KR20030056490A

KR20030056490A - 5'-크산틸산을 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR20030056490A
Application number: KR1020010086709A
Authority: KR
Inventors: 김정환; 곽영현; 박장희; 고은성; 오윤석; 장재영; 이광호; 심재익; 한종권; 박영훈
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2003-07-04
Also published as: CN1249221C; US20030148498A1; WO2003055986A1; AU2002323752B2; EP1323831A1; DE60211459D1; US6821768B2; EP1323831B1; JP2003199557A; ATE326543T1; CN1428417A; KR100429925B1; JP4017975B2

Abstract

본 발명은 5'-크산틸산을 생산하는 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 3,4-디하이드로프롤린 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743의 변이주 CJXPK001에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001은 삼투압조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)의 유사체인 3,4-디하이드로프롤린에 대해 내성을 나타내어 배양액에 축적된 고농도 용질로 인한 삼투압에 의한 영향을 받지 않기 때문에 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 생산할 수 있다.

Description

5'-크산틸산을 생산하는 미생물{Microorganism overproducing 5’-xanthylic acid}

본 발명은 5'-크산틸산을 생산하는 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 3,4-디하이드로프롤린 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743의 변이주 CJXPK001에 관한 것이다.

핵산(nucleic acid)은 주로 세포의 핵에 들어있는 물질로서, 쇠고기맛을 내는 이노신산(inosinic acid; inosinate; IMP)과 버섯맛을 내는 구아닐산(guanylic acid; guanylate; GMP) 등의 성분을 포함하고 있다. 이런 사실이 알려진 이후, 핵산을 식품 또는 약품분야의 원료로 사용하기 위해, 생선류, 오징어 등에서 핵산을 소량씩 추출해 내던 초기 단계를 거쳐, 대량생산하기 위한 방법이 개발되어 왔다. 그 중 상기 구아닐산을 생산하기 위한 방법으로 5'-크산틸산(5'-xanthylic acid; xanthylate; XMP)을 제조원료로 사용하는 방법이 가장 널리 사용되고 있다. 상기 5'-크산틸산은 퓨린 뉴클레오티드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로서, XMP-글루타민 아미도트랜스퍼라제(XMP-glutamine amidotransferase)에 의해 구아닐산으로 전환된다. 따라서, 5'-크산틸산을 생산하고, 이를 효소학적으로 5'-구아닐산으로 전환시킴으로써 5'-구아닐산을 제조하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 5'-구아닐산을 대량으로 생산하기 위해서는 그에 상당한 양의 5'-크산틸산이 필요하기 때문에 5'-크산틸산을 대량생산하기 위한 연구가 진행되고 있다.

종래 5'-크산틸산의 제조방법으로는 화학합성법, 효모 중의 리보핵산이 분해되어 제조된 5'-구아닐산을 탈아미노화하는 방법, 발효배지내 전구물질로 크산틴(xanthine)을 첨가하는 방법, 미생물 변이주를 이용한 제조방법, 항생물질 첨가에 의한 제조방법(일본특허 소 42-1477 및 소 44-20390) 및 계면활성제 첨가에 의한 제조방법(일본특허 소 42-3835 및 소 42-3838) 등이 알려져 있다. 이 중에서도 특히 미생물 변이주를 이용한 5'-크산틸산의 직접적인 발효 제조방법이 공업적으로 매우 유리하다. 이에 본 발명자들은 이노신산 및 구아닐산 등의 핵산 생산에 이용되는 산업용 미생물인 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 이용하여 5'-크산틸산을 고수율로 생산하려는 연구를 계속하던 중, 기존의 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743이 보유하고 있는 고유의 형질을 개량하여 5'-크산틸산의 생산성이 증가된 변이주를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 5'-크산틸산을 높은 수준으로 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3,4-디하이드로프롤린 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743의 변이주 CJXPK001을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

