所述O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶的微生物存在下，使步骤a)中生产的O-磷酸丝氨酸或含有所述O-磷酸丝氨酸的培养基与硫化物反应。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述硫化物是选自Na₂S、NaSH、(NH₄)₂S、H₂S和Na₂S₂O₃中的至少一种。