대부분의 미생물은 균체외부의 삼투압하에서 삼투적 탈수현상을 막기 위해 칼륨이온과 오스모라이트(osmolytes)라는 유기성 용질을 균체내부에 축적시킴으로써 균체내부의 삼투압을 증가시킨다. 상기 오스모라이트로는 프롤린(proline), 베타인(betaine) 및 카르니틴(carnitine)이 알려져 있으며(Beumer, R.R.,et al.,Appl. Environ. Microbiol.60:1359-1363, 1994), 그 중에서도 프롤린이 삼투압조절의 가장 중요한 인자로 알려져 있다. 또한 균체외부의 증가된 5'-크산틸산에 의한 삼투압조건에서 프롤린 생합성 경로의 중요한 효소인 피롤린-5-카르복실레이트 리덕테이즈(pyrroline-5-carboxylate reductase)의 활성이 증가되면서 균체내부에 프롤린이 축적됨이 브레비박테리움 락토퍼맨텀(Brevibacterium lactofermentum)을 통해 보고된 바 있으며(Yoshio K.et al.,Agr. Bio. Chem., 53(9):2475-2479, 1989), 대장균(E. coli), 살모넬라 티피머리움(Salmonella typhimurium) 및 세르라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 등에서 균체내부에 프롤린(L-proline)이 축적되고, 이는 외부삼투압에 의해 조절된다고 보고된 바 있다(V. J. Dunlapet al., J. Bacteriol.,163: 296, 1985). 따라서, 본 발명자들은 기존 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743에 프롤린(L-proline) 유사체에 대한 저항성을 부여하여 피드백 저해(feedback inhibition)에 의한 프롤린 합성 저해를 억제시킴으로써 프롤린 합성능력이 강화되고, 또한 이로 인해 미생물의 삼투압 내성형질이 강화되어 5'-크산틸산을 높은 수준으로 생산하는 변이주를 개발하였다.

구체적으로 본 발명에서는 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743을 친주로 하여 자외선조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이유발제를 통상적인 방법에 따라 처리한 후, 하기 표 1의 최소배지에 프롤린 유사체인 3,4-디하이드로프롤린(Sigma 사)을 0 내지 50㎎/ℓ의 농도별로 첨가하여 생육하는 변이주를 선별하였다. 그 중에서 3,4-디하이드로프롤린 30㎎/ℓ에서 생육하는 균주를 선별하여 CJXPK001이라 명명하였으며, 2001년 12월 7일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(기탁번호: KCCM 10340).

성 분	함 량
포도당	20g/ℓ
인산 제 1칼륨	1g/ℓ
인산 제 2칼륨	1g/ℓ
우레아	2g/ℓ
황산암모늄	3g/ℓ
황산마그네슘	1g/ℓ
염화칼슘	100㎎/ℓ
황산철	20㎎/ℓ
황산망간	10㎎/ℓ
황산아연	10㎎/ℓ
비오틴	30㎍/ℓ
티아민산염	0.1㎎/ℓ
황산구리	0.8㎎/ℓ
아데닌	20㎎/ℓ
구아닌	20㎎/ℓ
pH7.2

또한, 상기 표 1의 최소배지에 3,4-디하이드로프롤린을 0 내지 50㎎/ℓ의 농도별로 첨가하여 30℃에서 5일간 배양하면서 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001와 친주(KFCC 10743)의 생육도를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

균 주	3,4-디하이드로프롤린 농도(㎎/㎖)
균 주	0	5	10	20	30	40	50
친주(KFCC 10743)	+++	+	-	-	-	-	-
변이주(CJXPK001)	+++	+++	+++	++	+	-	-

+: 생육, -; 생육치 못함

상기 표 2에 기재된 바와 같이, 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743은 프롤린 유사체인 3,4-디하이드로프롤린 5㎎/ℓ에서는 내성이 있으나 10㎎/ℓ이상의 농도에서는 전혀 성장이 일어나지 않았다. 반면, 본 발명에 따른 변이주CJXP200101은 3,4-디하이드로프롤린 30㎎/ℓ까지 내성을 갖는 것을 볼 수 있었다.

본 발명에 따른 변이주 CJXPK001을 이용하여 5'-크산틸산을 생산하는 데 사용할 수 있는 발효배지로서는 공업적으로 값싼 당질원료(포도당, 과당 및 이를 성분으로 하는 다당류의 가수분해물), 질소원(유기 및 무기질소원) 및 미생물의 생육에 필요한 무기염, 미량 원소, 비타민 등을 적당히 첨가한 배지라면 모두 사용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

포도당 30g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ으로 구성된 종배지(pH 7.2) 5㎖를 지름 18mm의 시험관에 분주하고 가압살균한 후, 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001을 접종하여 180rpm, 30℃에서 18시간동안 진탕배양하였다(종배양). 이후, 발효배지로 본배지(포도당 60g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20㎎/ℓ, 황산아연 10㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 아데닌 30㎎/ℓ, 구아닌 30㎎/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 티아민염산염 5㎎/ℓ, 염화칼슘 10㎎/ℓ, pH 7.2) 및 별살배지(인산 제 1칼륨 10g/ℓ, 인산 제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ)를 각각 제조하여 가압살균한 다음, 미리 가압살균한500㎖ 용량의 진탕용 삼각플라스크에 각각 29㎖, 10㎖씩 분주한 후 상기 종배양액 1㎖을 접종한 후 200rpm, 30℃에서 90시간 배양하였다. 이후, 배양이 완료된 배양액 내의 5'-크산틸산의 축적량을 측정하여 하기 표 3에 기재하였다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨·7H₂O로 표시함).

<비교예 1>

균주로 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였으며, 배양이 완료된 배양액 내의 5'-크산틸산의 축적량을 측정하여 하기 표 3에 기재하였다.

	변이주 CJXPK001	친주 KFCC 10743
5'-크산틸산 양(g/ℓ)	26.1	23.1

상기 표 3에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001(실시예 1)의 5'-크산틸산 생산량이 친주 KFCC 10743(비교예 1)에 비해 약 13% 향상되었음을 볼 수 있다.

<실시예 2>

상기 실시예 1에서의 종배지 50㎖를 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에분주하고 가압살균한 후 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001을 접종하여 180rpm, 30℃에서 24시간 진탕배양하였다(1차 종배양). 이후 2차 종배지(포도당 60 g/ℓ, 인산 제 1칼륨 2g/ℓ, 인산 제 2칼륨 2g/ℓ, 황산마그네슘 1g/ℓ, 황산철 22㎎/ℓ, 황산아연 15㎎/ℓ, 황산망간 10㎎/ℓ, 황산구리 1㎎/ℓ, 염화칼슘 100㎎/ℓ, 비오틴 150㎍/ℓ, 아데닌 150㎎/ℓ, 구아닌 150㎎/ℓ, 티아민산염 5㎎/ℓ, 소포제 0.6㎖/ℓ, pH 7.2)를 5ℓ용량의 실험용 발효조에 2ℓ씩 분주하여 가압살균한 다음, 상기 1차 종배양액을 50㎖를 접종한 후, 공기를 0.5vvm으로 공급하면서 900rpm, 31℃에서 24시간 배양하였다. 또한 암모니아수로 배양액의 pH를 7.3으로 조절하면서 배양하였다(2차 종배양).

이후, 발효배지(포도당 151g/ℓ, 인산 32g/ℓ, 수산화칼륨 25g/ℓ, 아데닌 198㎎/ℓ, 구아닌 119㎎/ℓ, 황산철 60㎎/ℓ, 황산아연 42㎎/ℓ, 황산망간 15㎎/ℓ, 황산구리 2.4㎎/ℓ, 알라니염 22㎎/ℓ, NCA 7.5㎎/ℓ, 비오틴 0.4㎎/ℓ, 황산마그네슘 15g/ℓ, 시스틴염 30㎎/ℓ, 히스티딘염 30㎎/ℓ, 염화칼슘 149㎎/ℓ, 티아민염 15㎎/ℓ, 소포제 0.7㎖/ℓ, CSL 27㎖/ℓ, 참치엑기스 6g/ℓ, pH7.3)를 30ℓ 용량의 실험용 발효조에 8ℓ씩 분주하고 가압살균한 후 상기 2차 종배양액을 1.5ℓ씩 접종한 후, 공기를 1vvm으로 공급하면서 400rpm, 33℃에서 배양하였다. 이 때 배양 중 잔존 당농도가 1% 이하가 되면 살균된 포도당을 공급하여 발효배지 내의 총당함량을 30%로 조절하였으며, 배양 중 암모니아수로 배지의 pH 7.3로 조절하여 90시간 배양하였다. 이후, 배양이 완료된 배양액 내의 5'-크산틸산의 축적량을 측정하여 하기 표 4에 기재하였다(5'-크산틸산의 축적농도는 5'-크산틸산나트륨·7H₂O로 표시함).

<비교예 2>

균주로 친주인 코리네박테리움 암모니아게네스 KFCC 10743를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하였으며, 배양이 완료된 배양액 내의 5'-크산틸산의 축적량을 측정하여 하기 표 4에 기재하였다.

	변이주 CJXPK001	친주 KFCC 10743
5'-크산틸산 양(g/ℓ)	143.5	124.7

상기 표 4에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주 CJXPK001(실시예 2)의 5'-크산틸산 생산량이 친주 KFCC 10743(비교예 2)에 비해 약 15.1% 향상되었음을 볼 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 CJXPK001은 삼투압조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)의 유사체인 3,4-디하이드로프롤린에 대해 내성을 가짐으로써 배양액에 축적된 고농도 용질로 인한 삼투압에 의한 영향을 받지않기 때문에 5'-크산틸산을 고수율, 고농도로 생산할 수 있다.

Claims

3,4-디하이드로프롤린(3,4-dehydro-DL-proline) 내성을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KFCC 10743의 변이주로서 3,4-디하이드로프롤린 30㎎/ℓ이하의 농도에서 생육하며, 5'-크산틸산을 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물 CJXPK001(기탁번호: KCCM 10340).